MEDIO DE CULTIVO ADECUADO PARA LA PROLIFERACiÓN DE CÉLULAS MADRE NEURALES.
SECTOR DE LA TÉCNICA
Esta invención está relacionada con el empleo del compuesto 3, 12-di-O-acetil-8-0tigloilingoJ (de aquí en adelante ELAF) o una sal fannacológicamente activa de dicho compuesto, para favorecer la proliferación de precursores neurales o células madre neurales en cultivo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La existencia de regeneración de lesiones a partir de células madre neurales en el sistema nelVioso central, se ha descrito principalmente en modelos de isquemia transitoria g10baJ o focal , epilepsia yen lesiones por traumatismo craneal, entre otras. Así en modelos de isquemia, se ha comprobado que en la zona lesionada, aparecen nuevas neuronas que se han podido generar in situ por activación de células madre locales, o como resultado de la migración de precursores desde las áreas neurogénicas (giro dentado y zona subventricular) . En un modelo de isquemia transitoria global se ha observado un aumento de la proliferación de precursores neurales en el giro dentado (Liu, J. el al. 1ncreased neurogenesis in the denlate gyrus after transient global ischemia in gerbils. J Neurosci 18:7768-7778, 1998) y un efecto similar puede observarse en modelos de isquemia focal (Jin, K. el al. Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone afler focal cerebral ischemia in lhe ralo Proc Nall Acad Sci USA 98:4710-4715, 2001) , así como en modelos de epilepsia (Parenl, J.M. el al. Dentale granule cell neurogenesis is increased by seizures and conlributes lo aberranl network reorganization in lhe adult ral hippocampus. J Neurosci.17:3727-3738, /997) . De forma similar, el efecto se observa en otra de las zonas neurogénicas, la zona subventricular (Fallon, J. et al. In vivo induction ofmassive proliferation, directed migration, and differenttalion of neural cel/s in lhe adu/t mamma/ian brain. Proc Natl Acad Sci USA 97:14, 68614, 691, 2000) . Los precursores neurales proliferantes en estas regiones neurogénicas, estimulados tras la lesión, dan lugar a la producción de nuevos neuroblastos que, eventualmente, migran en dirección a la zona lesionada. Cualquiera que sea su origen, la capacidad de regeneración es muy escasa, habiéndose descrito una reposición neuronal entre 0, 2 y 10%, según el área afectada y el tipo de lesión (Arvidsson, A. el al. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain afler slroke. Na! Med 8:963-970, 2002; Nalcatomi. H. et al. Regeneration of hippocampal pyramidal neurons afier ischemic brain injur y . by recruitment of endogenous neural progenitors. Cell 110:429-441, 2002; Teramoto. T. el al. EGF
amplifies the replacement 01 parvalbuminexpressing sIria/al interneurons after ischemia. J Clin Invest. 111:1125-1/32, 2003) . El hecho de que haya una respuesta neurogénica a la lesión hace pensar que la fonnación de nuevas neuronas sea un mecanismo eficaz en la reparación de pequeñas lesiones, que pennanecen silentes precisamente porque las neuronas qu-e hacen apoptosis son reemplazadas, al menos en parte, por neuronas de nueva fonnación. Un estudio reciente demuestra que en los animales que han sumdo un traumatismo craneal, se incrementa la neurogénesis en el giro dentado del hipocampo y posterionnente estos animales recuperan su capacidad de realizar tareas de memoria especial. Sin embargo, si en estos animales se eliminan selectivamente las células madre que comienzan a dividirse en el hipocampo como consecuencia del daño inducido por el