Uso de un péptido antigénico aislado derivado de la proteína S100-beta no unido a una molécula MHC de clase II en la prevención, tratamiento, diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes tipo I.
Campo de la invención La presente invención se refiere a un péptido antigénico derivado de la proteína S100-beta, así como al procedimiento para su identificación y a su utilización en la prevención, tratamiento, diagnóstico o seguimiento de la diabetes tipo I.
Estado de la técnica
La diabetes tipo I (T1D) humana es una enfermedad autoinmune caracterizada clínicamente por la falta de regulación de los niveles de glucosa y que a medio-largo plazo provoca complicaciones neurológicas y vasculares. La T1D es una de las enfermedades autoinmunes más frecuentes entre la población caucásica. Tan sólo en España, se diagnostican cada año entre 10-20 nuevos casos cada 100.000 niños menores de 14 años, prevalencia que va en aumento, de lo que se deduce que 1 de cada 1.000 niños en esa edad es diabético, de modo que hay unos 10.000 niños diabéticos en nuestro país.
La T1D se caracteriza por una deficiencia de insulina, haciendo que los pacientes dependan de inyecciones diarias de insulina exógena para su supervivencia. Antes de la aparición de síntomas clínicos como la hiperglicemia, existe un periodo preclínico asintomático donde las células productoras de insulina son destruidas de forma progresiva. La destrucción de estas células productoras de insulina, las células beta presentes en los llamados islotes de Langerhans pancreáticos, está asociada a la infiltración de dichos islotes por linfocitos y otras células del sistema inmunológico del paciente. Estas células responden contra proteínas propias expresadas por las células beta, como por ejemplo la propia insulina o su precursor la pre-proinsulina.
Los islotes de Langerhans, donde se encuentran las células productoras de insulina, forman una estructura diferenciada dentro del tejido pancreático y se encuentran rodeados por una capa de células de tipo nervioso llamadas células periféricas de Schwann (pSC) (“peri islet Schwann cells”) cuyas funciones no están claras pero que sí expresan un conjunto de proteínas o antígenos que las diferencia claramente de las células que componen los islotes pancreáticos, entre ellas las células beta. En el modelo murino de la T1D humana, el ratón NOD (“Non-Obese Diabetic mice”) , que desarrolla un síndrome metabólico que comparte muchas características con la T1D humana como son la hiperglicemia y la deficiencia de insulina, estas células pSC son destruidas por linfocitos del sistema inmune del animal. Algunos de estos linfocitos responden contra antígenos expresados de forma exclusiva en estas células pSC como son la proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP) o el factor neurotrópico S100-beta. En pacientes humanos con T1D se ha demostrado la presencia de autoanticuerpos dirigidos contra GFAP y S100-beta así como linfocitos autoreactivos específicos para estas dos proteínas, lo que indica que en esos pacientes las células pSC de los islotes han sido también destruidas por el sistema inmunológico. En el ratón NOD también se ha demostrado que la infiltración linfocitaria de los islotes comienza con la denominada infiltración periférica de los islotes (“peri-islet infiltration”) durante la cual se produce la destrucción del manto de células pSC que rodea los islotes propiamente dichos. A continuación y una vez que este manto ha sido destruido, los linfocitos pueden acceder a los islotes, donde destruyen de forma selectiva las células beta productoras de insulina.
El hecho de que las células pSC parecen ser el objetivo inicial de la respuesta autoinmune contra los islotes pancreáticos y que su ralentización, regulación y/o detención absoluta permitiría mantener intactos los islotes pancreáticos, unido al dato de que hoy en día no existe ninguna terapia que permita tratar la T1D humana, señalan la importancia de descubrir nuevos métodos y/o moléculas que permitan tratar la enfermedad en momentos que permitan conservar el mayor número de islotes intactos y durante el mayor tiempo posible.
Existe una gran experiencia previa que demuestra que los linfocitos CD4+ están implicados en el desarrollo de la T1D. Análisis histológicos de islotes obtenidos de individuos afectados muestran infiltraciones por parte de linfocitos CD4+. En modelos animales de la T1D la enfermedad puede ser transferida a un animal sano usando linfocitos CD4+ de un animal enfermo. Además, existe una asociación genética entre el desarrollo de la T1D y ciertas moléculas del sistema mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II, críticas para que los linfocitos CD4+ puedan desarrollarse y ser estimulados contra su objetivo. Finalmente, es posible detectar la presencia de linfocitos CD4+ activados en sangre periférica de individuos que han desarrollado la enfermedad.
Existe un creciente interés por definir los segmentos de las proteínas, denominados epítopos peptídicos, reconocidos por los linfocitos CD4+ implicados en la respuesta autoinmune contra las células pSC. La identificación de estos epítopos es importante para comprender los mecanismos que desencadenan la enfermedad, para el desarrollo de ensayos de laboratorio que permitan seguir el daño a los islotes y para diseñar terapias que permitan ralentizar o detener la enfermedad.
Los epítopos peptídicos derivados de antígenos exógenos son presentados a linfocitos T CD4+ después de una ES 2 394 331 A1
serie de eventos moleculares denominados en su conjunto como procesamiento y presentación natural. Para ello, los antígenos o proteínas exógenas son captados por células del sistema inmune denominadas células presentadoras de antígeno (APC) . Una vez internalizado, el antígeno correspondiente es fragmentado mediante la combinación de diversos procesos químicos y enzimáticos, generando péptidos que se unen a moléculas MHC de clase II que son exportadas a la superficie de la célula presentadora de antígeno. El procesamiento y presentación natural de antígenos exógenos da lugar a grupos solapantes de péptidos (Figura 1) que se unen a la molécula MHC de clase II mediante el mismo “motivo de unión” pero que poseen diferentes extremos amino y carboxilo. Los aminoácidos de ambos extremos, aunque no forman parte del motivo de unión a la molécula de histocompatibilidad, pueden tener importantes efectos tanto sobre la afinidad de unión a la molécula de histocompatibilidad como en la activación de clones de linfocitos T CD4+.
En modelos animales como el ratón NOD, se ha demostrado que las APC captan proteínas del páncreas y las llevan a nódulos linfáticos que drenan este órgano para estimular allí linfocitos autoreactivos que reconocen péptidos derivados de estas proteínas y unidos a moléculas MHC específicas. Una vez estimulados, estos linfocitos autoreactivos se dirigen al páncreas, donde proceden a eliminar aquellas células que expresen el antígeno del cual ha derivado ese epítopo peptídico. Aunque se sabe que la proteína S100-beta es un objetivo del proceso autoinmune en la T1D humana a partir de estudios que demuestran la presencia de autoanticuerpos y linfocitos autoreactivos contra la proteína completa en pacientes diabéticos, por el momento no existen datos acerca de los epítopos peptídicos generados a partir de esta proteína y que sean reconocidos por linfocitos CD4+ en pacientes con T1D.
Los epítopos peptídicos generados in vivo por una APC a partir de una proteína exógena y capaces de estimular a un linfocito CD4+ consisten, por tanto, en varios péptidos de una longitud variable pero que comparten una zona común. Esta zona común o secuencia aminoacídica común contiene los aminoácidos que determinan el llamado “motivo de unión” a la molécula MHC concreta, o lo que es lo mismo, los aminoácidos que permiten anclar dicho péptido a la molécula MHC. Este conjunto de péptidos derivados de una zona concreta de la proteína y que comparten una zona común forman un conjunto de péptidos solapantes (Figura 1) , a partir del cual se podría sintetizar un epítopo peptídico consenso que incluya esa zona común y que incluya aminoácidos de los extremos de alguno o todos los epítopos peptídicos generados a partir de esa zona de la proteína.
