Uso de L-Carnitina para proteger a los peces de la intoxicación por Cilindrospermopsina La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende L
Camitina (LC) para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a Cilindrospermopsina (CYN) . También se refiere al
uso de la citada composición en la recuperación de las alteraciones histopatológicas producidas en los tejidos de la lista que comprende hígado,
riñón, corazón, branquias ylo tracto gastrointestinal. Además, dicha composición lOse utiliza para la fabricación de un alimento funcional, un complemento vitamínico, o un complemento nutricional.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La L-carnitina (L-3-hidroxi-4-N, N, N-trimetilaminobutirato) (LC) es un derivado aminoacídico sintetizado a partir de los aminoácidos esenciales lisina y
metionina con la ayuda de la vitamina C y otros compuestos secundarios producidos por el cuerpo (Harpaz S, Aquaculture 249: 3-21 , 2005) que está
presente en la mayoría de las especies animales y en muchos 20 microorganismos y plantas. La Le se encuentra ampliamente distribuido por
todo el organismo, aunque se presenta en mayores cantidades en el corazón yen el músculo esquelético (Rebouche C. J. FASEB J. 6: 3379-3386, 1992) .
La función principal de este derivado aminoacídico consiste en actuar como cofactor en el transporte de ácidos grasos al interior de la mitocondria, donde se produce la fl-oxidación de los mismos, para la obtención de energía metabólica (Bremer J. Physiol. Rev. 63: 1420-1480, 1983) , desempeñando un papel crucial en el metabolismo de los ácidos grasos.
El 75% de la cantidad de LC requerida por el organismo proviene de la dieta.
El resto se sintetiza endógenamente en el hígado y en menor cantidad en el riñón y cerebro, a partir de los aminoácidos lisina y metionina, como indicamos con anterioridad (Tanphaichitr V. y Broquist H. P. J. Biol. Chem.
248: 2176-2181, 1973) .
Aunque no se conocen con exactitud los mecanismos de acción de la LC, su uso beneficioso en algunas patologías cardiovasculares (Ferrari R et al.,
Ann. N.Y. Acad. Sci 033: 79-91, 2004; Kendler B.S. J. Cardiovasc. Nurs. 21: 9-16, 2006) se cree debido a sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias (Savica V. el al., Semin. Nephrol. 24: 464-468, 2004; Laviano A. el al., CurroOpino Clin Nutr. Metab. Care 9: 442-448, 2006) .
Son múltiples los usos descritos para el uso de la Le sola o en combinación con otras sustancias. Así, distintos trabajos y patentes de investigación la describen para el tratamiento de astenias y anorexias (FR 4465) , en combinación con citrato de lisina tribásico y de vitamina C; como complemento nutricional en sujetos convalecientes, personas de edad, deportistas, mujeres embarazaldas o cualquier persona asténica que presente perturbaciones funcionales musculares (ES 2 043 062) ; alteraciones cardiacas asociada a la hipertensión arterial (P200901543) ; trastornos cerebrales centrales y periféricos, cardiacos, vasculopáticos, y trastornos del aprendizaje o relacionados con la edad , en combinación con el coenzima QlO (ES 2 269355 T21) ; prevención de disfunciones hepáticas y biliares frente a lesiones inducidas por agentes hepatotóxicos exógenos y endógenos por su intenso efecto antioxidante y su eficaz mejora de la circulación periférica y función cardiaca, en combinación con un extracto de Silybum marianum (ES 2 225 576 T3) ; prevención de la fibrosis renal (P201100709) Y tratamiento de todas las formas de nefropatías mediante una composición de L-acetil carnitina y L-propionil carnitina (ES 2 254 206 T3) ; prevención ó tratamiento de alteraciones de órganos que realizan función metabólica intensa (hígado, riñón, sistema cardiovascular y cerebro) como hepatosis, nefropatías Y' lesiones cardiovasculares o cerebrales provocadas por sustancias tóxicas, en combinación con glutation (ES 2 232 443 T3) ; la efectividad terapéutica de acetil L-carnitina en neuropatías periféricas (ES 2 039 262) , Y en el tratamiento de pacientes aquejados de metabolismo cerebral deficiente tal y como se produce en la demencia senil y pre-senil y enfermedad de Alzheimer (4.346.107) , promoción de la regeneración del tejido nervioso, inhibición de la degeneración neuronal Y trastornos cerebrales producidos por el envejecimiento y el uso de fármacos neurotóxicos, para mejorar el proceso de aprendizaje y memoria y para el tratamiento del coma y shock (ES 2 078 019 T3; ES 2 043 608; ES 2 207 287 T3) ; trastornos del aprendizaje en niños que sufren de déficit de atención/hiperactividad (ADHD) , en combinación con la sal interna de acetilL-carnitina y una huperzina (ES :2 237 591 T3) . Además, por su mecanismo de acción, es útil para trastornos del metabolismo de los lípidos y formas alérgicas y para la activación de las defensas inmunes, en combinación con polisacáridos (ES 2 222 388 T3) ; propionil L-carnitina es útil para la prevención y/o tratamiento de trastornos debidos a un metabolismo lipídico anormal, tales como la hipercolesterolernia, aterosclerosis, hiperlipidemias y
obesidad, en combinación con quitosana (ES 2 197 890 T3) . Ha demostrado utilidad frente a la citotoxicidad inducida por agentes inmunosupresores, en combinación con glicina (ES 2 2fl9 356 T3) ; enfermedades oculares como el glaucoma (ES 2 040 106) ; isovaleril L-carnitina ha probado ser útil para la prevención y curación de osteoporosis (ES 2 247 005 T3) ; enfermedades de la piel como ictiosis, psoriasis y dermatosis inducidas por una queratinización defectuosa como caspa, acné e hiperkeratosis palmar y plantar, en combinación con ácido glicólico (ES 2 088 655 T3) ; infecciones micóticas producidas por Cr y plococcus n"oformans, Candida albicans y Aspergi/lus sp. (ES 2 101 998 T3) Y son útiles para el tratamiento de infecciones intestinales, gastritis tipo B y úlceras duodenales humanas producidas por
Campylobacler sp. y Helicobacler sp. en combinación con alcoholes alifáticos de cadena larga (ES 2 093 395 T3) .