traumatismo, estos animales no pueden recuperar la capacidad para realizar tareas de memoria espacial (Blaiss CA, Yo TS, Zhang G, Chen J, Dimchev G, Parada LF, Powell CM, Kernie SG. Temporally specified genetic ablation of neurogenesis impairs cognitive recover y after traumatic brain injur y . J Neurosc:i. 2011 31 :4906-4916) , demostrando así que la reposición neuronal en estas regiones tiene un efecto sobre la recuperación de la memoria tras un traumatismo craneaL Adicionalmente, la aparición de neurogénesis en lesiones cerebrales, se ha demostrado también en humanos, concretamente se ha podido observar que en muestras de cc~ebro de pacientes sometidos a cirugía tras una lesión por traumatismo craneal, aparecen en la zona de la corteza cerebral alrededor de la lesión, células madre neurales proliferantes y neuroblastos (Zheng W, Zhuge Q, Zhong M, Chen G, Shao B, Wang H, Mao X, Xie L, Jin K. Neurogenesis in Adult Human Brain after Traumatic Brain Injur y . J Neurotrauma. 2011. [Epub ahead of print]
Sin embargo, las lesiones graves o las experimentales con mayor pérdida neuronal no pueden ser resueltas, a menos que se establezcan medidas terapéuticas eficaces para incrementar de fonna significativa el proceso neurogénico. Una de las alternativas que podoa contribuir a resolver, los problemas clfnicos que plantean las enfennedades que cursan con pérdida neuronal es el transplante de células madre que puedan posterionnente generar nuevas neuronas. Varios laboratorios han intentado esta estrategia en modelos animales a los que se han transplantado células madre de origen embrionario (Cao el al. Pluripotent stem ce//s engrafled into the normal or lesioned adu/t ral spinal cord are restricted lo a glial lineage. Exp Neurol.I67:48-58, 2001) , células madre neurales de animales adultos (Pluchino, S. et al. lnjection 01 udult neurospheres induces recover y in a chronic model o[multiple sc/erosis. Nature 422: 688-694, 2003) , o bien células procedentes de células madre sometidas a diferentes grados de diferenciación in vi/ro. El fenómeno más generalmente observado es que, las células madre que se implantan en las zonas neurogénicas del cerebro (por ejemplo, la zona subvt:ntricular o el bulbo olfativo en roedores) se diferencian a neuroblastos y se convierten en neuronas maduras pero no ocurre este mismo fenómeno en las zonas no nc~urogénicas del cerebro. (Herrera, D. G. el al. Adull-derived neural precursors transplanled inlo multiple regions in the adult brain. Ann Neurol. 46:867-77. 1999; Mligiliche. N.L.. et al. Surviva/ 01 neura/ progenitor ce//s Irom lhe subvenlricu/ar zone 01 the adult ral after transp/antation jnto the host spinal cord 01 the same strain 01 adult rato Anal Sci Int. 80:229-34,
2005) .
Por lo tanto uno de los problemas con el que se enfrenta la presente invención, es que, si bien las células madre que se implantan en las zonas neurogénicas de1 cerebro (por ejemplo, la zona subventricular o el bulbo olfativo en roedores) se diferencian a neuroblastos y se convierten en neuronas maduras, cuando el transplante se produce en otras zonas, inician la ruta de diferenciación glial. En las lesiones que ocurren en zonas no neurogénicas aparecen precursores neurales proliferantes que posteriormente podrian diferenciarse y la fuente endógena de precursores neurales en estas regiones es la glía parenquimal. Estas células de glía se activan tras una lesión y dan lugar a precursores neurales la m.ayoría de los cuales se diferencian a células de glía y muy pocas a neuronas.
