SOPORTES PARA LA REGENERACIÓN, CRECIMIENTO Y TRASPLANTE DE CÉLULAS Y TEJIDOS
5
FINALIDAD DE LA INVENCIÓN
Tanto para utilizar células en el tratamiento de enfermedades (Terapia
Celular) , como para construir órganos o tejidos bioartificiales con fines
terapéuticos (Ingeniería Tisular) , las células suelen obtenerse en cultivos que
1O posteriormente se implantan en el constructo, tejido u órgano deseado.
Para llevar a cabo el trasplante de las células cultivadas a su destino
final se han empleado diferentes tipos de soportes (sustratos) : naturales,
sintéticos y mezclas de ambos. Para que un sustrato permita cultivar y
transportar células ha de reunir, al menos las siguientes condiciones:
15 1. No ser tóxico.
2. Ser biocompatible con las células cultivadas y con los órganos o
tejidos receptores.
3. Tener cualidades mecánicas adecuadas que permitan la
manipulación en el laboratorio y en la posterior cirugía, si la hubiera.
20 4. Poseer buena capacidad de adherencia celular.
La invención descrita en la presente memoria se refiere a unos soportes
(sustratos) que, reuniendo las condiciones anteriores, permiten la
regeneración de tejidos, el cultivo de células y su implante en los órganos o
tejidos de destino final.
25
SECTOR DE LA TÉCNICA
El invento se encuadra en el sector A61 correspondiente a Ciencias Medicas
o Veterinarias.
ESTADO ANTERIOR DE LA TÉCNICA Entre los sustratos naturales, hasta ahora utilizados, destacan los derivados del colágeno (Liu et al., 2011. lnt J Oral Maxillofac lmplants 26 104-11 0) , los
derivados de la elastina (Srivastava et al., 2011. J Biomed Mater Res A 97,
243-250) y los derivados del quitosán (Sasmazel, 2011. lnt J Biol Macromol
49, 838-846.; Zang et al., 2011. Acta Biomater 7, 3422-3431) .
Entre los sustratos sintéticos se utilizan, entre otros, diferentes tipos de
5 poliuretanos (da Silva et al., 2011. lnt J Artif Organs 34, 198-209) polímeros
de los ácidos poliláctico y coglicólico (Thomson et al., 2010. J Biomed Mater
Res A 95, 1233-1243; Zong et al., 2010. Eur Cell Mater 20, 109-120) y
polímeros de epsilon-caprolactona (Pritchard et al., 2010, Biomaterials 31,
2153-2162; Sasmazel, 2011. lnt J Biol Macromol49, 838-846.) . Estos
1º polímeros se pueden recubrir con sustancias que incrementan la
adhesividad celular o la biocompatibilidad (Li y Kawashita, 2011. J Artif
Organs 14, 163-170) ; así se han trasplantado, por ejemplo, condrocitos
utilizando soportes de colágeno (Liu et al., 2011. lnt J Oral Maxillofac
lmplants 26 104-110) o hidrogeles de heparina (Kim et al., 2011.
15 Biomaterials 32, 7883-7896) . Otro ejemplo es el trasplante de epitelio
pigmentario retiniano en el espacio subretinal utilizando láminas de
poliuretano (da Silva et al., 2011. lnt J Artif Organs 34, 198-209) , de
polietileno (Krishna et al., 2011. Br J Ophthalmol 95, 569-573) , de polímeros
derivados de la elastina (Srivastava et al., 2011. J Biomed Mater Res A 97,
20 243-250) o simplemente suspensiones celulares (Falkner-Radler et al., 2011.
Br J Ophthalmol 95, 370-375) .
Generalmente se utilizan polímeros reabsorbibles, aunque en algunas de
estas aplicaciones no es necesario que se reabsorba el soporte celular.
25 FUNDAMENTOS DIFERENCIALES DE LA INVENCIÓN.
Los soportes que se proponen en esta invención ofrecen, debido a las
cualidades físicas del titanio, metal con el que deben ser fabricados, las
ventajas de ser más delgados, resistentes, flexibles y manejables que los
conseguidos con los polímeros biosintéticos actualmente utilizados, lo que
30 facilita su uso tanto en el laboratorio como en el quirófano. Además, las
operaciones tales como perforación, corte, plegado, doblado, soldadura y mecanizado general que será necesario realizar hasta conseguir su
configuración final pueden hacerse con mayor exactitud y precisión sobre el
metal que sobre dichos polímeros biosintéticos. Los soportes de titanio
tienen el inconveniente de que no son reabsorbibles y sólo pueden utilizarse
cuando puedan permanecer en su posición de implante. No obstante esta
5 limitación tiene como contrapartida beneficiosa que al ser un material no
degradable tampoco libera metabolitos tóxicos que, en determinadas
localizaciones, por ejemplo, el interior del ojo, pueden ser muy lesivos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.