Concretamente en peces, la LC y derivados se ha empleado con diferentes propósitos: promotor del crec:imiento, prestando protección frente a concentraciones tóxicas de amoniaco y xenobióticos, aliviar el estrés 25 inducido por temperaturas extremas, aumentando la reproducción etc. , que han sido revisados en la literatura científica (Harpaz S, Aquaculture 249: 321, 2005) , con resultados a veces contradictorios. Se ha demostrado que L
carnitina, como aditivo alimentario, mejora el crecimiento (Becker ei al.,
Aquaculture 174:313-332, 1999; Yang el al., Aquaculture 342:48-55, 2012) ,
la función reproductora (CH19B50003453 19951207) , el desarrolllo y la supervivencia de peces y almejas (JP19800024343 19800227) y la resistencia al estrés generado por frío en ciclidos (Harpaz el al., J. Therm. Biol. 24:57-62, 1999; CH19980000400 19980219) . Además se ha demostrado que ejerce efecto protector frente a la penetración de xenobióticos aniónicos en guppies (Schreiber el al., Comp. Biochem. Physiol. 117C:99-102, 1997) . No existiendo, hasta el momento, nada publicado de LC con respecto El Cílíndrospermopsina (CYN) objeto de esta invención y por tanto, siendo novedoso aportar el uso de la Le con respecto al tratamiento, prevención ylo rec:uperación de efectos inducidos por CYN en peces.
Por otro lado, la CYN es una toxina producida por cianobacterias tóxicas presentes en aguas superficiales, pertenecientes al menos a seis géneros, siendo las especies identificadas en los momentos actuales Cylindrospermopsis racíborskií, Anabaena bergii, Aphanizomenon ovalisporun, Aphanizomenon flos-aquae, Umezakia nalans, y Raphidiopsis curvala, entre otras. CYN se aisló por primer vez de un cultivo de Cylindrospermopsis raciborskii, obtenido de los reservarios de agua de bebida que surtían a la población de Palm Island, Queensland, Australia (Ohtani I el al., J. Am. Chl3m. Soco 144:7941-7942, 1992) , Se ha comprobado su acumulación en peces y crustáceos, afectando a la calidad y
seguridad de este tipo de alimentos y suponiendo un riesgo potencial para el
consumidor. En comparación con los mamíferos, los estudios sobre efectos tóxicos de CYN en peces son muy escasos, destacando que puede afectar no sólo al hígado sino también al riñón, corazón, branquias, y tracto gastrointestinal. Las cianobacterias constituyen parte de la dieta de diversos ciprinídos y c (clidos, como es el caso, por ejemplo, de las Tilapias (Orechromis, sp.) . La Tilapia (Oreochromis sp.) es uno de los pescados que más rápidamente se ha introducido en acuicultura, por la facilidad que presenta su manejo, gran capacidad de adaptación a condiciones adversas y fácil reproducción; sus distintas variedades son filtradoras y consumidoras de cianobacterias y en Europa se está despertando un gran interés por su cultivo.
Como mecanismo de acción tóxica más aceptado, la CYN está considerada un citotoxina general que bloquea la síntesis de proteínas en células eucariotas de mamíferos y plantas (Terao K. el al" Toxican 32:833-843, 1994; Runnegar M.T. el al. Biochem. Pharmacol. 49:219-225, 1995) y disminuye los contenidos de Glutation (GSH) . La disminución de GSH no parece conllevar a un incremento del estrés oxidativo en la célula, sugiriéndose que no es un meCémismo primario de la toxicidad de CYN. Sin embargo, recientemente, se ha comprobado la participación directa del estrés oxidativo en la patogénesis de CYN en peces (Gutierrez-Praena D. el al., Aquat. Tox. 105:100-106, 20'11; Puerto M. el al., Ecotoxicology 20: 479490, 2011) , detectándose un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) , lipoperoxidación (LPO) , oxidación de proteínas y de ADN así como cambios en la actividad de diversas enzimas antioxidantes en peces. Los escasos estudios toxicológicos realizados hasta la actualidad han conducido SIl establecimiento de una Ingesta Diaria Tolerable (lDT) provisional de 0, 03 ~g/Kg/dia de CYN, y la propuesta de un valor guía provisional de 1 ~g/L de CYN en aguas de bebida.
Actualmente no existe un tratamiento antidótico específico en casos de intoxicación por CYN y sus epímeros procedentes de cianobacterias. Hasta la fecha, tan sólo el uso de lal N-acetilcisteína ha demostrado actividad protectora en peces frente a la intoxicación por CYN (Gutierrez-Praena D. el 15 al., Aquat. Toxicol. 31 : 1-8, 2012; P201101162, Cameán FernándezA. ela/., 2011) . Teniendo en cuenta la ubicuidad de esta toxina, se hace necesario recuperar peces que presenten alteraciones histopatológicas con diferentes niveles de afección, que pueden impedir el ciclo de vida normal de las especies afectadas.
EXPLICACiÓN DE LA INVENCiÓN
La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende LC para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces 25 expuestos a CYN.