Adicionalmente y sin perjuicio de lo anterior, la presente invención también se enfrenta al problema de elegir la fuente de los precursores a trasplantar a la hora de realizar este tipo de trasplantes. Las células madre embrionarias diferenciadas in vitro a células madre neurales o los precursores neurales fetales son una de las fuentes más abundante. Sin embargo, no es fácil encontrar donantes de precursores embrionarios y fetales por lo que S4ma de gran utilidad poder aislar precursores neurales de cerebro adulto, cultivarlas. y expandirlas in vUro para su posterior uso en trasplantes. Así, identificar agentes que favorezcan la expansión de los precursores neurales en cultivo resultará de gran utilidad en el desarrollo de terapias regenerativas del sistema nervioso.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS F'IGURAS
Fig 1. Ensayo de neuroesferas: efecto de ELAF sobre cultivos de precursores neurales in vitro. A. Imágenes de microscopía de contraste de fase representativas de cultivos de precursores neurales crecidos en presencia y ausencia de ELAF (lO J1M) . En todos los casos la proliferac:ión se estimulaba mediante la adición de los factores de crecimiento EGF+bFGF al medio de cultivo. B. Efecto de concentraciones crecientes de ELAF sobre el tamaño de las neuroesferas (* p<O.OI en Test T-student en relación al control sin ELAF) . C. Efecto de ELAF (lO J1M) sobre el número total de células en los cultivos de neuroesferas.
"
S Fig 2. Ensayo de neuroesferas: efe~cto de ELAF sobre cultivos de precursores neurales in vilro en presencia del inlhibidor de las isoformas clásicas y nóveles de PKC G06850. A. Imágenes de microscopía de contraste de fase representativas de cultivos de precursores neurales crecidos en presencia y ausencia de ELAF (10 J-lM) Y con el inhibidor de PKC 006850. En todos los casos la proliferación se estimulaba mediante la adición de los factores d.e crecimiento EGF+bFGF al medio de cultivo. B. Efecto de ELAF lOJ-lM sobre el tamaño de las neuroesferas en presencia y ausencia del inhibidor de PKC (* p<O.Ol en Test T-student en relación al control sin ELAF) .
10 lS Fig 3. Inmunocitoquímica: efecto dE~ ELAF sobre la proliferación de precursores neurales in vilro. A. Imágenes de microscopía de fluorescencia de fase representativas de cultivos de precursores neurales crecidos en presencia y ausencia de ELAF (10 J.lM) en los que se ha detectado la proteína marcadora de células en ciclo celular Ki67. En todos los casos la proliferación se estimulaba mediante la adición de los factores de crecimiento EGF+bFGF al medio de cultivo. B. Efecto 10 J-lM ELAF sobre el porcentaje de células Ki67+ (* p<O.OI en Test T-student en relación al control sin ELAF) .
20 Fig 4. Ensayo de neuroesferas: EfE~cto de ELAF-l sobre cultivos de precursores neurales in vitro. A. Imágenes de mic:roscopía de contraste de fase representativas de cultivos de precursores neurales cre<:idos en presencia y ausencia de ELAF-J (10 J-lM) . En todos los casos la proliferadón se estimulaba mediante la adición de los factores de crecimiento EGF+bFGF al medio de cultivo. B. Efecto de concentraciones crecientes de ELAF-l sobre el tamaño de las neuroesferas (* p<O, Ol en Test T-student en relación al control sin ELAF-l) .
2S
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
30 El compuesto 3, 12-di-O-acetil-8-0-tigloilingol favorece la proliferación de los cultivos celulares de precursores nenrales y pennite superar la inhibición de la neurogénesis fuera de regiones neumgénicas y favorecer la generación de nuevas neuronas en estas regiones a partir de precursores neurales trasplantados. Por lo tanto, a la hora de regenerar lesiones en la región no-neurogénica de la zona lesionada incrementa la probabilidad de que las células madre trasplantadas puedan dar lugar a neuronas maduras y funcionales.
35 Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invencIon, comprende el uso del compuesto 3, 12-di-O-acetil-8-0-tigloilingol (de aquí en adelante ELAF) con número CAS 58749-62-5 y cuya estructura química se muestra a continuación:
, ••
Estructura 1:
HO
o sales fannacológicamente activas del mismo, in vitra, para favorecer la proliferación de precursores neurales o células madre neurales.
En el contexto de la presente invención, se entiende por precursores neurales o células madre neurales a aquellas células madre aisladas del tejido neural adulto o fetal , que presentan capacidad de auto·replicarse, pero una capacidad de diferenciación limitada, pues sólo pueden diferenciarse hacia los tres subtipos de células del linaje neural: neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.