1O Como complemento de la descripción que más adelante se va a realizar y
con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características del
invento se acompañan, como parte integrante de dicha descripción, unas
figuras en las que, con carácter ilustrativo y no limitativo se representa
esquemáticamente lo siguiente:
15 Figura 1: Muestra las diferentes variantes que puede presentar la parte
básica o elemental (a) del soporte: según que su superficie esté determinada
por una placa (b) en la que se hayan practicado múltiples perforaciones,
circulares o de otras formas; por una tela metálica (e) de mallas flexibles; o
por una tela metálica (d) de mallas rígidas.
20 Figuras 2 y 3: Muestran las diferentes configuraciones que puede adoptar el
soporte en su aplicación: plano (Fig.2e) , curvado (Fig.2f) , enrollado (Fig.2g)
y en capas superpuestas (Fig.3a) ; muestran también los elementos
auxiliares, asas (i) y patillas (j) , previstas para facilitar su manipulación.
La parte básica elemental (a) del soporte se representa, para simplificar las
25 figuras, delimitada por un rectángulo dada la imposibilidad de una mayor
concreción puesto que la forma última a dar al soporte deberá adecuarse,
como más adelante se explicará, a la forma que, en cada caso particular,
presente la zona de tejido receptora del implante.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.
30 El objeto de la invención es un soporte (sustrato) para la regeneración,
crecimiento y trasplante de células y tejidos que consiste en un dispositivo (Fig.1) con la estructura básica de una criba cuya "superficie cribante", a la
que en lo sucesivo denominaremos indistintamente con los términos
"soporte" o "superficie soporte" (Fig.1 a) , puede presentar las tres siguientes
variantes de enrejado:
1a Variante: Estar constituido por una placa metálica de pequeño espesor en
5 la que se han practicado perforaciones, de distintas formas y tamaños, más
o menos separadas entre sí (Fig.1b) .
2a Variante: Estar constituido por una tela metálica formada por barras o
hilos entrecruzados que al estar organizados según el sistema textil de trama
y urdimbre determinan mallas con forma de paralelogramos rectángulos que
1º no son totalmente rígidas por lo que confieren al soporte una flexibilidad y
deformabilidad que, en determinados casos, se consideran propiedades muy
deseables (Fig.1 e) .
3a Variante: Estar constituido por dos conjuntos, superpuestos y en contacto,
de barras o hilos paralelos separados entre sí (rejillas) de forma que los
15 componentes de uno de los conjuntos se cruzan ortogonalmente con los del
otro y que en los nudos o puntos de cruce se unen firmemente
determinando una tela metálica, de mallas rígidas con forma de
paralelogramo rectángulo (Fíg.1d) .
Cada una de estas variantes da lugar a la aparición de las correspondientes
20 zonas de huecos y zonas de macizos en la superficie soporte (Fig.1 a) . A su
vez esta superficie puede adoptar distintas configuraciones: plana (Fig.2e) ,
curvada (Fig.2f) o cilíndrica (Fig.2g) según las necesidades exigidas por las
distintas aplicaciones prácticas a que se destine. El soporte está definido en
todos los casos por sus parámetros característicos, que son las dimensiones
25 y disposición de las perforaciones, mallas, hilos y barras, de la placa o telas
metálicas que lo constituyan y de sus valores, dependerá la relación
existente entre las áreas de la zona de huecos y la zona de macizos.
Tanto si se trata de una placa perforada como de una tela metálica flexible o
rígida se preconiza como material para su construcción el titanio.
30 El titanio puro o sus diferentes aleaciones se emplean en Medicina y
Veterinaria profusamente, por ejemplo, en las prótesis de las articulaciones de la cadera y rodilla, para sustituir placas óseas, para implantes dentales,
etc. Este metal carece de toxicidad y una vez implantado, forma en su
superficie una capa de oxido que es biocompatible con células y tejidos y no
produce reacciones de rechazo. Además de este buen comportamiento
biológico el titanio reúne unas excelentes propiedades físicas de dureza,
5 ductilidad, maleabilidad, flexibilidad, ligereza, resistencia mecánica y
resistencia a la corrosión, de forma que siendo el metal más utilizado en
Medicina y Veterinaria sus buenas cualidades hacen que se adopte también
como idóneo para su empleo en la fabricación de los soportes objeto del
invento, permitiendo que en su diseño puedan tenerse cuenta tanto las
1º necesidades propias de la manipulación en el laboratorio como las
derivadas de las operaciones de implantación final sobre el tejido a
regenerar. A las propiedades anteriormente expuestas se une la facilidad de
poder fabricarlos a partir de semielaborados de titanio que existen en el
comercio (barras, hilos o placas) a los que pueden aplicarse los
15 procedimientos de mecanizado y manufactura habituales en los trabajos de
mecánica de alta precisión.