En tilapias (Oreochromis sp.) expuestas a dosis únicas y repetidas de CYN se inducen estrés oxidativo y alteraciones patológicas. En concreto, se ha comprobado aumento de los niveles de peroxidación lipídica (lPO) y de 30 oxidación de ADN, disminución dIe los niveles de GSH, en diferentes órganos (hígado, riñón) de peces expuestos a 400 ~g CYN/kg pez de forma aguda por vía oral. Así mismo, CYN induce múltiples alteraciones histopatológicas en órganos diversos: hígado, riñón, tracto gastrointestinal, corazón y
branquias.
la le administrada en esta invl3nción se muestra efectiva manteniendo el
estado de salud del pez, previniendo daños causados por la toxina y/o
mejorando los efectos tóxicos inducidos por CYN en diversos órganos de
tilapias intoxicadas.
5
Además, el uso de lC como aditivo alimentario no sólo mejora los niveles de
GSH en hígado y riñón, sino que por su propia actividad antioxidante es
capaz de disminuir la lipoperoxidación (LPO) (hígado, riñón) , la oxidación de
ADN (hígado, riñón) inducida por CYN, y prevenir y recuperar las lesiones
10 histopatológicas inducidas en múltiples órganos como hígado, riñón,
corazón, tracto gastrointestinal y branquias.
En este sentido, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso
de una composición que comprende LC para la elaboración de un medicamento
1S útil en el tratamiento, prevención ylo recuperación de efectos tóxicos en peces
expuestos a CYN.
La composición de la present?~ invención comprende, al menos, LC. El
medicamento está compuesto, al menos, por la composición anterior. La lC, sus
20 sales, derivados farmacéuticamente aceptables o sus profármacos, se formulan
en una composición farmacéutica apropiada, en la cantidad terapéuticamente
efectiva, junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes
farmacéuticamente aceptables. El medicamento se emplea para el tratamiento
de los efectos tóxicos en peces expuestos a CYN.
25
Por un ~derivado farmacéuticarnente aceptablen se entiende cualquier sal,
farmacéuticamente aceptable o cualquier otro compuesto que después de su
administración, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) LC.
30 Un ~vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias,
o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas
en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye
sólidos o líquidos, disolventes, tensioactivos, etc.
3S El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención supone
combatir los efectos tóxicos para estabilizar el estado de toxicidad de los
individuos. El medicamento se emplea también para la prevención de los efectos tóxicos ocasionados a los peces lexpuestos a CYN. El término "prevención" tal como se entiende en la presente! invención consiste en evitar la aparición de efectos tóxicos en peces expuestos a CYN. En este caso, previamente a la intoxicación por CYN, los peces están protegidos por un aumento de las defensas antioxidantes producido por la acción de la LC. El medicamento también se emplea para la recuperación de los efectos tóxicos ocasionados en peces expuestos a CYN.
El término "efectos tóxicos" tal corno se entiende en la presente invención hace referencia a la consecuencia derivada de la exposición del pez a la CYN, es decir, la aparición de diversos efectos adversos, como por ejemplo, un daño celular que ocasiona un daño en los tejidos biológicos, lo que a su vez puede provocar un cambio en las funciones fisiológicas y en el metabolismo celular.
La CYN es una toxina de naturalE>za alcaloide, en cuya estructura interviene un grupo tricíclico guanidinio unido a hidroximetiluracilo. Es producida por al menos seis géneros de cianobaclerias, que se encuentran ampliamente distribuida en aguas tropicales y subtropicales. Pueden existir dos posibles epímeros de fonna natural, cilindrospenmopsina (CYN) y 7-epicilindrospenmopsina, ambos tóxicos; la completa pérdida del grupo uracilo elimina la toxicidad de CYN. En reservas naturales de agua se ha descrito otra variante, la 7-desoxicilindrospenmopsina,
cuya toxicidad apenas está establecida, siendo menos tóxica en ratón que CYN.
Un segundo aspecto de la presente invención es el uso de una composición que comprende L-Carnitina para la elaboración de un medicamento útil en la recuperación de efectos tóxicos: en peces expuestos a CYN. El ténnino "recuperación" hace referencia a la desaparición de los efectos tóxicos causados por la intoxicación con CYN. Esta recuperación supone la reversión total de los daños causados en los tejidos del pez, recuperando de esta fonma las funciones nonmales de los órganos afectados.
En una realización preferida de la presente invención, los efectos tóxicos son alteraciones histopatológicas. El ténmino "atteraciones histopatológicas" tal como se entiende en la presente invElnción son daños producidos en los tejidos biológicos del pez. Estos daños son detectados por medio del análisis a nivel
microscópico de las estructuras patológicas de obtenidas, sin excluir otras técnicas de detección. las Merentes muestras
S 10 15 Una realización aún más preferida de la invención, es el uso donde las alteraciones histopatológicas son producidas en al menos uno de los tejidos de la lista que comprende hígado, riñón, corazón, branquias o tracto gastrointestinal. Tal como se hal mencionado anteriormente, la CYN puede acumularse en el tejido hepático y también puede llegar a otros órganos utilizando la sangre como medio de dispersión, de esta forma, la toxina puede causar efectos tóxicos ylo alteracíones histopatológicas en los citados órganos. La recuperación de los tejidos afectados por las alteraciones histopatológícas es un aspecto destacable de la presente invención ya que puede suponer la curación de los peces cultivados, peces seleccionados por diversas características para la cría, peces de especies en peligro de extinción o cualquier otro tipo de pez que presente alteraciones histopatológicas en un grado reversible.
20 En otra realización más preferida de la presente invención, la Le se administra en una cantidad diaria de entre 400 y 880 mg por Kg de peso del pez. Esta administración se lleva a cabo durante al menos veintiún días. Preferiblemente la cantidad diaria incorporada a los peces es a partir de 400 mg por Kg de peso.
25 Esta composición , se puede administrar de distintas formas , entre ellas, pero sin limitarse, intraperitonealmente, oralmente, bucalmente, intramuscularmente o de forma subcutánea. Más preferiblemente se administra de forma oral o intraperitoneal. En otra realización más preferida la composición se presenta en una forma adaptada a la administración oral o intraperitoneal.