Para utilizar el ELAF en un cultivo in vitro es preferible disolverlo previo a su utilización en una solución que pueda disolver tanto el compuesto como su sal fannacéuticamente aceptada. Ejemplos del disolvente pueden ser dimetilsufóxido, agua o similares. Adicionalmente este compuesto puede estar disuelto en tampón fosfato salino (PBS) .
En un aspecto particular de la invención, para cultivar las células madre neurales con ELAF se añade ELAF en un rango de concentración desde 1 pmollL a 40 J.lmol/L. Las células madre se cultivan en flotación a una densidad de 20 a 200 x 106 células/lo El compuesto se añade a un cultivo estático a 37°C durante 1 a 14 días en una atmósfera de 5% C02, cambiando el medio de fonna total o parcial cada dos días.
El medio en el que se cultivan las células puede ser cualquier medio que no impida la proliferoción de las células madre neuraJes, como ejemplo se puede utilizar preferentemente un medio Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) /F-12 (1:1) , que contenga 2% del suplemento B2? (Invitrogen) , 2mM L-glutamina y 2~glml de gentamicina. Adicionalmc;:nte el medio debe contener bien el factor de crecimiento epidénnico (EGF) , preferiblemente a una concentración 20Jlg/L, el factor de básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) , preferiblemente a una concentración de 1 O~glL, o una mezcla de ambos.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un medio de cultivo (de aquí en adelante medio de cultivo de la presente invención) , adecuado para la proliferación de células madre neu:rales o precursores neurales, que comprenda ELAF en un rango de concentración de l pmol/L a 40 J.lmollL.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al uso del medio de cultivo de la presente invención para la prolifera, :::ión de células madre neurales o precursores 5 neurales.
Por último, los inventores de la presente invención han constatado como compuestos estructuralmente similares a ELAF no presentan actividad favorecedora de la proliferación de precursores neurales En este sentido, en la Fig. 4 se muestra como el compuesto 8u , 15 ~ -diacetoxi-3~ - (2-metilpropanoiloxi) -2~ H, 4u H, 9aH, lla H
latira-5E, 12E-dien-14-ona (de aquí en adelante ELAF12-1) , con número CAS 1217313-08-0 y la siguiente estructura química:
15 no es capaz de favorecer de la proliferación de precursores neurales.
Los siguientes ejemplos son merrum:nte ilustrativos de la presente invención y en ningún lugar han de entenderse como limitativos de la misma.
EJEMPLOS
20 EJEMPLO l. Efccto de 3, 12-di-O-a.eetil-8-0-tigloilingol (ELAF) sobre las células madre neurales
Se ha investigado la actividad biológica del compuesto ELAF sobre las células madre neuronales extraídas de la zona subventricular de ratones postnatales de 7 días.
2S Para ello las paredes laterales de los ventrículos laterales de la zona subventricular de ratones P7, fueron extraídas y disociadas enzimáticamente en liquido cefaloraquideo (LCR) Ca, bajo, Mg, alto (5 mM KCI, 124 mM NaCI, 3.2 mM MgCI" 100 ~M
CaCh. 26 mM NaHC03. and 10 mM glucosa) suplementado con l mglml de tripsina
y 0.2 mglml de ácido quinurénico callentado previamente a 37Q C durante 15 minutos.
Se incubó a 370 en estufa 13 minutos. El tejido fue centrifugado a 9.000 f.p.m 5
minutos y resuspendido en LCR nonnal (5 mM KCI, 124 mM NaCl. t.3 mM MgCb.