El acabado superficial que presenten los macizos del soporte (barras, hilos
o placas) puede ser liso o presentar diferentes tipos de rugosidades, e
incluso estar recubiertos con substancias específicas dirigidas a influir en el
20 comportamiento de las células en orden a favorecer su adherencia,
proliferación y diferenciación. Las propiedades mecánicas del titanio:
flexibilidad, ductilidad y maleabilidad antes aludidas, permiten diversas
soluciones en la aplicación práctica de cada una de las variantes previstas
para el invento. Así pueden realizarse implantes con soportes que siendo
25 planos en su origen (Fig.2e) pueden modificarse curvándolos (Fig.2f) en
mayor o menor grado buscando una mejor adaptación a la forma o perfil del
tejido a regenerar; esta capacidad de adaptación está especialmente
presente en los soportes constituidos por una tela metálica de mallas
deformables; en otros casos es posible la realización de implantes formados
30 por cierto número de capas estratificadas de células utilizando varios
soportes elementales (Fig.2e) superpuestos (Fig.3) que contuvieran, respectivamente, distintos cultivos de células que podrían tener iguales o
diferentes características, por ejemplo las necesarias para regenerar la
pared de un vaso sanguíneo; en estos casos los soportes elementales
superpuestos empleados estarán provistos con separadores o patillas (Figs.
1j, 2j, 3j) que materialicen entre aquellos el espacio libre necesario para el
5 cultivo de las células y para facilitar la diferenciación entre las mismas
cuando esta condición sea exigible; de la misma forma anterior utilizando un
número suficiente de soportes elementales superpuestos (fig.3) pueden
realizarse cultivos tridimensionales de células, implantables como un órgano
sólido; para resolver ciertos problemas, por ejemplo en la regeneración de
1 O un nervio seccionado, se puede utilizar un soporte elemental al que, por
enrollamiento, se le haya dado una configuración tubular cilíndrica (Fig.2g)
de forma que en su interior se introducirían los dos cabos del nervio y el
tubo soporte actuaría como puente sustentador entre los cabos distal y
proximal del nervio, posibilitando su regeneración axonal.
15 Para facilitar la manipulación de los soportes y su fijación mediante sutura a
la zona de tejido destinataria del implante se les puede dotar con elementos
accesorios auxiliares tales como pequeñas asas (Figs.1 i, 2i, 3i) con formas
adecuadas a la función perseguida; igualmente, si fuera necesario
establecer separaciones entre distintos soportes superpuestos se les puede
20 dotar con patillas (Figs.1j, 3j) a las que anteriormente ya se hizo referencia;
estos accesorios auxiliares, cuyo número y situación en el soporte depende
de las particularidades de cada caso concreto, están constituidos por
expansiones de la propia superficie soporte y se les puede dar la disposición
final mediante una sencilla operación de doblado, ejercitada en el grado
25 conveniente cuando, durante el proceso de manipulación, se considere
necesario.
DESCRIPCIÓN DEL MODO DE EMPLEO DE LA INVENCIÓN
Una vez elegida la variante de soporte a utilizar su forma de empleo es la
30 que a continuación se describe:
En el fondo de una placa de cultivo se coloca la porción de soporte que se considere necesaria en forma y tamaño; sobre la misma se realizará la
"siembra" de las células que se desea cultivar; éstas, al multiplicarse,
formarán una colonia adherida a la superficie soporte que cubrirá sus
macizos (hilos, barras y porción de placa existente entre sus perforaciones)
y sus huecos (mallas flexibles o rígidas de la tela metálica y perforaciones de
5 la placa) aunque, según las circunstancias, estos huecos podrían estar
vacíos o solo parcialmente llenos. Cuando el cultivo de células alcance una
confluencia de aproximadamente el 70% de la superficie o cuando se
considere conveniente para cada caso concreto, el soporte se levantará de
la placa de cultivo y se aplicará sobre el tejido destinatario del implante con
1º las células cultivadas que transporte las cuales podrán seguir
multiplicándose y desplazándose para llenar los huecos si todavía no lo
estuvieran, hasta conseguir el recubrimiento celular completo de la superficie
soporte.