30 Preferiblemente los peces intoxicados están expuestos a más de 400 ~g CYNI kg de pez por vía oral en exposición única (intoxicación aguda) .
35 Otra realización preferida de la presente invención, comprende el uso de la composición anteriormente descrita que además incluye excipientes fannacológicamente aceptables.
El término "excipiente" hace re, ferencia a una sustancia que ayuda a la
absorción de la sustancia activa (en la presente invención, Le) , estabiliza
dicha sustancia activa o ayuda a la preparación del medicamento en el
sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable.
S Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los
ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas,
función de endulzar, función de colorante, función de protección del
medicamento como por ejemp'io para aislarlo del aire ylo la humedad,
función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de
10 presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función
desintegrad ora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción
en el intestino sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este
párrafo.
15 El término "excipiente farmacoló!~icamente aceptable" hace referencia a que
el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los
organismos a los que se administra.
En una realización más preferidal de la invención, la composición comprende
20 además otra sustancia activa.
En cada caso la composición se adaptará al tipo de administración utilizada,
por ello, la composición de la presente invención se puede presentar bajo la
forma de soluciones o cualquier otra forma de administración clínicamente
25 permitida y en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Otras realizaciones preferidas son el uso para la fabricación de un alimento
funcional, el uso para la fabricación de un complemento vitaminico y otra más es
el uso para la fabricación de un complemento nutricional.
30
La Le puede formar parte de un alimento funcional, complemento vitaminico,
complemento nutricional o cualquiera de sus combinaciones. Tal como se
entiende en la presente invención, un alimento funcional cumple una función
especifica como puede ser la de' mejorar la salud de los peces. Para ello al
35 alimento funcional se le PUedH agregar un complemento vitamínico ylo
complemento nutricional. El alimemto funcional, los complementos descritos o
cualquiera de sus combinaciones pueden administrarse junto con un pienso, formar parte de la composición elel pienso o pueden administrarse de forma independiente.
En una realización preferida, de la presente invención, los peces son cultivados.
Se entiende por "peces cultivados" aquellos peces criados en piscifactorías, charcas o cualquier contenedor de agua de cualquier tamaño que permita la cría de peoes y/o el engorde. Los peces cultivados pueden ser, sin limttar, peoes
destinados a la alimentación o a la cria de peces ornamentales.
En otra realización preferida, de la presente invención, los peces pertenecen al
género Oreochromis sp.
Los peces pertenecientes a este género se conocen como Tilapias. las Tilapias crecen en aguas cálidas dulces o saladas y tienen pocas exigencias respiratorias, rápido crecimiento y facilidad para la puesta. Los peces se pueden seleccionar, sin limitarse, a la lista que comprende O. amphimelas,
O. andersonii, O. angofensis, O. aureus, O. chungruruensis , O. esculentus,
O. hunteri, O. ismailiaensis, O. jipe, o. karomo, O. karongae, O. korogwe, O. /epidurus, O. /eucostictus, O. /ido/e, O. macrochir, O. ma/agarasi, O. mor/imeri, O. mossambicus, O. mweruensis, O. ni/oticus (Nile tilapia) , o. Pantani, O. pangani girigan, O. pangani pantani, O. p/acidus, O. p/acidus placidus, O. placidus ruvumae, O. rukwaensis, O. saka, O. safinicola, O. schwebischi, O. shiranus, O. sbiranus chilwae, O. shiranus shiranus, O.
spilurus, O. spilurus niger, O. spilurus percivali, O. spilurus spilurus, O. squamipinnis, O. tanganicae, O. upembae, O. uro/epis, O. uro/epis homorum, O. uro/epis uro/epis u O. variabilis. Más preferiblemente los peoes
pertenecen a la especie o. niloticus (Nile tilapia) .
A lo largo de la descripción y las, reivindicaciones la palabra "comprende" y
sus variantes no pretenden exd uir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y
ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCION DE LAS FIGURJ\S
FIG. 1. Muestra el efecto protelotor de diferentes concentraciones de LC sobre la LPO en hígado y riñón de tilapias expuestas a 400 "g CYN/kg
pez.
Medidas de LPO en higado y MEldidas de LPO en riñón. Donde: el eje Y representa leos valores de LPO (peroxidación lipídica)
cuantificados como sustancias de degradación de la peroxidación de los lípidos que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (Thiobarbituric Acid
Reactive Substances, TBARS) expresados en nmol de malonildialdehído (MDA) /g de tejido ± error estándar (n=8) . Los niveles de significación, es decir, que al comparar entre los grupos seleccionados la diferencia entre ellos sea estadísticamente significativa para lo cual el parámetro p debe ser menor de 0.05 (p<0.05) , son los siguientes: (a) comparación de los grupos tratados con CYN y LC con respecto a sus respectivos grupos control y (b) comparación del grupo tratado con CYN y LC (400 ó 880 mg LC/Kg pez/día) con su respectivo grupo no trataclo con LC.
FIG. 2. Muestra el efecto protelotor de díferentes concentraciones de LC
sobre la oxidación de ADN en hígado y riñón de ülapias expuestas a 400 "g CYN/kg pez Medidas de oxidación de ADN (sitios AP; 100.000 pb) .
Donde: el eje Y representa los valores de los sitios apurínicosl apirimidínicos por cada 100.000 pares de base" cuantificados como medida de la oxidación de ADN expresados como media ± error estándar (n=8) . Los niveles de significación, es decir, que al comparar entre los grupos seleccionados la diferencia entre ellos sea estadísticamente significativa para lo cual el
parámetro p debe ser menor de 0.05 (p<0.05) , son los siguientes: (a) comparación de los grupos tratados con eYN y Le con respecto a sus respectivos grupos control y (b) comparación del grupo tratado con eYN y Le (400 ó 880 mg Le/Kg pez/dial con su respectivo grupo no tratado con Le.