Distintos métodos han sido empleados para intentar identificar epítopos peptídicos presentados por moléculas MHC de clase II y reconocidos por linfocitos T CD4+. Las siguientes aproximaciones experimentales se encuentran entre las empleadas habitualmente:
1. Predicción “in silico”. Las moléculas MHC de clase II se tienden a unir a péptidos que presentan determinados aminoácidos en posiciones concretas de la secuencia lineal, los denominados “motivos de unión” citados anteriormente. Existen aplicaciones informáticas disponibles que permiten buscar en una proteína segmentos de la secuencia lineal de aminoácidos que posean ese “motivo de unión” y que tengan, por tanto, posibilidades teóricas de ser presentados a linfocitos T CD4+. Sin embargo, esta aproximación presenta una serie de inconvenientes a la hora de identificar epítopos peptídicos unidos a moléculas MHC de clase II. En primer lugar, no proporciona ninguna información acerca de si dicho péptido va a ser realmente generado in vivo en una APC. En segundo lugar, a partir de una proteína se pueden generar muchos péptidos que tengan posibilidades de unión a una molécula MHC de clase II, generando muchos falsos positivos. En tercer lugar, la longitud de dichos epítopos peptídicos es variable, de forma que aunque se identifique un “motivo de unión”, no se conoce la longitud del péptido generado in vivo en una APC.
2. Generación de linfocitos T CD4+. Esta aproximación supone el clonaje de linfocitos T CD4+ que respondan contra la proteína y mediante el empleo de péptidos sintéticos solapantes entre sí, tratar de identificar cuál es el/los epítopo (s) contra el cual reacciona. Esta técnica presenta también determinados inconvenientes, entre los que se pueden citar: a) los péptidos sintetizados in vitro de nuevo no tienen por qué coincidir con el epítopo generado in vivo, y b) es una técnica que ha demostrado tener éxito en aquellas situaciones donde existe un número elevado de linfocitos T CD4+ específicos para dicho antígeno, como puede ser el caso de una infección viral aguda, pero es mucho más difícil a nivel metodológico en autoinmunidad o en cáncer, donde el número de linfocitos T CD4+ específicos para un epítopo concreto es muchísimo más bajo.
3. Procesamiento de la proteína in vitro. Se conocen toda una serie de enzimas (proteasas) capaces de digerir proteínas y generar péptidos capaces de unirse a moléculas MHC de clase II. Sin embargo, el número de estas enzimas que interviene en este proceso o su orden de intervención in vivo en una APC sobre un antígeno o proteína concreta no se conocen con exactitud y hace que sea muy difícil reproducir este proceso in vitro.
4. Síntesis de péptidos solapantes. Otra aproximación experimental habitual a la hora de tratar de identificar péptidos capaces de estimular linfocitos T CD4+ consiste en la síntesis de una librería de péptidos solapantes (Figura 2) en la cual los péptidos poseen una longitud concreta, solapan entre sí y cubren toda la longitud de la proteína. Una vez sintetizados, estos péptidos se emplean como antígenos para estimular linfocitos T CD4+. Esta aproximación, sin embargo, no identifica los epítopos peptídicos procesados y presentados de forma natural, ya que no determina cuáles son los extremos reales de los péptidos generados en la célula y que pueden influir de forma
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significativa en el reconocimiento del epítopo por parte de linfocitos T CD4+. Además, la respuesta de linfocitos T CD4+ contra alguno de estos péptidos solapantes no garantiza que dicho linfocito T CD4+ reconozca al epítopo natural generado por una APC in vivo.
Por tanto, no existe hasta la fecha ningún estudio científico en humanos que haya identificado péptidos antigénicos derivados de S100-beta, generados in vivo por una célula y que se encuentren unidos posteriormente a una molécula MHC de clase II como la molécula DRB1*0401 (DR4) .
Los linfocitos humanos no responden contra la proteína completa sino contra segmentos (péptidos o epítopos peptídicos) generados a partir de ella; sin embargo, la determinación de dichos segmentos no es obvia, ni puede determinarse de la simple lectura de la secuencia de aminoácidos de la proteína o de la generación de librerías de fragmentos arbitrarios de la proteína.
La publicación de Winer S. et al. (Nature Medicine, Vol. 9 (2) : 198-205 (2003) ) sugiere el tratamiento con S100-beta para diabetes, pero emplea la proteína completa y no epítopos peptídicos concretos. Sin embargo, tal y como se ha mencionado en el párrafo anterior, los linfocitos de un paciente diabético no responden contra la proteína completa sino contra péptidos o epítopos peptídicos que deben ser generados a partir de ella y, de nuevo, la determinación de dichos segmentos no es trivial ni puede determinarse de la simple lectura de la secuencia de aminoácidos de la proteína.
Los péptidos derivados de S100-beta descritos hasta la fecha se basan en meras fragmentaciones de la proteína en segmentos de una longitud arbitraria y la determinación de la presencia de anticuerpos contra dichos fragmentos. La solicitud de patente WO9801471, por ejemplo, describe epítopos que se utilizan para generar anticuerpos monoclonales en ratones, de modo que estos anticuerpos permitan posteriormente determinar la presencia del polipéptido S100-beta humano en suero de pacientes con melanoma. Para ello, en este documento se sintetizan péptidos de S100-beta, decidiendo de forma arbitraria la longitud de los mismos con la intención de identificar aquellos más útiles para determinar la presencia del polipéptido S100-beta humano en una muestra, pero no aquellos capaces de generar una respuesta inmune in vivo. Tal y como se expuso anteriormente, es imposible predecir estudiando únicamente la secuencia de aminoácidos de una proteína cuál o cuáles van a ser los epítopos peptídicos capaces de generar una respuesta inmune in vivo, esto es, que sean generados por una célula presentadora de antígeno, se unan a una molécula MHC de clase II y sean presentados en la superficie de dicha célula para que el conjunto molécula MHC-péptido desempeñe su función (por ejemplo, activar la respuesta inmunológica contra dicha proteína o generar una respuesta moduladora que reduzca o elimine dicha respuesta inmune contra la proteína) . Esta imposibilidad deriva, en parte, de que las moléculas MHC de clase II presentan una hendidura en la que encajan segmentos más o menos grandes de una proteína (por ejemplo, S100-beta) , segmento que luego es “limado o recortado” por ambos extremos por enzimas proteolíticas presentes en el interior celular. Sin embargo, el número, orden de actuación sobre el péptido (si es que dicho orden existe) y si sobre cada proteína particular actúa un grupo concreto y específico de estas enzimas, no se conoce con exactitud a día de hoy. Por esta razón, una célula presentadora de antígeno no genera un solo epítopo peptídico (péptido, subfragmento) de una región de una proteína sino que genera varios epítopos de la misma región que pueden agruparse en “grupos solapantes”, mencionados anteriormente (Figura 1) . Los epítopos peptídicos de un “grupo solapante” comparten un mismo “núcleo común”, que interacciona directamente con la hendidura de la molécula de histocompatibilidad correspondiente, y unos extremos variables, imposibles de predecir y que son generados, como se ha mencionado, por la acción de una o varias proteasas en el interior celular. En la solicitud de patente WO9801471, se fabrica una librería de péptidos segmentando S100-beta en fragmentos arbitrarios de 31 aminoácidos, proporcionándose dos fragmentos obtenidos a partir de dicha librería (SEQ. ID. NO. 4 y 6 en WO9801471; ver Figura 18 para homología con las secuencias de la presente invención) , en base a las cuales se proponen subfragmentos (SEQ. ID. NO. 5 en WO9801471) o fragmentos mayores abarcando a esas secuencias (SEQ. ID. NO. 2 y 3 en WO9801471; ver Figura 18 para homología con las secuencias de la presente invención) , de forma totalmente arbitraria, pero sin determinar su inmunogenicidad. Por tanto, WO9801471 proporciona fragmentos arbitrarios de S100-beta que sirven para determinar la presencia de anticuerpos contra esta proteína en una muestra de pacientes con melanoma, pero ni determina qué partes de la proteína son las que realmente intervienen en la respuesta inmune en un sujeto, ni proporciona información acerca de la implicación de dichos péptidos en la respuesta inmune ante la T1D, por lo que es necesario identificar aquellos péptidos derivados de S100-beta que desencadenan dicha respuesta, de modo que sea posible desarrollar sistemas de diagnóstico y tratamiento de la T1D mucho más sensibles y precisos.