5 2 mM CaCh. 26 mM NaHC03, y 10 mM glucosa) . Fue incubado en estufa 5
minutos y centrifugado en las mismas condiciones. Luego, las células fueron
resuspendidas en Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) /F-12 (1:1)
suplementado con 0.7 mglml de ovomucoide y disgregadas mecánicamente con una
pipeta Pasteur con el diámetro reducido a la mitad, Después fueron centrifugadas
10 nuevamente y resuspendidas en 6 mI de medio definido de neuroesferas (45ml de
(DMEM) /F-12, 900 ~L de B", 2mM L-glutamina y 2~g/ml de gentamicina)
suplementado con 6 ~L de EGF 20ng/ml y bFGF lOng/mi, y mantenido a 37° en
atmósfera con 5% C~. Después de 1-2 días, los agregados celulares que se forman
son lo que llamamos neuroesferas. Los subcultivos fueron pasados cada 3-4 días por
15 centrifugación de neuroesferas y disociación mecánica de las células en l mi de
medio definido de neuroesferas; después la suspensión de células fue cultivada en
nuevos flaks con medio fresco para obtener nuevas neuroesferas. Los experimentos
se llevaron a cabo entre los pases 3 y :5.
Una vez obtenidas las neuroesferas se probó el efecto de ELAF sobre las células
20 madre neurales a distintas concentraciones. Para ello las neuroesferas fueron
centrifugadas y las células fueron resuspendidas y disgregadas en medio definido de
neuroesferas y sembradas 20 células /~L a la que se le añadieron los factores de
crecimiento EGF (20 ng/mL) y bFGF (10 ng/mL) . ELAF se añadió al mismo tiempo
poniendo en cada pocillo una concentración diferente. Se utilizaron 5 pocillos para
2S las diferentes concentraciones (Control, I ~g/ml, 5~g/ml, 1O~g/ml, 50 ~g/ml) y por
triplicado. Los experimentos se llevaron a cabo de modo que la persona que toma las
imágenes y realiza la cuantificación no conoce las condiciones de cada uno de los
cultivos. El número de nuevas neuroc:sferas foonadas fue contada 72h después en el
microscopio invertido y de contraste de fase Olympus IX70. Para medir el área de las
30 neuroesferas se obtuvieron imágenes de 50 neuroesferas por pocillo y se analizaron
empleando el sistema de análisis Image J.
Se observó cómo el área de las neuroesferas aumentaba en los cultivos tratados con
ELAF de manera dosis-dependiente hasta la concentración de 1 O~. Se observó
además que el efecto de esta concentración (1 O~M) inducía un aumento
3S estadísticamente significativo del tamaño de las neuroesferas (Figura 1 A Y B) ,
sugiriendo que a esta concentración el compuesto era capaz de facilitar la
proliferación celular. El incremento <!I1 el tamaño de las neuroesferas coincidía con
un incremento en el número total de cé1u1as en los cultivos tratados con ELAF 10JiM
"
(Figura 1 C) , apoyando la hipótesis de que el incremento en el tamaño de las neuroesferas se debía a una estimulación de la proliferación celular.
EJEMPLO 2. Efecto del inhibidor G06850 de PKC sobre el extracto de ELAF y su acción sobre las células madre neuronales.
Con el fin de confinnar si el efecto sobre el aumento en el tamaño de las neuroesferas estaba mediado por la capacidad de ELAF de estimular PKC, los precursores neurales fueron cultivados y tratados primero con el inhibidor, de las PKC clásicas y nóveles: G06850, y media hora después fueron tratadas con ELAF lO¡tM.
Para ello las neuroesferas fueron centrifugadas y las células fueron resuspendidas y disgregadas en medio definido de neuroesferas y sembradas 20 células I) lL, donde se añadieron los factores de crecimiento EGF y bFGF Y el inhibidor G06850. El compuesto 3, 12-di-O-acetil-8-0-tigloilingol (ELAF) se añadió 30 minutos después de los inhibidores, esta vez sólo se utilizó la concentración de 1O~g/ml, y por triplicado. El experimento se nevó a cabo de manera que la persona que tomaba las imágenes y realizaba la cuantificación no conocía en ningún momento las condiciones de cada uno de los cultivos. El número de nuevas neuroesferas fonnadas fue contada 72h después en el micros4:x>pio invertido y de contraste de fase 01ympus IX70. Para medir el área de las :neuroesferas se obtuvieron imágenes de 50 neuroesferas por pocillo y se analizaron empleando el sistema de análisis Image J.