FIG 3. Muestra el efecto protec, tor de diferentes concentraciones de LC
sobre el cociente GSH/GSSG e~n hígado y riñón de tilapias expuestas a 400 ~g CYN/kg pez
Medidas del cociente Glutatión re, ducido/glutatión oxidado (GSH/GSSG) Donde: el eje Y representa los valores de GSH/GSSG (n=8) . Los niveles de significación, es decir, que al comparar entre los grupos seleccionados la diferencia entre ellos sea estadisticamente significativa para lo cual el parámetro p debe ser menor de 0.05 (p<0.05) , son los siguientes: (a) comparación de los grupos tratados con eYN y Le con respecto a sus respectivos grupos control y (b) comparación del grupo tratado con eYN y Le (400 ó 880 mg Le/Kg pez/dial con su respectivo grupo no tratado con Le.
FIG. 4. Muestra los cambios histopatológicos en higado de tilapias expuestas a CYN y su recuperatción por LC.
A, e, E, G, 1, K, M, Ñ, P: Tinción con Hematoxilina-eosina. Las barras miden 100 ~m. B, D, F, H, J, L, N, 0 , Q: Observaciones ultraestruclurales. Las barras miden 1 O~m.
FIG. 5. Cambios histopatológic, os en riñón de tilapias expuestas a CYN
y su recuperación por Le.
A, e , E, G, 1, K, M, Ñ, P: Tinción con Hematoxilina-eosina. Las barras miden 100 ~m. B, D, F, H, J, L, N, 0 , Q: Observaciones ultraestructurales. Las barras miden 1 O ~m.
FIG. 6. Cambios histopatológicos en corazón de tilapias expuestas a
CYN y su recuperación por LC.
5 A. e , E, G, 1, K, M, Ñ, P: Tinción con Hematoxilina·eosina. Las barras miden 100 ~m. B, D. F, H, J. L, N, 0, Q: Observaciones ultraestructurales. Las barras miden 1 O ~m.
10 FIG. 7. Cambios histopatológi1cos en intestino de tilapias expuestas a eYN y su recuperación por LC. A, e, E, G, 1, K, M, Ñ, P: Tinción con Hematoxilina-eosina. Las barras miden 100 ~m. B, D, F, H, J, L, N, 0, Q: Observaciones ultraestructurales. Las barras miden 1 O~m.
1 S FIG. 8: Cambios histopatológic:os en branquias de tilapias expuestas a CYN y su recuperación por LC observados con el microscopio óptico y electrónico de barrido.
20 A, B, e, D, 1, K, M, Ñ, P: Observaciones al microscopio óptico, tinción con Hematoxilina-eosina. Las barras miden 100 ~m. B, D, F, H, J, L, N, 0 , Q: Obs", vaciones ultraestructurales al microscopio electrónico de barrido (SEM: scanning electron microscope) . Las barras miden 10 ~m.
25 MODO DE REALIZACiÓN DE L¡~ INVENCiÓN
30 A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen el uso de Le para tratamiento, prevención ylo recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a CYN.
35 EJEMPLO 1 La invención se llevó a cabo empleando un total de 72 peces macho de Oreochromis nilolicus (Nile tilapia) , de peso medio 55, 2 ± 6, 77 g, Ylongitud de 12 ± 2 cm, obtenidos en una piscifactoría, y transferidos en acuaríos (96 L) con sistema de fi~ración de agua y aireación adecuados, y ciclos de 12/12 h
luzloscuridad. Los peces fueron alimentados con comida comercial (Dibaq, Segovia, España) , en una cantidad de 0, 3 g/día. Los peces se aclimataron durante 15 días antes del experimento. Se utilizaron 9 grupos experimentales con 8 animales en cada uno. Los peces fueron intoxicados con la toxina CYN pura (pureza > 95%, Alexis Gorporation, Lausen, Suiza) 6 mediante la administración de células liofili:zadas de un cultivo de Aphanizomenon ovalisporum LEGE X-001 produ (~or de CYN, en ambos casos por vía oral
(mezclado con la comida comercial para peces) . la administración de Le se realizó también a través del pienso, empleando dos niveles de dosis, 400 y 880 mg LClKg pezldía. Cada grupo fue, introducido en un acuario independiente:
Acuario 1: peces control, alimentados solo con pienso normal durante 21
días Acuario 2: peces alimentados con pienso durante 21 días e intoxicados con CYN (dosis única de 400 ~g CYN/kg pez) procedente de un estandar puro.
Acuario 3: peces alimentados con pienso durante 21 días, intoxicados con CYN (dosis única de 400 ~g CYNlkg pez) procedente de un cultivo liofilizado de Aphanizomenon ovalisporum ¡productor de la misma.
Acuarios 4 y 5: Peces alimentados con pienso + LC, a las dosis de 20 y 45 mg LC/pezldía (equivalentes a 400 y 880 mg LC/Kg pezldía) durante 21 días.
Acuarios 6 Y7: Peces con pienso+ LC (400 y 880 mg LC/Kg pezldía) durante 21 días, e intoxicados con una dosis única de 400 ~g CYN/kg pez. procedente de estándar puro.
Acuarios 8 y 9: Peces con piensc.+ LC (400 y 880 mg LC/Kg pezldía) durante 21 días, e intoxicados con una dosis única de 400 ~g CYN/kg pez. procedente de un cultivo liofilizado de Aphanizomenon ovaJisporum productor de la misma.