El documento Tsui H. et al. (Diabetes, Vol. 57: 918-928 (2008) ) identifica epítopos de GFAP y realiza un tratamiento de inmunoterapia que inhibe significativamente la diabetes tipo I, remarcando la importancia de la identificación de los epítopos en el desarrollo de tetrámeros. Los tetrámeros hechos in vitro empleando una molécula de histocompatibilidad y un péptido no son equivalentes unos con otros porque sirven para detectar grupos de células inmunes que pueden tener papeles completamente diferentes dentro de una misma patología, de forma que aunque existiesen tetrámeros hechos con una molécula de histocompatibilidad determinada y péptidos derivados de GFAP, tetrámeros fabricados empleando péptidos derivados de S100-beta detectarían linfocitos con funciones completamente diferentes a los linfocitos que detectarían los tetrámeros fabricados con péptidos derivados de GFAP (Figura 3) . En este documento, se predicen epítopos peptídicos de GFAP mediante el uso de un algoritmo, obteniendo distintos epítopos (posiciones aminoacídicas 79-87 y 253-261 en GFAP) , que son luego empleados para ES 2 394 331 A1
inmunizar ratones. De ellos, tan sólo uno de los epítopos peptídicos (79-87) pero no el otro (253-261) produce una inhibición de la diabetes tipo I, a pesar de que ambos han sido generados de la misma forma. Por tanto, a pesar de que describe el uso de uno de los múltiples algoritmos empleados en la predicción de epítopos peptídicos, éste no proporciona epítopos útiles para generar una respuesta inmune ya que algunos de los epítopos predichos no funcionan. Este documento también menciona que no existen algoritmos para predecir epítopos unidos a una de las moléculas MHC de clase II que posee el modelo animal empleado en los experimentos descritos, lo que supone un problema en la identificación de epítopos peptídicos empleando este método. Además, aunque se predicen epítopos peptídicos para ambas clases de MHC (de clase II mediante librerías y de clase I mediante algoritmos) , sólo se presentan resultados positivos in vivo al inmunizar ratones con epítopos peptídicos unidos a moléculas MHC de clase I, pero no con aquellos unidos a moléculas MHC de clase II, lo que pone de manifiesto la dificultad que implica la predicción u obtención de epítopos peptídicos específicos presentados por moléculas MHC de clase II.
Por último, la solicitud de patente US 2003/0054414 A1 también utiliza para el diagnóstico y el tratamiento de diabetes tipo I la proteína GFAP, pero tampoco identifica epítopos peptídicos específicos derivados de la proteína S100-beta que sean presentados a linfocitos CD4+ y que generen una respuesta inmune por parte de dichos linfocitos.
Por tanto, se necesita identificar aquellos epítopos peptídicos específicos de la proteína S100-beta que realmente intervengan en la respuesta inmune in vivo que tiene lugar en la diabetes tipo I y que sean potencialmente útiles en la prevención, diagnóstico, seguimiento y tratamiento de esta patología.
Descripción resumida de la invención Los presentes inventores han identificado específicamente los péptidos antigénicos (también denominados en la presente invención como epítopos peptídicos) generados in vivo después de que S100-beta sea procesada por una célula presentadora de antígeno (APC) y que están presentes en la superficie de dichas APC unidos a una molécula MHC de clase II, , aislándose los péptidos que realmente intervienen en la respuesta inmune in vivo. Por tanto, la presente invención proporciona los fragmentos específicos de la proteína S100-beta que son generados durante una respuesta inmune y que son capaces de activar a linfocitos, identificando por tanto qué epítopos peptídicos específicos son los que pueden emplearse para la prevención, el tratamiento, el diagnóstico y el seguimiento de la diabetes tipo I.
La presente invención también se refiere a un procedimiento para la obtención de dicho péptido antigénico.
La presente invención también se refiere a la utilización de dicho péptido antigénico en sistemas de diagnóstico de la diabetes tipo I y en la fabricación de un medicamento para la prevención, seguimiento, diagnóstico y/o tratamiento de la diabetes tipo I.
Adicionalmente, los presentes inventores también han observado que cuando el péptido antigénico de la presente invención no se encuentra unido a la MHC de clase II, dicho péptido es útil en la fabricación de un medicamento para la prevención, seguimiento, diagnóstico y/o tratamiento de la diabetes tipo I.
Breve descripción de las figuras Figura 1. Grupos solapantes de péptidos resultantes del procesamiento intracelular de antígenos exógenos. Las moléculas de histocompatibilidad de clase II presentan en la superficie celular péptidos derivados de una misma región del antígeno, que poseen en común un grupo de aminoácidos que interaccionan directamente con aminoácidos de la molécula de histocompatibilidad (“motivo de unión”) (aminoácidos dentro del recuadro) pero que poseen distintos extremos amino-y/o carboxi-terminal.
Figura 2. Librerías de péptidos solapantes. Consisten en la síntesis de péptidos de una longitud determinada e idéntica para todos, los cuales solapan entre sí en un número concreto de aminoácidos y que cubren la longitud completa del antígeno. Se muestra en la figura una librería compuesta por cuatro péptidos de 15 aminoácidos de longitud solapantes entre sí en 12 aminoácidos y que cubren toda la secuencia de aminoácidos de la proteína (secuencia superior) .
Figura 3. Tetrámeros MHC hechos con péptidos diferentes son reconocidos por linfocitos T diferentes. Un tetrámero MHC hecho con una molécula MHC concreta (1) pero conteniendo péptidos diferentes (2, cuadrados o círculos) son reactivos que detectan de forma específica linfocitos T diferentes (3) , los cuales pueden tener funciones opuestas en una patología. Además, los tetrámeros MHC pueden llevar acoplados otros componentes como nanopartículas magnéticas, para la detección de linfocitos in vivo, o toxinas para la eliminación específica de aquellos linfocitos autoreactivos que reconozcan el complejo MHC-péptido, como aquellos que reconozcan tetrámeros conteniendo péptidos derivados de S100-beta. Además, estos tetrámeros MHC pueden ser conjugados a otras moléculas o compuestos para generar nuevos reactivos de diagnóstico (por ejemplo, unidos a nanopartículas magnéticas) o de tratamiento de la enfermedad (por ejemplo, unidos a citocinas o toxinas) .
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Figura 4. Esquema general de la metodología ELISPOT. En este análisis, placas de cultivo celular son recubiertas con un anticuerpo específico para la citocina que se quiere detectar (1) . Una vez que los linfocitos T han sido activados empleando el antígeno correspondiente, se añaden a la placa recubierta de anticuerpo anti-citocina de forma que en aquellos lugares donde exista un linfocito T específico y estimulado por el antígeno quedará capturada la citocina que se quiere detectar (2, célula oscura) . Eliminadas las células, se añade un segundo anticuerpo de detección acoplado a una enzima de forma que al añadir un sustrato se genera un color en el lugar donde se encontraba la célula específica de antígeno y productora de la citocina que se quiere detectar (3) . La presencia de dicha célula se ve como una mancha (“spot”) en la placa (4) , de forma que cada spot representa una célula específica para el antígeno empleado en la estimulación.
Figura 5. Sistema empleado en la internalización de S100-beta en células Priess. La línea linfoblastoide Priess (1) fue incubada de forma secuencial con una lectina obtenida de Phytolacca americana (2) biotinilada in vitro (biotina = círculos negros) , con avidina (3) y finalmente con S100-beta purificada y biotinilada in vitro (4) (biotina = círculos negros) . Una vez finalizada la incubación con S100-beta, las células se incubaron a 37ºC para que pudiesen internalizar y procesar el antígeno y presentar epítopos peptídicos en la superficie celular unidos a moléculas del MHC DR4 (5) . Las células empleadas como control fueron incubadas con todos los elementos excepto S100-beta.
Figura 6. Fraccionamiento por cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) de los péptidos presentes en moléculas MHC de clase II DR4 en células Priess incubadas o no con S100-beta. Los péptidos obtenidos a partir de células Priess incubadas con S100-beta (cromatograma superior) o células Priess sin incubar con S100-beta (cromatograma inferior) fueron fraccionados mediante HPLC en columna de fase reversa C18 recogiéndose fracciones cada 30 segundos aproximadamente. Cada fracción fue analizada posteriormente mediante espectrometría de masas. mAU: unidades de absorbancia.