Tras 72 horas se midió el área de las neuroesferas y se observó como de nuevo en los cultivos tratados con ELAF IOJ.lM el área de las neuroesferas aumentaban significativamente en comparación con el control (Figura 2A) . Sin embargo, el área de las neuroesferas de las células trat, ldas sólo con el inhibidor G06850 y con ELAF lOJ.lM en presencia del inhibidor 006850 presentaban un área incluso menor que el control, aunque la diferencia no era estadísticamente significativa.
EJEMPLO 3. Efecto de ELAF sobre el porcentaje de núcleos Ki67+. Inmunocitoguímica con anti-Ki67 para detectar células proliferantes.
Con el fin de confinnar si el incremento en el tamaño de las neuroesferas se debía a un aumento en la proliferación de los precursores neurales se realizó una inmunocitoquímica frente a Ki67 que detecta aquellos núcleos que expresan el marcador de ciclo celular Ki67 en cultivos control y en cultivos tratados con ELAF lO¡tM.
"
Para ello, una vez pasadas las 72 horas de tratamiento, se procedió a fijar las células durante 20 minutos a temperatura "ambiente con parafonnaldehido (PFA) al 4% preparado en tampón fosfato 0.1 M. Posteriormente se lavaron los pocillos 3 veces con PBS. Se permeabilizaron las células incubando 20 minutos a -20 oC con una solución de etanol/acético (95% etanol absoluto, y 5% de ácido acético glacial) . Se lavó 3 veces con PBS y posteriormente se bloqueó con una solución de BSA al 1.5% (albúmina sérica bovina) en PBS; St: incubaron durante 30 minutos. Se añadió el anticuerpo anti Ki67 y se dejó durante toda la noche a 4°C en solución de bloqueo. Al día siguiente se lavaron con PBS, se bloquearon nuevamente durante 20 minutos y se incubaron con los anticuerpos slecundarios durante 40 minutos en solución de bloqueo en oscuridad. El montaje se realizó con una solución de Electron Microscopy Science y se añadió DAPI en el momento del montaje. Se utilizó un microscopio de epifluorescencia Olympus BX60 para la cuantificación.
Se observó que el tratamiento con ELAF aumentaba el porcentaje de células en ciclo celular con núcleos Ki67+, así como el número total de células (núcleos totales teñidos con DAPI) (véase en figura 3}. La inhibición de las PKC (clásicas y nóveles) mediante el inhibidor 006850 no afectaba al número de células Ki67+ ni en presencia ni en ausencia de ELAF, aunque podía observarse un mayor porcentaje de núcleos mitóticos.
En las células tratadas con ELAF 10 ~M el porcentaje de núcleos Ki67 positivos (Figura 3) era significativamente mayor que en el control, indicando que ELAF activa la proliferación de los precursores neurales.
EJEMPLO 4. Obtención de 3, 12-di-O-acetil-8-0-tigloilingol (ELAF) a partir de Euphorbia laurifOlia.
Un extracto en acetato de etilo dellatex (100 mL) de E. laurifolia fue filtrado y el disolvente evaporado a presión reducida para proporcionar 4.0g de extracto crudo. Este crudo fue fraccionado mediante cromatografia en columna de gel de sílice, eluida con gradientes I"Tecientes dI; hl;xano:act:talu de etilo, Jo que pennitió obtener 20 fracciones de 30 mL cada una. El disolvente de la fracción 12 fue evaporado a presión reducida y el residuo resultante (25 mg) fue purificado mediante cromatografia preparativa en capa fina, empleando gel de sílice corno fase estacionaria y una mezcla hexano/acetona (9: 1, v/v) como eluyente, para proporcionar 3, 12-di-O-acetil-8-0-tigloilingol (10 mg) .