Como ya se dijo, el tipo de enrejado del soporte puede seguir patrones
15 diferentes: placas con perforaciones circulares o de cualquiera otra forma
(Fig.1b) , telas con trama y urdimbre con mallas flexibles con forma de
paralelogramos (Fig.1 e) , o telas con mallas rígidas (rejillas) con forma de
paralelogramos rectángulos (Fig.1 d) ; en cada uno de estos patrones las
dimensiones de los macizos y de los huecos (parámetros del soporte) se
20 decidirán en función del tamaño y capacidades de adhesividad y
proliferación de las células que se necesite cultivar y trasplantar así como en
función de las características del receptor destinatario del trasplante; la
acertada elección de los valores de estos parámetros es fundamental ya que
de los mismos depende que las células que se hallan adheridas a los
25 macizos, al desplazarse y crecer en los huecos del soporte puedan, si éstos
son adecuadamente amplios, entrar en contacto directo con el tejido a
regenerar sin que exista interposición de ningún material exógeno o que, por
el contrario, si son adecuadamente pequeños, permitan el paso de
metabolitos pero no de células, que en este caso quedarían separadas del
30 tejido subyacente destinatario del trasplante por el propio soporte; en función
de los resultados que se quieran obtener puede ser necesario favorecer una u otra de estas dos opciones.
La porción de superficie soporte que se utilice en un implante se obtendrá
normalmente recortándola de un trozo mayor y ni su tamaño ni su forma
pueden concretarse aquí ya que uno y otra dependerán de las necesidades
exigidas para cada aplicación concreta, que serán función de:
5 A) Las características formales y dimensionales de la zona de tejido
receptor del implante.
8) Las características específicas de las células a implantar, tales como:
tamaño, adhesividad, tasa de reproducción, etc.
C) Las características mecánicas de resistencia y flexibilidad del soporte que
1 O sean necesarias para llevar a cabo las manipulaciones a que haya de ser
sometido en el laboratorio de cultivo y en las posteriores maniobras
quirúrgicas si las hubiere.
Se insiste en que la forma del soporte se elegirá, fundamentalmente,
teniendo en cuenta la de la zona receptora; así, las porciones de superficie
15 soporte en ocasiones podrán ser circulares, ovaladas o poligonales pero en
otras deberán adoptar formas totalmente irregulares; por ejemplo, en el
espacio subretiniano podrían ser circulares y sus dimensiones variar entre
muy pocos milímetros en tanto que cuando se trate de superficies a
regenerar relativamente extensas, por ejemplo pertenecientes a cartílagos
20 articulares, se podrían utilizar superficies soporte cuadradas, rectangulares o
con formas irregulares de varios centímetros.
A su vez, las características A) , 8) y C) anteriores determinarán los valores
de los parámetros (dimensiones de huecos y macizos) que afectan a la
superficie soporte que, según el tipo de enrejado que se utilice, serán:
25 a) Las dimensiones de las perforaciones (huecos) , que pueden variar entre 3
y 40 o más micrómetros y la separación entre las mismas (macizos) que
puede variar entre 1 O y 40 o más micrómetros si se utiliza una placa
perforada (Fig.1 , b) .
b.) Las dimensiones de las mallas (huecos) y las de los hilos y barras
30 (macizos) si se utilizan telas metálicas de mallas flexibles (Fig.1c) o de
mallas rígidas (Fig.1d) ; sus valores serán parecidos a los citados para las placas perforadas; así el tamaño de las mallas puede variar entre 3 y 40 o
más micrómetros y el diámetro de los hilos o anchura de las barras puede
ser de 5 ó más micrómetros.
Tanto los parámetros del enrejado como la proporción entre los valores de
las áreas de huecos y macizos, que puede oscilar entre un 40% y un 80%,
5 se fijarán para cada caso concreto en función de las características del tejido
receptor del trasplante y de las características de las células a trasplantar.
EJEMPLO PRÁCTICO DE APLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Como ejemplo práctico de aplicación de la invención se ha realizado un
1º cultivo de células madre del tejido adiposo de rata sobre soportes de titanio
estériles. Estos soportes, de 3 mm. de diámetro y 18 micrómetros de
espesor tenían un patrón de enrejado cuadrado, formado por barras de 21
micrómetros de anchura con un espacio ente barras de 38 micrómetros. Las
barras eran de superficie lisa sin recubrir. Las células, que después de
15 obtenidas habían sido congeladas para su conservación, fueron
descongeladas y sembradas sobre el soporte colocado en una placa de
cultivo de 3cm. de diámetro. El medio de cultivo fue Medio de Eagle
Modificado por Dulbeco (DMEM) suplementado con el 10% de suero bovino
fetal y con antibiótico y antimicótico; tras 2 días de cultivo se tomaron los
20 soportes y se trasplantaron a otra placa de cultivo con el mismo medio de
cultivo; transcurridos otros 3 días las células habían rellenado los huecos del
soporte de trasplante extendiéndose por la placa de cultivo y colonizando los
alrededores del soporte.
El invento no está estrictamente limitado a las formas de ejecución descritas
25 sino que comprende cualquiera otra variante
El material empleado utilizado en los soportes objeto de este invento es el
metal titanio y los procedimientos para su fabricación son los habitualmente
empleados en la manufactura mecánica de elementos que requieren un
alto grado de exactitud y precisión.
30