Figura 7. Grupos de epítopos peptídicos solapantes derivados de S100-beta identificados mediante espectrometría de masas (MS) . Después de comparar los espectros MS de cada una de las fracciones obtenidas en el HPLC de péptidos obtenidos de células incubadas con S100-beta con su correspondiente fracción de células Priess control (sin incubar con S100-beta) se identificaron 9 masas únicas correspondientes con 3 grupos de péptidos solapantes (grupos A-C) después de la búsqueda de la secuencia de aminoácidos en Findpept (http://expasy.org/tools/findpept.html) .
Figura 8. Epítopos peptídicos consenso de S100-beta sintetizados con la información obtenida de los tres grupos solapantes identificados por espectrometría de masas (MS) . Los epítopos consenso sintetizados contienen al menos un motivo de unión a la molécula de histocompatibilidad de clase II DR4. Tal y como se demuestra en los ejemplos de la presente invención, estos péptidos consenso pueden ser empleados en la identificación in vitro de linfocitos T CD4+ autoreactivos en pacientes diabéticos.
Figura 9. Resultados de ELISPOT para IL-10 de un individuo sano no diabético. Se muestra una fotografía de los resultados de síntesis de IL-10 obtenidos de un individuo sano cuyos linfocitos han sido incubados con dimetil sulfóxido (DMSO, disolvente empleado en la disolución de los péptidos) (fila superior) ; el péptido EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT (SEQ ID NO: 17) derivado de una proteína de Plasmodium falciparum (Pf, empleado como control negativo) (segunda fila) ; forbol 12-miristato 13-acetato (PMA, empleado como control positivo) (tercera fila) y el epítopo peptídico consenso S100-beta 68-92 (SEQ ID NO: 15) (última fila) . Se detecta algún “spot” en aquellas células incubadas con PMA y una enorme cantidad de “spots” en aquellas células incubadas en presencia del epítopo peptídico consenso.
Figura 10. Secuencias de aminoácidos de los epítopos peptídicos correspondientes a la Región 1 de S100-beta y de la librería de péptidos solapantes de 15 aminoácidos de longitud sintetizados a partir del epítopo peptídico consenso SEQ ID NO: 12.
Figura 11. Resultados de los ensayos de unión a la molécula de clase II DR4 del epítopo peptídico consenso SEQ ID NO: 12 y de los epítopos peptídicos de la Región 1 de S100-beta. Para cada péptido se muestra la unión a 0 horas de ensayo (columnas en blanco) y la cantidad de péptido que permanece unido a la molécula DR4 después de 24 horas de incubación a 37ºC (parte negra de las columnas) . Como comparación se muestran los resultados de unión de un epítopo con alta afinidad (control positivo) y de afinidad intermedia (control intermedio) .
Figura 12. Secuencias de aminoácidos de los epítopos peptídicos correspondientes a la Región 3 de S100-beta y de la librería de péptidos solapantes de 15 aminoácidos de longitud sintetizados a partir del epítopo peptídico consenso SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14.
Figura 13. Resultados de los ensayos de unión a la molécula de clase II DR4 del epítopo peptídico consenso SEQ ID NO: 13 y de los epítopos peptídicos de la Región 3 de S100-beta. Para cada péptido se muestra la unión a 0 horas de ensayo (columnas en blanco) y la cantidad de péptido que permanece unido a la molécula DR4 después de 24 horas de incubación a 37ºC (parte negra de las columnas) . Como comparación se muestran los resultados de unión de un epítopo con alta afinidad (control positivo) y de afinidad intermedia (control intermedio) .
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Figura 14. Resultados de los ensayos de unión a la molécula de clase II DR4 del epítopo peptídico consenso SEQ ID NO: 14 y de los epítopos peptídicos de la Región 3 de S100-beta. Para cada péptido se muestra la unión a 0 horas de ensayo (columnas en blanco) y la cantidad de péptido que permanece unido a la molécula DR4 después de 24 horas de incubación a 37ºC (parte negra de las columnas) . Como comparación se muestran los resultados de unión de un epítopo con alta afinidad (control positivo) y de afinidad intermedia (control intermedio) .
Figura 15. Secuencias de aminoácidos de los epítopos peptídicos correspondientes a la Región 2 de S100-beta y de la librería de péptidos solapantes de 15 aminoácidos de longitud sintetizados a partir del epítopo peptídico consenso SEQ ID NO: 15.
Figura 16. Resultados de los ensayos de unión a la molécula de clase II DR4 del epítopo peptídico consenso SEQ ID NO: 15 y de los epítopos peptídicos de la Región 2 de S100-beta. Para cada péptido se muestra la unión a 0 horas de ensayo (columnas en blanco) y la cantidad de péptido que permanece unido a la molécula DR4 después de 24 horas de incubación a 37ºC (parte negra de las columnas) . Como comparación se muestran los resultados de unión de un epítopo con alta afinidad (control positivo) y de afinidad intermedia (control intermedio) .
Figura 17. Se muestra una Tabla que hace referencia a las homologías con respecto a los epítopos descritos en la presente invención, de secuencias conteniendo cambios en 1, 2 ó 3 aminoácidos. El asterisco (*) indicado en el encabezamiento de las columnas cuarta a sexta indica que se ha calculado como el nº de aminoácidos idénticos/nº de aminoácidos totales * 100.
Figura 18. Se muestra una Tabla que hace referencia a homologías de las secuencias de la presente invención con las secuencias del documento WO 98101471.
Descripción de la invención Los presentes inventores han identificado específicamente los péptidos antigénicos (también denominados en la presente invención como epítopos peptídicos) generados in vivo después de que S100-beta sea procesada por una célula presentadora de antígeno (APC) y que están presentes en la superficie de dichas APC unidos a una molécula MHC de clase II, aislándose los péptidos que realmente intervienen en la respuesta inmune in vivo. Por tanto, la presente invención proporciona los fragmentos específicos de la proteína S100-beta que son generados durante una respuesta inmune y que son capaces de activar a linfocitos, identificando por tanto qué epítopos peptídicos específicos son los que pueden emplearse para la prevención, el tratamiento, el diagnóstico y el seguimiento de la diabetes tipo I.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido antigénico (epítopo peptídico) aislado y derivado de la proteína S100-beta, donde dicho péptido se encuentra unido a una molécula MHC de clase II.
En la presente invención por “péptido antigénico” se entiende una secuencia lineal de aminoácidos presente en la hendidura de una molécula de histocompatibilidad y que posee por tanto capacidad de comportarse como un antígeno.
En la presente invención por “MHC de clase II” se entiende una molécula de histocompatibilidad formada por dos cadenas a (alfa) y 1 (beta) presentes en la superficie celular, la cual presenta una hendidura capaz de alojar un péptido antigénico.
En una realización preferida, dicho péptido se localiza en la región 1 de la proteína S100-beta, y comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
En otra realización preferida, dicho péptido se localiza en la región 2 de la proteína S100-beta, y comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7.
En otra realización preferida, dicho péptido se localiza en la región 3 de la proteína S100-beta, y comprende cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 11.
Se entiende por región 1 de la proteína S100-beta a la comprendida entre los aminoácidos 2 y 25, por región 2 a la comprendida entre los aminoácidos 60-92 y a la región 3 a la comprendida entre los aminoácidos 19-46 de la proteína S100-beta (la secuencia de la proteína S100-beta está disponible en el número de acceso NP_06263 de la base de datos de proteínas NCBI) , ambos extremos incluidos.
En otra realización preferida, dicho péptido es un péptido consenso para cada una de las regiones 1, 2 y 3, seleccionado del grupo que comprende:
a) péptido de secuencia SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, b) péptido que al menos muestra un 80% de homología con los péptidos descritos en a) .
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Preferiblemente, la homología del péptido con los péptidos descritos en a) es del 85%, más preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95%, y aún más preferiblemente es del 98%.
En la presente invención por “péptido consenso” se entiende una secuencia lineal de aminoácidos que solapa con las secuencias de aminoácidos de los péptidos identificados de una región de S100-beta y que posee al menos una posible región de unión a moléculas MHC de clase II.