Al final del experimento los peces fueron sacrificados, anestesiándolos con hielo. Se procedió a la extracción de los; órganos, y se prepararon sus extractos para las determinaciones de biomarcaclores enzimáticos, según Gutiérrez-Praena el
BI. (Aquat. Toxico!. 105: 100-10Ei, 2011) . Concretamente la medida de la lipoperoxidación lipídica (LPO) se realizó midiendo el malonildialdehído o sustancias de degradación de la peroxidación de los lípidos que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico; la oxidación de ADN mediante la determinación de los sitios apurínicos/ apirimidínicos por cada 100.000 pares de bases y se determinó además el cociente glutatión reducidolglutatión oxidado (GSH/GSSG) en hígado y riñón. Los estudios histológicos por microscopia óptica y electrónica en los distintos órganos se llevaron a cabo según Atencio et
al. (Toxicol. Pathol. 36:449-458, 2008) , incluyendo en el caso de las branquias microscopia óptica y electrónica d, e barrido (SEM) .
Para los estudios de significación , estadística entre grupos, se empleó el análisis de la varianza (ANOVA) y posteriormente el ensayo de Tukey, con una significación estadística p<0, 05.
Los resultados más significativos fueron los siguientes: 1) En la FIG. 1 se observa como la toxina CYN (procedente de células
liofilizadas de un cultivo de Aphanizomenon ovalisporum o de estándar puro)
incrementa la lipoperoxidación (LPO) en higado (2, 1 veces y 1, 7 respectivamente) , y en riñón (1 , 4 veces y 1, 5 respectivamente) frente al control, y los efectos protectores de LC se demuestran con las dos dosis ensayadas. 2) En la FIG. 2 se observa como CYN procedente de células liofilizadas de un cuttivo de Aphanizomenon ovalisporum aumenta la oxidación de ADN en hígado y riñon (1, 3 veces y 1, 4 respectivamente) en relación al control, y los efectos protectores de LC se demuestran con las dos dosis ensayadas. 3) La FIG. 3 muestra la disminución de los cocientes GSH/GSSG en higado y riñón de los peces intoxicados con CYN, y la aplicación de ambas dosis de LC
mejoró este parámetro.
EJEMPLO 2. LC mejoró las alteracíones histopatolÓQicas inducidas por CYN en hígado.
El estudio histopatológico del hígado de los peces pertenecientes a los lotes tratados con CYN puso en evidencia un proceso degenerativo que consistió en una desorganización del parénquima hepático con presencia de glucógeno en el
citoplasma del hepatoc~o y ciertas gotas de grasa (FIG. 4 G, H, 1, J) . frente a una ausencia de lesiones del grupo control (FIG. 4 A, B) caracterizada por cordones hepáticos normales, ceon hepatoc~os con una morfologia poliédrica normal.
En los dos lotes de peoes tratado, ; exclusivamente con LC se observó que, con ambas dosis (400 y 880 mg LC/I<g pez/día) no exístían lesíones hepátícas y presentan una morfología aparentemente normal (FIG. 4 C, D, E, F) . En los lotes de peoes a los que junto a la toxína CYN se les adminístró 400 mg LClkg
pez/día presentan un parénquima con una morfología aparentemente normal
con ausencia de grasa y glucógeno granular en el caso de la CYN prooedente 10 de líofilizado (FIG. 4 K, L) Y un c, erto contenido de glucógeno pero sin llegar a ser un prooeso patológico en el caso de CYN pura (FIG. 4 M, N) .
El estudio de los peoes del lotE> a los que junto con CYN (procedente de liofilizado o pura) se les administró una dosis de 880 mg LC/Kg pez/día mostró
un parénquima hepático aparentE~mente normal con recuperación total de las lesiones provocadas por la toxina, tanto al microscopio óptico, como al
electrónico (FIG. 41iJ, 0, P, Q) .
A, B: Hígado de los peoes c:ontrol. A. Cordones hepáticos normales, 20 hepatocito con una morfología aparentemente normal. B. Detalle de hepatocito aparentemente normal, con organoides citoplasmáticos, retículos y mitocondrias.
C, D: Tilapias tratadas con LC (400 ~glkg pez/día) . C. Parénquima con una morfología aparentemente normal, con los hepatocitos dispuestos en 25 cordones y zona pancreática aparentemente normal. D. Detalle de hepatocito aparentemente normal con organoides citoplasmáticos y ausencia de grasa y glucógeno granular. E, F: Tilapias tratadas con LC (080 mg LC/Kg pez/día) . E, Parénquima con
una morfologia aparentemente normal, con los hepatocitos dispuestos en 30 cordones y zona pancreática aparentemente normal. F. Detalle de hepatocito aparentemente normal con organoides citoplasmáticos y ausencia de grasa y glucógeno granular.
G, H: Hígado de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado (400 ~g CYN/Kg pez) . G. Parénquima hepático desorganizado, hepatocitos con presencia de glucógeno (círculoE') . H. El hepatocito presenta gran contenido de glucógeno en el citoplasma (círculo) y gotas lipídicas (flecha) .
1, J: Hígado de peces expueslos a CYN pura (400 ~g LC/Kg pez) . lo Parénquíma hepátíco desorganí20ado, hepatocitos con presencia glucógeno (circulo) y de vesículas de grasal (flecha) . J. El hepatocito presenta con un citoplasma con escasos organoides y el resto del citoplasma repleto de grasa (circulo) y cierta presencia de glucógeno granular (flecha) . K, L: Higado de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/clía) . K. Parénquima con una morfología aparentemente normal, con los hepatocitos dispuestos en cordones aparentemente normales. L. De, talle de hepatocito aparentemente normal
con organoides citoplasmáticos y ausencia de grasa y glucógeno granular. M, N: Higado de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/dia) . M. Cordones hepáticos normales, con cierta morfología poliédrica con núcleo central y citoplasma claro con escaso contenido en glucógeno (círculo) . N. Detalle de hepatocito con cierto contenido en glucógeno (circulo) . Ñ, O: Hlgado de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (880 mg UC/Kg pez/día) . Ñ. Parénquima hepático aparentemente normal. O. DetallH de hepatocito aparentemente normal.