En una realización más preferida, la molécula MHC de clase II unida al péptido según cualquiera de las realizaciones anteriores es DR4.
En la presente invención se entiende como moléculas MHC de clase II DR4 a la formada por las cadenas a y 1 codificadas por los alelos DRA1*0101 y DRB1*0401 respectivamente.
En la presente invención, por “homología” se entiende el porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos de las secuencias de péptidos SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, después de alinear las secuencias e introducir los espacios que sean necesarios para conseguir el máximo porcentaje de identidad con dichas secuencias. Los péptidos que mantienen al menos un 80% de homología con las secuencias SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, son aquellas que difieren en 1, 2 ó 3 aminoácidos con respecto a dichas secuencias (Figura 17) . Preferiblemente, la homología del péptido candidato con los péptidos de la invención es del 80%, más preferiblemente del 85%, más preferiblemente del 90%, más preferiblemente del 95%, y aún más preferiblemente es del 98%.
La presente invención hace referencia, por primera vez, a péptidos aislados localizados en tres regiones de la proteína S100-beta, de una longitud variable, y que han sido generados in vivo por una APC a la que se le ha proporcionado la proteína S100-beta purificada para que la APC pudiese procesarla, generar epítopos peptídicos y presentar dichos epítopos en su superficie unidos a la molécula MHC de clase II.
Más específicamente, la presente invención da a conocer la secuencia de una serie de péptidos aislados cuya longitud varía entre 11-27 aminoácidos y que se agrupan en tres regiones de la proteína S100-beta completa, formando tres grupos de péptidos solapantes. Dichos péptidos son los siguientes:
a) Región 1: tres péptidos cuyo núcleo es la secuencia KAMVALIDVFHQYSG SEQ ID NO: 1: KAMVALIDVFHQYSGREGD SEQ ID NO: 2: AMVALIDVFHQYSGREGDK SEQ ID NO: 3: SELEKAMVALIDVFHQYSG
b) Región 2: cuatro péptidos cuyo núcleo es la secuencia FQEFMAFFVAMVTTAC SEQ ID NO: 4: TLDNDGDGECDFQEFMAFVAMVTTACH SEQ ID NO: 5: FQEFMAFVAMVTTACHEFFEHE SEQ ID NO: 6: EFMAFVAMVTTAC SEQ ID NO: 7: FQEFMAFVAMVT
c) Región 3: cuatro péptidos cuyo núcleo es la secuencia KHKLKKSELKELINN SEQ ID NO: 8: REGDKHKLKKS SEQ ID NO: 9: HKLKKSELKEL SEQ ID NO: 10: KHKLKKSELKELINNELSHFLE SEQ ID NO: 11: SGREGDKHKLKKSELKELINN
Para cada una de las tres regiones descritas anteriormente se pueden sintetizar uno o más epítopos peptídicos consenso que incluyen toda o parte de las secuencias descritas anteriormente. Estos “epítopos peptídicos consenso” incluyen uno o más posibles “motivos de unión” a la molécula MHC de clase II, preferiblemente DR4. Las secuencias aminoacídicas de dichos “epítopos peptídicos consenso” son:
a) KAMVALIDVFHQYSGREGDK (SEQ ID NO: 12) b) REGDKHKLKKSELKEL (SEQ ID NO: 13) c) KHKLKKSELKELINNELSHFLE (SEQ ID NO: 14) d) ECDFQEFMAFVAMVTTACHEFFEHE (SEQ ID NO: 15) e) MAFVAMVTTACHEFFEH (SEQ ID NO: 16)
A partir de las secuencias descritas anteriormente y de sus derivados (ligandos peptídicos alterados) se pueden generar distintas moléculas o reactivos útiles en la prevención, tratamiento, diagnóstico o seguimiento de enfermedades.
Entre estas moléculas, la presente invención se refiere a los tetrámeros MHC de clase II-péptido antigénico.
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Dichos tetrámeros también pueden fusionarse a una o más de otras moléculas. Preferiblemente, con fines terapéuticos, dichas moléculas son citocinas, por ejemplo la interleucina-10, la interleucina-5, la interleucina-4 o la interleucina-13, toxinas, por ejemplo, la saporina, o algunos isótopos, por ejemplo, el actinio-225, que regulan la actividad de los linfocitos CD4+ específicos para S100-beta o los eliminan de forma específica (Figura 3) . Con fines diagnósticos, dichos tetrámeros también pueden fusionarse a nanopartículas magnéticas o a compuestos fluorescentes para la detección de linfocitos CD4+ específicos para S100-beta, por ejemplo para la detección in vivo mediante tomografía axial (Figura 3) cuando se fusionan a nanopartículas magnéticas, o para la detección ex vivo mediante citometría de flujo cuando se fusionan a compuestos fluorescentes. El diagnóstico se realiza de modo que cuando un sujeto presenta un número de linfocitos CD4+ específicos para S100-beta por encima de un determinado valor, éste es diagnosticado como diabético, considerando como sanos a aquellos sujetos que muestran niveles por debajo del mismo. Asimismo, los tetrámeros pueden fusionarse a distintas combinaciones de toxinas, citocinas, nanopartículas magnéticas y/o compuestos fluorescentes.
En un segundo aspecto, la presente invención también se refiere a un procedimiento que permite la identificación directa y el aislamiento de los epítopos peptídicos procesados de forma natural a partir de un antígeno específico y presentados por moléculas de histocompatibilidad de clase II a linfocitos CD4+. Dicho procedimiento comprende las etapas de:
a) purificación de la molécula de histocompatibilidad de clase II, b) elución de los péptidos unidos a la molécula de histocompatibilidad de clase II; e c) identificación de los péptidos eluidos en la etapa b) .
La purificación de la molécula de histocompatibilidad de clase II en la etapa a) se puede llevar a cabo mediante distintos procedimientos, tales como la precipitación con sulfato amónico, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio aniónico o preferiblemente mediante la cromatografía de afinidad empleando un anticuerpo específico. La elución de los péptidos unidos a la molécula de histocompatibilidad en la etapa b) se puede llevar a cabo mediante distintos procedimientos, tales como la incubación en tampón citrato-fosfato pH: 3, 3 a temperatura ambiente o preferiblemente mediante incubación en ácido acético al 10% a 70ºC. La identificación de los péptidos según la etapa c) se puede llevar a cabo mediante distintos procedimientos, preferiblemente mediante HPLC y espectrometría de masas.
En un tercer aspecto, la presente invención también se refiere a un péptido antigénico aislado derivado de la proteína S100-beta, donde dicho péptido se encuentra unido a una molécula MHC de clase II, para su utilización en la prevención, tratamiento, diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes tipo I. Dicho péptido antigénico puede ser aquel descrito en cualquiera de las realizaciones anteriores.
La presente invención también se refiere a la utilización de un péptido antigénico aislado derivado de la proteína S100-beta, donde dicho péptido se encuentra unido a una molécula MHC de clase II, para la fabricación de un medicamento para la prevención, tratamiento, diagnóstico y/o seguimiento de la diabetes tipo I. Dicho péptido antigénico puede ser aquel descrito en cualquiera de las realizaciones anteriores.
En la presente invención por “prevención” se entiende evitar la aparición de una enfermedad, en este caso la diabetes tipo I.
En la presente invención por “tratamiento” se entiende la intervención clínica en un intento por alterar la evolución natural de la enfermedad y se realiza durante la evolución de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen la prevención de la reaparición de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, disminución de la velocidad de progresión de la enfermedad, mejora o cura parcial del estado patológico y remisión o pronóstico mejorado.
En la presente invención por “diagnóstico” se entiende la capacidad de identificar una determinada enfermedad o estado patológico, en este caso la diabetes tipo I.
En la presente invención por “seguimiento” se entiende el proceso continuo y dinámico de recogida de datos sobre el estado patológico del paciente, en este caso con respecto a la diabetes tipo I a efectos de establecer la fase en que se encuentra la enfermedad y consecuentemente aplicar la acción terapéutica adecuada.
En una realización preferida, el péptido antigénico unido a la MHC de clase II según cualquiera de las realizaciones anteriores se utiliza como reactivo para identificar y cuantificar linfocitos CD4+ específicos para epítopos peptídicos de S100-beta, en sistemas de diagnóstico o seguimiento de la diabetes tipo I. En una realización preferida, la detección de linfocitos CD4+ específicos para S-100 beta se lleva a cabo in vivo mediante tomografía axial o ex vivo mediante citometría de flujo, fusionando los tetrámeros a nanopartículas magnéticas o a compuestos fluorescentes, respectivamente.
La presente invención también se refiere a un método de prevención o tratamiento de la diabetes tipo I que ES 2 394 331 A1
comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido antigénico unido a MHC de clase II según la presente invención en sus diferentes realizaciones a un sujeto con necesidad del mismo. La administración de una cantidad terapéuticamente eficaz se haría de forma preferida mediante vía intradérmica o subcutánea, pudiendo hacerse de manera alternativa mediante vía oral, parenteral o nasal. La administración de una cantidad terapéutica de péptido se realizaría de forma preferida mediante su mezcla en “alum” (sulfato de aluminio y potasio hidratado) o en solución salina, preferiblemente al 0, 9%.
Adicionalmente, los péptidos antigénicos unidos a MHC de clase II según cualquiera de las realizaciones de la presente invención se pueden utilizar para el tratamiento, prevención, seguimiento y diagnóstico específico de enfermedades donde intervengan tanto S100-beta como DR4, por ejemplo, artritis reumatoide.
En un cuarto aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un péptido antigénico aislado derivado de la proteína S100-beta tal como se ha definido anteriormente, pero sin estar unido a una MHC de clase II, para la fabricación de un medicamento para la prevención, tratamiento, diagnóstico o seguimiento de la diabetes tipo I, así como a dicho péptido antigénico aislado derivado de la proteína S100-beta para su uso en la prevención, tratamiento, diagnóstico o seguimiento de la diabetes tipo I. Dicha prevención o tratamiento de la diabetes tipo I comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido antigénico según la presente invención en sus diferentes realizaciones a un sujeto con necesidad del mismo. La administración de una cantidad terapéuticamente eficaz se haría de forma preferida mediante vía intradérmica o subcutánea, pudiendo hacerse de manera alternativa mediante vía oral, parenteral o nasal. La administración de una cantidad terapéutica de péptido se realizaría de forma preferida mediante su mezcla en “alum” (sulfato de aluminio y potasio hidratado) o en solución salina al 0, 9%, pudiendo hacerse en otra realización preferida con el péptido encapsulado en un vehículo, o bien unido a la superficie externa de un vehículo, donde dicho vehículo es seleccionado del grupo que comprende: un liposoma, una micela, una vesícula, una micropartícula, una microcápsula, una microesfera, una nanopartícula, una nanocápsula y una nanoesfera.
El diagnóstico o seguimiento de la diabetes tipo I empleando los péptidos de la invención por sí solos, sin estar unidos a una MHC, se lleva a cabo mediante la cuantificación de la cantidad de linfocitos CD4+ productores de distintas moléculas. En una realización preferida, el sistema de diagnóstico o seguimiento consiste en detectar la síntesis de interferón-gamma, interleucina-10, interleucina-17, o combinaciones de los mismos por parte de linfocitos CD4+ en respuesta a dichos péptidos antigénicos (Figura 4, Ejemplo 2) , preferentemente mediante ELISPOT.
En una realización preferida de este cuarto aspecto, el péptido se localiza en la región 1 de la proteína S100-beta, y comprende cualquiera de las secuencias SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 3.
En otra realización preferida de este cuarto aspecto, el péptido se localiza en la región 2 de la proteína S100-beta y comprende cualquiera de las secuencias SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, o SEC ID NO: 7.
En otra realización preferida de este cuarto aspecto, el péptido se localiza en la región 3 de la proteína S100-beta y comprende cualquiera de las secuencias SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10 o SEC ID NO: 11.
En otra realización preferida de este cuarto aspecto, el péptido es un péptido consenso para cada una de las regiones 1, 2 y 3, y es seleccionado del grupo que comprende:
a) péptido de secuencia SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15 o SEC ID NO: 16, b) péptido que al menos muestra un 80%, preferiblemente un 85%, más preferiblemente un 90%, más preferiblemente un 95% y aún más preferiblemente un 98% de homología con los péptidos descritos en a) .
Los términos “péptido consenso” y “homología” en este cuarto aspecto de la invención significan tal como se han definido anteriormente teniendo en cuenta que el péptido no está unido a la MHC.
Los presentes inventores han observado que los epítopos peptídicos consenso (no unidos a una molécula MHC de clase II) diseñados para cada una de las tres regiones, a partir de los péptidos identificados (ver Ejemplo 1, donde la identificación se hace mediante espectrometría de masas) , poseen las mismas características de unión a la molécula MHC de clase II DR4 tal y como se muestra en los ensayos realizados, además de que en dichos ensayos se puede delimitar con exactitud cuál puede ser la secuencia de aminoácidos que sirve como “motivo de unión” (Ejemplo 3) .
La validez de estos epítopos peptídicos (no unidos a una molécula MHC de clase II) , tanto de las SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 11 como de los epítopos peptídicos consenso, en el diagnóstico y seguimiento de la diabetes tipo I, se ha demostrado empleando estos últimos (SEQ ID NO: 12 a SEQ ID NO: 16) en muestras clínicas procedentes de pacientes con T1D. Mediante análisis ELISPOT (Figura 4) , se analizó la frecuencia de linfocitos CD4+ productores de interferón-gamma (IFN-y) , interleucina-17 (IL-17) e interleucina-10 (IL-10) en respuesta a dichos péptidos en pacientes sanos y diabéticos (Ejemplo 2) , demostrándose la capacidad de los péptidos para discriminar eficazmente entre ambos grupos y por tanto poniendo de relieve la capacidad de diagnóstico de los péptidos en la diabetes tipo I, tanto para diagnosticar la presencia o ausencia de la enfermedad, como para determinar la evolución de la misma ES 2 394 331 A1
en un sujeto. Además, los inventores han demostrado que las secuencias SEQ ID NO: 1-11 son también útiles en la prevención, tratamiento, diagnóstico o seguimiento de la diabetes tipo I, ya que en los ensayos de unión (Figuras 11, 13, 14 y 16) , tanto los péptidos consenso como los de SEQ ID NO: 1-11 tienen similares patrones de unión a las moléculas MHC y por tanto tendrán similares capacidades antigénicas.
Los péptidos no unidos a una molécula MHC de clase II se pueden utilizar directamente o pueden ser encapsulados en un vehículo, o ser unidos a la superficie externa del mismo. Por tanto, en otra realización preferida, el péptido se encuentra o bien encapsulado en un vehículo, o bien unido a la superficie externa de un vehículo, donde dicho vehículo es seleccionado del grupo que comprende: un liposoma, una micela, una vesícula, una micropartícula, una microcápsula, una microesfera, una nanopartícula, una nanocápsula y una nanoesfera, preferiblemente liposomas, que permiten mejorar la inmunogenicidad de los péptidos frente a la diabetes tipo I.
A continuación se muestran una serie de ejemplos que pretenden ilustrar la presente invención pero que en ningún caso deben interpretarse como limitantes de la misma.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Aislamiento e identificación de los epítopos peptídicos derivados de S100-beta unidos a MHC de clase II
Metodología El sistema empleado para la identificación de epítopos peptídicos derivados de S100-beta se esquematiza en la Figura 5. Resumiendo, la proteína S100-beta humana fue expresada en bacterias conteniendo una secuencia de biotinilización en su extremo carboxilo-terminal, secuencia empleada para biotinilar in vitro S100-beta empleando la enzima BirA o biotín ligasa (EC 6.3.4.15) , y una secuencia de 6 histidinas en el extremo amino-terminal para poder purificarla empleando resinas de niquel. Una vez purificada y biotinilada, S100-beta fue incubada con células Priess, una línea linfoblastoide homozigota para la molécula MHC de clase II DR4, que habían sido preincubadas con los demás elementos del sistema de internalización (en primer lugar, una lectina obtenida a partir de Phytolacca americana (pokeweed mitogen, nombre en inglés) biotinilada y en segundo lugar, avidina) . Una vez incubadas con S100-beta, las células fueron incubadas a 37ºC para permitir la entrada de S100-beta, su procesamiento y la presentación de epítopos en la superficie celular unidos a moléculas MHC de clase II DR4. Como células control se usaron las mismas células Priess que habían sido incubadas con todos los elementos del sistema excluyendo S100beta.