P, Q: Hígado de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (880 mg 20 LC/Kg pez/día) . P. Cordones hepáticos normales, pero con cierta morfología poliédrica con núcleo central y citoplasma sin contenido de glucógeno. Q.
Detalle de hepatocito aparentemente normal.
EJEMPLO 3. Le mejoró las alteraciones histopatolágicas inducidas por CYN en riñón.
Morfolágicamente los riñones de los peces de los lotes tratados con CYN
(procedente de liofilizado o pura) mostraron una glomerulopatía, observándose 30 al microscopio óptico una atrofia glomerular y dilatación de la capsula de Bowman y al microscopio electrónico se observa esta glomerulopalia con tumefacción e incluso pérdida de las microvellosidades de los túbulos contorneados proximales (FIG. 5 G, H, 1, J) . Los riñones de los peces del lote control presentaron una estructura aparentemente normal (FIG. 5 A, B) .
El estudio de los peces de los lotes tratados solamente con las dosis de LC (400 y 880 mg LClKg pez/dia) no mostró ninguna lesión renal (FIG. 5 C, D, E, F) . En los peces a los que se les administró CYN (procedente de liofilizado o pura) junto con 400 ó 880 mg LC/Kg pez/dia se observó estructuralmente y
ultraestructuralmente una morfología del parénquima renal totalmente nannal
(FIG. 5 K, L, M, N, tiI, 0, P, O) .
A, B: Riñón de los peces control.
C, D: Tilapias tratadas con LC (400 ~g/kg pez/dia) . C. Glomérulos y túbulos aparentemente normales. D. GloméruJo con podacito aparentemente normal.
E, F: Tilapias tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/dia) . E. Glomérulos y túbulos aparentemente normales. F. Túbulo contorneado proximal
aparentemente normal.
G, H: RiMn de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado (400 ~g
CYN/Kg pez) . G. Glomerulopatia y atrofia glomerular (circulo) , tubulonefrosis y dilatación de la capsula de Bowman (flecha) y ligera tubulonefrosis (estrella) . H. Microvellosidades de los túbulos contorneados proximales tumefactos y pérdidas de estas (circulo) . 1, J: Riñón de peces expuestos a CYN pura (400 ~g LC/Kg pez) . l.
Glomerulopatia (circulo) , atrofia ¡llomerular (estrella) , ditalación de la capsula de Bowman y tubulonefrosis (Hecha) . J. Tubulonefrosis de túbulos contorneados proximal con células engrosadas e hialinizadas (Hechas) . K, L: RiMn de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/dia) . K. Glomérulos y túbulos aparentemente normales. L. Membrana basal aparentemente normal.
M, N: Riñón de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/dia) . M. Glomérulos y túbulos aparentemente normales. N. Túbulo contorneado próximal aparentemente normal, con abundantes microvellosidades.
tiI, O: Riñón de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/dia) . Ñ. Glomérulos y túbulos aparentemente normales. O. Túbulo contorneado próximas aparentemente normal.
P, O: Riñón de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/dia) . P. Glomérulos y túbulos aparentemente normales. Q. Detalle 35 de túbulo contorneado distal aparentemente normal y con abundantes mitocondrias.
EJEMPLO 4. LC mejoró las aliteraciones histopatológicas inducidas por
CYN en corazón.
El estudio histopatológico realizado sobre peces tratados con CYN (procedente de liofilizado o pura) mostraron al microscopio óptico procesos de miofibrolisis, con pérdida de miofibrillas, presencia de edemas y hemorragias (FIG 6. G, I) . Al microscopio electrónico se observa una pérdida de las miofibrillas (FIG. 6 H, J) .
El corazón de los peces del lote control presentó una estructura aparentemente normal (FIG. 6 A, B) .
Los peces tratados solo con LC (400 y 880 mg LC/Kg pez/dial presentan una morfologia de las fibras cardiacas similares a las del grupo control (FIG. 6 C, D,
E, F) ., No se observaron lesiones en los tratados con ambas dosis de LC (400 Ó 880 mg LClKg pez/dial y expuestos a CYN (FIG. 6 K, L, M, N, IÍI, 0 , P, Q) .
A , B: Corazón de los peces control.
C, D: Tilapias tratadas con LC (400 ~g/kg pez/dial. C. Fibras musculares aparentemente normales. D. Detalle de miofibrillas aparentemente normales,
con bandas perfectamente dispuestas y normales.
E, F: Tilapias tratadas con LC (8, BO mg LC/Kg pez/dial. E. Fibras musculares aparentemente normales. F. Detalle de miofibrillas con material contráctil
intacto, con bandas perfectamente dispuestas y normales G, H: Corazón de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado (400 ~g CYN/Kg pez) . G. Miofibrolisis, pMdida de miofibrillas (necha) , ciertos edemas (estrella) y hemorragias (circulo) . H. Pérdida y desintegración de las miofibrillas (circulo)
1, J: Corazón de peces expuestos a CYN pura (400 ~g LC/Kg pez) . l. Miofibrolisis con pérdida de miofibrillas (círculos) , abundantes edemas (estrella) y ciertas hemorragias (flecha) . J . Pérdida y desintegración de las miofibríllas (circulo) . K, L: Corazón de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y
tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/día) . K Fibras musculares
aparentemente normales pero ciertas hemorragias (circulo) . L. Detalle de
miofibrillas normales sin pérdida de material contráctil.
M, N: Corazón de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (400 mg
LC/Kg pez/día) . M. Fibras musculares aparentemente normales. N. Detalle
S de miofibrillas normales sin pérdida de material contráctil.