Una vez pasado el periodo de incubación, las células Priess incubadas con S100-beta o control sin S100-beta, fueron recogidas y se purificaron de forma específica mediante cromatografía de afinidad las moléculas MHC de clase II DR4, empleando columnas de Sepharosa conteniendo el anticuerpo monoclonal L243 conjugado. Los epítopos peptídicos unidos a estas moléculas MHC fueron eluidos mediante pH ácido, filtrados empleando filtros con un punto de corte de 10.000 daltons, secados para reducir su volumen y fraccionados mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) empleando una columna de fase reversa C-18 (Figura 6) . Cada una de las fracciones obtenidas en el HPLC fue analizada mediante espectrometría de masas MALDI-TOF y los espectros de masas del repertorio peptídico obtenido a partir de las moléculas MHC DR4 purificadas de células Priess incubadas con S100beta fue comparado con los espectros de masas del repertorio peptídico obtenido de células Priess control, no incubadas con S100-beta, para identificar valores m/z únicos correspondientes a péptidos derivados de S100-beta. Los valores m/z únicos fueron comparados con la secuencia lineal de S100-beta mediante el programa FindPept (http://www.expasy.ch/tools/findpept.html) para identificar la secuencia de aminoácidos correspondiente en la proteína.
Resultados De este análisis, 9 valores m/z fueron identificados como únicos, que se corresponden con tres conjuntos solapantes de péptidos, conjuntos donde existe al menos un motivo de unión a la molécula DR4 (Figura 7) . Una vez identificados estos epítopos peptídicos se sintetizaron 4 epítopos peptídicos consenso (Figura 8) que representasen a cada uno de los tres conjuntos de epítopos peptídicos solapantes y que pudiesen ser empleados en la identificación específica de linfocitos T CD4+ autoreactivos en pacientes diabéticos e individuos sanos.
Ejemplo 2: capacidad de diagnóstico de los péptidos/complejos MHC-péptido en diabetes tipo I
Metodología El fundamento de la técnica de ELISPOT se describe esquemáticamente en la Figura 4. Para la identificación de linfocitos CD4+ en sangre periférica de pacientes con T1D (28 pacientes) e individuos sanos (24 personas) , se añadió durante 1 hora a 37ºC a distintos pocillos de placas Maxisorp una solución de anticuerpo monoclonal específico para tres citocinas: interferón-gamma (IFN-y) , interleucina-17 (IL-17) e interleucina-10 (IL-10) . Una vez lavadas, se añadió a las placas una solución de albúmina bovina para bloquear los lugares donde no hubiese ES 2 394 331 A1
anticuerpo y, después de 1 hora de incubación a 37ºC y de haber retirado la solución de albúmina, se añadieron por triplicado linfocitos periféricos obtenidos de pacientes con T1D o sujetos sanos añadiendo los antígenos y controles correspondientes. Las células fueron incubadas 37ºC durante 72 horas y, una vez pasado el periodo de incubación, las placas fueron lavadas e incubadas a 37ºC durante 1 hora con un anticuerpo monoclonal específico correspondiente para cada una de las tres citocinas conjugado a biotina (anticuerpo de revelado) . Lavado el exceso de anticuerpo de revelado, la presencia de IFN-y, IL-17 o IL-10 fue revelada empleando un anticuerpo dirigido contra biotina (GABA) y conjugado a una enzima, que una vez añadido el correspondiente sustrato, lo transforma en una sustancia insoluble que se deposita sobre la placa en forma de mancha (“spot”) .
Resultados La frecuencia de linfocitos CD4+ productores de IFN-y, IL-17 e IL-10 medida como Índice de Estimulación (número de “spots” en presencia de antígeno / número de “spots” en presencia de DMSO) en respuesta a los epítopos peptídicos consenso se muestran en las Tablas 1, 2 y 3, respectivamente. Un índice de estimulación superior a 3 se considera significativo y en las Tablas donde se indica un índice de estimulación >3 es debido a que existe una respuesta positiva pero en DMSO el número de “spots” es cero. Como se desprende de los resultados mostrados en dichas Tablas, los linfocitos CD4+ de pacientes con T1D responden con mayor frecuencia sintetizando IFN-y (Tabla 1) e IL-17 (Tabla 2) contra alguno de los epítopos peptídicos consenso, los cuales discriminan de forma eficaz entre individuos sanos y pacientes diabéticos, poniendo de relieve su utilidad en el diagnóstico de la diabetes tipo I humana. Es de resaltar el hecho de que mientras algunos pacientes diabéticos responden contra alguno de los epítopos peptídicos consenso secretando IL-10 (Tabla 3) , en especial contra el epítopo peptídico consenso S100 6892 (SEQ ID NO: 15) , todos los individuos sanos analizados responden contra dicho epítopo sintetizando grandes cantidades de esta citocina (Tabla 3 y Figura 9) cuyo papel inmunoregulador está ampliamente estudiado. Además, en la Tabla se incluyen toda una serie de antígenos que sirvan tanto como controles positivos (forbol 12-miristato 13acetato (PMA) ) para comprobar la viabilidad celular y como controles negativos (dimetilsufóxido (DMSO) o un péptido correspondiente a una proteína de Plasmodium falciparum (Pf) , éste último siempre que se hubiesen aislado células suficientes) para comprobar la especificidad de la respuesta.
Ejemplo 3. Ensayos de unión a la molécula MHC de clase II DR4 de los epítopos peptídicos y delimitación del “motivo de unión”
Metodología Los ensayos de unión han sido realizados por la empresa ProImmune Ltd (http://www.proimmune.com) empleando tecnología propiedad de la empresa. Los experimentos realizados consisten en mezclar un péptido con la molécula MHC de clase II DR4 purificada de forma que, en función de su afinidad, dicho péptido pueda unirse a la molécula DR4 y esta unión péptido-DR4 se detecta mediante el empleo de un anticuerpo específico. La afinidad y la estabilidad de unión de cada péptido se midió como la cantidad de señal generada a las 0 horas después de mezclar los componentes y después de incubar las mezclas durante 24 horas a 37ºC, midiéndose posteriormente la cantidad de péptido-DR4 remanente. Como controles para comparar la compañía emplea dos epítopos peptídicos de afinidad conocida por la molécula MHC de clase II DR4, uno con alta afinidad y otro con afinidad media.
En un intento de acotar el posible “motivo de unión” a la molécula MHC de clase II DR4 de los péptidos consenso empleados en los experimentos de ELISPOT, se sintetizaron nuevos péptidos de 15 aminoácidos de longitud (15mer) y desplazados entre sí un solo aminoácido hasta cubrir la longitud del epítopo peptídico consenso correspondiente. Una vez sintetizados, la afinidad de unión por DR4 de cada uno de los péptidos de la librería fue determinada.
Resultados La Región 1 incluye tres epítopos peptídicos identificados mediante espectrometría de masas (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3) y un epítopo peptídico consenso (SEQ ID NO: 12) (Figura 10) . A partir de SEQ ID NO: 12 se sintetizaron seis péptidos de 15 aminoácidos de longitud y desplazados entre sí un solo aminoácido (15-mer #1, 15-mer #2, 15-mer #3, 15-mer #4, 15-mer #5 y 15-mer #6) (Figura 10) . Los ensayos de unión para cada uno de los epítopos peptídicos de esta Región 1 se muestran en la Figura 11. Como puede verse en la Figura 11, los epítopos peptídicos de esta región poseen una afinidad de unión a la molécula MHC de clase II DR4 intermedia, similar al epítopo de afinidad intermedia empleado como control. Además, el epítopo peptídico consenso (SEQ ID NO: 12) posee una afinidad similar a los tres epítopos peptídicos identificados mediante espectrometría de masas (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3) .
La Región 3 incluye cuatro epítopos peptídicos identificados mediante espectrometría de masas (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11) a partir de los cuales se sintetizaron dos epítopos peptídicos consenso (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14) . A partir de SEQ ID NO: 13 se sintetizaron dos péptidos de 15 aminoácidos de longitud y desplazados entre sí un solo aminoácido (15-mer #1 y 15-mer #2) (Figura 12) mientras que a partir de SEQ ID NO: 14 se sintetizaron ocho péptidos de 15 aminoácidos de longitud y desplazados entre sí un solo aminoácido (15-mer #3, 15-mer #4, 15-mer #5, 15-mer #6, 15-mer #7, 15-mer #8, 15-mer #9, 15-mer #10)
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(Figura 12) .
Los ensayos de unión del epítopo peptídico consenso SEQ ID NO: 13 muestran que éste no posee afinidad por la molécula de histocompatibilidad MHC de clase II DR4, circunstancia que ocurre con algunos epítopos implicados en autoinmunidad (Figura 13) . De la misma manera, ninguno de los dos péptidos de 15 aminoácidos de longitud sintetizados a partir de SEQ ID NO:13 posee afinidad por dicha molécula DR4 (Figura 13) . Los ensayos de unión del epítopo peptídico consenso SEQ ID NO: 14 muestran que, de la misma forma que SEQ ID NO: 13 derivado de la misma región de S100-beta, tampoco posee afinidad por la molécula de histocompatibilidad MHC de clase II DR4 (Figura 14) . De la misma manera, ninguno de los ocho péptidos de 15 aminoácidos de longitud sintetizados a partir de SEQ ID NO:14 posee afinidad por dicha molécula DR4 (Figura 14) .
La Región 2 incluye cuatro epítopos peptídicos identificados mediante espectrometría de masas (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7) y un epítopo peptídico consenso (SEQ ID NO: 15) (Figura 15) . A partir de SEQ ID NO: 15 se sintetizaron once péptidos de 15 aminoácidos de longitud y desplazados entre sí un solo aminoácido (15-mer #1, 15-mer #2, 15-mer #3, 15-mer #4, 15-mer #5, 15-mer #6, 15-mer #7, 15-mer #8, 15-mer #9 15-mer #10 y 15-mer #11) (Figura 15) . Los ensayos de unión para cada uno de los epítopos peptídicos de esta Región 2 se muestran en la Figura 16. Como puede verse en esta Figura, los epítopos peptídicos descritos para esta región son los que posee mayor afinidad de unión por la molécula MHC de clase II DR4, característica que es replicada por el epítopo peptídico consenso (SEQ ID NO: 15) diseñado para esta región y empleado en los ensayos de ELISPOT para cuantificar linfocitos autoreactivos. De los ensayos de unión a la molécula MHC de clase II DR4 empleando la librería de once péptidos de 15 aminoácidos de longitud sintetizados a partir de SEQ ID NO: 15 puede deducirse que el “motivo de unión” de SEQ ID NO: 15 a la molécula de clase II DR4 parece encontrarse en la secuencia de aminoácidos MAFVAMVTTACHEFFEH (SEQ ID NO: 16) ya que los péptidos de 15 aminoácidos de longitud que poseen esta secuencia en su totalidad o en parte (15-mer #8, 15-mer #9, 15-mer #10) son los que poseen mayor afinidad y estabilidad de unión a la molécula de clase II DR4.
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Tabla 1. Frecuencia de linfocitos CD4+ productores de IFN-y frente a epítopos peptídicos derivados de S100-beta S100 25-46
S100 6-25 S100 21-36 S100 68-92
Sujeto DMSO* PMA** (SEQ ID
(SEQ ID NO: 12) (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 15)
NO: 14) Individuos sanos C14 3 >10 17, 67 18, 33 C15 147 >10 C16 7 >10 3, 64 C17 300 >10 C18 26 >10 C19 220 >10 C20 96 >10 C21 11 >10 C22 102 >10 C23 145 >10 C24 81 >10
Respuestas
100 18, 2 0 0 9, 1
positivas (%)
Pacientes diabéticos tipo 1
D17 2 >10 8, 50 D18 3 >10 D19 2 >10 4, 50 5, 00 D20 1 >10 11, 00 D21 2 >10 D22 2 >10 D23 >10 D24 >10 D25 0 >10 >3 D26 0 >10 >3 >3 D27 0 >10 >3 >3 D28 0 >10 >3 >3
Respuestas 100 44, 44 0, 00 30, 00 44, 44positivas (%)
*En DMSO los resultados se indican como número de spots por cada millón de células **Los resultados para PMA y los epítopos peptídicos se indican como Índice de Estimulación (número de spots muestra / número de spots DMSO) . Un índice de estimulación superior a 3 se considera positivo. Un índice de estimulación >3 indica que hay una respuesta positiva pero el número de spots en DMSO es cero.
ES 2 394 331 A1
Tabla 2. Frecuencia de linfocitos CD4+ productores de IL-17 frente a epítopos peptídicos derivados de S100beta S100 6-25 S100 21-36 S100 25-46 S100 68-92 Sujeto DMSO* Pf* PMA** (SEQ ID NO: (SEQ ID (SEQ ID (SEQ ID NO: 12) NO: 13) NO: 14) 15)
Individuos sanos C1 0 >10 C2 2 >10 C3 0 0 >10 C4 0 >10 C5 1 1 >10 C6 0 0 >10 C7 2 4 >10 C8 2 2 >10 C9 1 0 >10 C10 0 1 >10 C11 1 0 >10 C12 0 0 >10 C13 0 0 >10
Respuestas positivas (%) 100 0 0 0 0
Pacientes diabéticos tipo 1
D1 0 >10 >3 >3 >3 D2 0 >10 >3 >3 >3 >3 D3 1 0 >10 3, 1 D4 2 >10 D5 4 >10 D6 1 >10 D7 6 >10 D8 0 1 >10 >3 D9 0 0>10 >3 >3 >3 D10 0 0 >10 >3 D11 0 8 >10 D12 1 4 >10 D13 0 >10 D14 1 0 >10 D15 0 0 >10
Respuestas positivas (%) 100 13, 3 26, 7 20 26, 7
*En DMSO los resultados se indican como número de spots por cada millón de células **Los resultados para PMA y los epítopos peptídicos se indican como Índice de Estimulación (número de spots muestra / número de spots DMSO) . Un índice de estimulación superior a 3 se considera positivo. Un índice de estimulación >3 indica que hay una respuesta positiva pero el número de spots en DMSO es cero.
ES 2 394 331 A1
Tabla 3. Frecuencia de linfocitos CD4+ productores de IL-10 frente a epítopos peptídicos derivados de S100beta
S100 6-25 S100 68-92
DMS S100 21-36 S100 25-46
Sujeto PMA** (SEQ ID NO: (SEQ ID NO:
O* (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14)
12) 15) Individuos sanos >10
C14 8 >10 >10 >10
C15 18 >10
C16
>10 >10
C17 7, 5 >10 >10 >10
C18 6 >10 >10
C19 8 8, 1 >10 >10
C20 4 >10 >10 >10
C21 8 4, 4 >10 >10
C22 9 >10 >10
C23 16 >10 >10
C24 1
Respuestas 10040 0 0 100
positivas (%)
Pacientes diabéticos tipo 1
>10
D17 2 >10
D18
>10
D19 7 6, 9 >10
D20 3 >10
D21 5 6, 6 >10
D22 29 >10
D23 0 >3 >10
D24 0 >3 >3 >10
D25
>10
D26 24 >10
D27 1 >10
D28 2 >10
Respuestas 10011 11 22 50
positivas (%)
*En DMSO los resultados se indican como número de spots por cada millón de células **Los resultados para PMA y los epítopos peptídicos se indican como Índice de Estimulación (número de spots muestra / número de spots DMSO) . Un índice de estimulación superior a 3 se considera positivo. Un índice de estimulación >3 indica que hay una respuesta positiva pero el número de spots en DMSO es cero.
ES 2 394 331 A1