Ñ, O: Corazón de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y
tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día) . Ñ Fibras musculares
aparentemente nonnales. O . Detalle de miofibrillas aparentemente normales.
P, a: Corazón de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (880 mg
10 LC/Kg pez/dla) . P. Fibras musculares aparentemente normales. Q. Detalle
de miofibrillas aparentemente normales.
EJEMPLO 5. LC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas por
15 CYN en intestino.
A nivel de intestino en los peces tratados con CYN (procedente de liofilizado o
pura) se observaron procesos de enteritis con necrosis de enterocitos al
microscopio óptico y pérdida manifiesta de microvellosidades al microscopio
20 electrónico (FIG. 7 G, H, 1, J) , en comparación con el grupo control (FIG. 7 A, B) .
Tras la administración de las dos dosis de LC (400 y 880 mg LC/Kg pez/día)
solo se observó una actividad manifiesta de las células caliciformes, sin interés
patológico (FIG. 7 C, D, E, F) , al ~lual que en los grupos de peces a los que se
les administró LC junto con CYN (FIG. 7 K, L, M, N, Ñ, 0 , P, a) , mostrando así
25 ambas dosis de LC un efecto protector frente a la toxina.
A, B: Intestino de los peces control. A. Vellosidades aparentemente
normales con enterocitos aparentemente normales. B. Enterocitos con
abundantes microvellosidades aparentemente normales (círculo) .
30 C, D: Tilapias tratadas con LC (400 ~glkg pez/día) . C. Vellosidades
aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales y
abundantes células caliciformes (flecha) . D. Enterocitos con abundantes
células caliciformes aparentemente normales (flechas) .
E, F: Tilapias tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/día) . E. Vellosidades
35 aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales y
abundantes células caliciformes (flecha) . F. Enterocitos con abundantes microvellosidades (circulo) . G, H: Intestino de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado (400 ~g CYN/Kg pez) . G. Detalle de vellosidades intestinales con enterocitos necrasados (circulo) H. DetallE! de enterocito con pérdida parcial de las microvellosidades (circulo) . 1, J: Intestino de peces expuestos a CYN pura (400 ~g LC/Kg pez) . !. Detalle
de vellosidades intestinales con enterocitos necrasados (circulo) J. Detalle de enterocito con pérdida parcial de las microvellosidades (circulo) . K, L: Intestino de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/dial. K. Vellosidades aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales y abundantes células caliciformes (flecha) . L. Enterocitos aparentemente normales con abundantes microvellosidades (circulo) . M, N: Intestino de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/dial. M. Vellosidades aparentemente nomnales con enterocitos aparentemente normales y abundantes células caliciformes (flecha) . N.
Enterocitos con abundantes microvellosidades (circulo) .
Ñ, O: Intestino de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (880 mg LC/K, g pez/dial. Ñ. Vellosidades aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales y abundantes células caliciformes (flecha) . O. Enterocitos aparentemente nomnales con abundantes microvellosidades (circulo) .
P, Q: Intestino de peces expuestas a CYN pura y tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/dial. P. Vellosidades aparentemente normales con enterocitos aparentemente nomnales y abundantes células caliciformes (flecha) . Q. Enterocitos con abundantes microvellosidades (circulo) .
EJEMPLO 6. LC mejoró las aliteraciones histopatológicas inducidas por CYN en branquias.
Al microscopio óptico las branquias de los peces tratados con CYN pura presentaron, a nivel de las laminillas" procesos de hiperemia y hemorragia (FIG.
1, J) , siendo estas lesiones más manifiestas en los peces tratados con CYN
procedente de liofilizado (FIG. 8 G, H) . Al microscopio electrónico de barrido pueden observarse infiltrados inflamatorios, erosión y tumefacción de la superficie lamelar (FIG. 8 G, H, 1, J) .
Estas lesiones no fueron observadas en el lote control (FIG. 8 A, B) , ni en los peces tratados con LC (400 ó 880 mg LClKg pez/dia) (FIG. 8 C, D, E, F) , ni en los grupos de a los que se les administró LC junto con CYN (FIG. 8 K, L, M, N, Ñ, 0 , P, Q) , que presentaron una morfologia aparentemente normal. Se muestra
así el efecto protector de ambas dosis de Le frente a CYN.
lOA, B: Branquias de los peces control. C, D: Tilapias tratadas con LC (400 ~g/kg pez/dia) . Estructura aparentemente
normal.
E, F: Tilapias tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/dia) . Estructura aparentemente normal.
G, H: Branquias de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado (400 ~g CYN/Kg pez) . G. Detalle de filamento branquial con presencia procesos de hiperemia (flecha) y hemorralgias en laminillas secundarias (circulo) . H.
Arco branquial con superficie erosionada y tumefacta (círculo) .
1, J: Branquias de peces expuestos a CYN pura (400 ~g LC/Kg pez) . l.
Detalle de filamento branquial con hiperemia en laminillas secundarias (flecha) y hemorragias (circulo) . J. Arco branquial con pérdida de continuidad, erosionado e infiltrado celular (circulo) . K, L: Branquias de tilapias exp, uestas a CYN procedente de liofilizado y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/dia) . K. Filamento branquial
aparentemente normal. L. Arco branquial aparentemente normal.
M, N: Branquias de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (400 mg LC/Kg pez/dia) . M. Filamento branquial aparentemente normal. N. Arco branquial aparentemente normal. Ñ, O: Branquias de tilapias expuestas a CYN procedente de liofilizado y
tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/dia) . Ñ. Filamento branquial aparentemente normal. O. Arco branquial aparentemente normal. P, Q: Branquias de peces expuestos a CYN pura y tratadas con LC (880 mg LC/Kg pez/dia) . P. Filamento branquial aparentemente normal. Q. Arco branquial aparentemente normal.
