USO DE OXILIPINAS Y SUS DERIVADOS COMO AGENTES ANTIINFLAMATORIOS
La presente invención se refiere al uso de ácidos grasos monohidroxilados, así como al uso de fracciones, extractos o biomasa de microalgas que contienen dichos ácidos, para su empleo como antiinflamatorios y quimiopreventivos en la enfermedad inflamatoria intestinal. Por tanto, la presente invención podría englobarse dentro del sector farmacéutico.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las oxilipinas son un conjunto de moléculas estructuralmente muy diversas que derivan de la oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) . Estos metabolitos se encuentran en animales, plantas, algas, bacterias y hongos, y generalmente actúan en rutas de señalización relacionadas con diversas respuestas a factores ambientales y patológicos. Un tipo de oxilipinas son los ácidos grasos que incorporan uno o varios grupos hidroxilo en su estructura (ácidos grasos hidroxilados, hidroxiácidos) .
Las oxilipinas en general, y los ácidos grasos hidroxilados en particular, presentan importantes actividades biológicas en animales superiores y humanos.
Se ha demostrado que diversos ácidos mono-, di-o trihidroxilados, formados a partir de los ácidos eicosapentaenoico (C20:5 n-3; EPA) y docosahexaenoico (C22:6 n-3; DHA) , poseen una potente actividad antiinflamatoria e inmunoreguladora. Estos derivados altamente bioactivos, también conocidos como resolvinas y docosatrienos, son considerados responsables de varios de los efectos beneficiosos de los ácidos EPA y DHA en la prevención y tratamiento de enfermedades
inflamatorias y cardiovasculares. En los últimos años se han presentado
diversas patentes que describen una variedad de derivados hidroxilados
de los ácidos araquidónico (C20:4 n-6; ARA) , EPA y DHA, las rutas a
través de las que se forman, así como métodos para su obtención y uso
5 en el tratamiento de procesos inflamatorios (US2006/0293288) .
El ácido 13-hidroxioctadecatrienoico (13-HOTE) deriva de la oxidación del
ácido a-linolénico (C18:3 n-3; ALA) y se ha detectado en el plasma
humano, si bien su función fisiológica no está establecida. Se ha propuesto
1O la potencialidad del 13-HOTE como agente antiinflamatorio en el
tratamiento de osteoartritis y artritis reumatoide, dada su capacidad para
suprimir in vitro la expresión de metaloproteinasas de matriz inducida por
interleukina-113 (Schulze-Tanzil et al. 2002, Histol. Histophatol. 17: 477
485) .
15
En humanos, la oxidación del ácido linoleico (C18:2 n-6; LA) está mediada
predominantemente por la 15-lipoxigenasa-1 (15-LOX-1) para originar el
ácido 13-hidroxioctadecadienoico (13-HODE) , una oxilipina que ha
demostrado poseer numerosos efectos fisiológicos. El ácido (13S) -HODE
20 es un ligando natural de los PPARs (peroxisome proliferator-activated
receptors) , factores de transcripción que están implicados en patologías
como obesidad, diabetes y cáncer. A través de la interacción con los
PPARs, 13-HODE induce apoptosis en líneas de células de cáncer de
colon HCT -116 (Zuo et al. 2006, Oncogene 25: 1225-1241 ) . Por otro lado,
25 se ha demostrado que el ácido 13-HODE presenta efectos
antitumorigénicos en cáncer colorrectal y que el aumento en la expresión
de la 15-LOX-1 (enzima que genera 13-HODE) disminuye la proliferación y
la capacidad de emigración en las líneas celulares de carcinoma colorrectal
HCT-116 y HT-29 (<;imen et al. 2009, Cancer Sci. 100: 2283-2291) . Así
30 mismo, se ha descrito que el ácido 13-HODE modula la proliferación cutánea y que su aplicación tópica revierte la hiperproliferación epidérmica
inducida (Ziboh et al. 2000, Am. J. Clin. Nutr. 71: 3615-3665) . En los
últimos años se han publicado diversas patentes incluyendo aquellas
relacionadas con la utilización del ácido 13-HODE como marcador para
evaluar el stress oxidativo en mamíferos (W02005/059566) o su uso tópico
5 para el tratamiento de trastornos oculares (WO 2006/065916A 1 ) .
En relación con otros ácidos hidroxilados C18, se ha presentado (a) una
solicitud de patente sobre la obtención y uso como agentes
antiinflamatorios y antineurodegenerativos de derivados mono o
1O dihidroxilados del ácido estearidónico (C18:4 n-3; SDA) y del ácido y
linolénico (C18:3 n-6; GLA) , como los ácidos 10-hidroxi SDA o 7-hidroxi
GLA (US2007/0248586A1) ; (b) una solicitud patente sobre el uso de
ácidos grasos hidroxilados C18 y C20, como el (9S) -HODE, (8S) -HETrE o
(8S) -HEPE, para la preparación de medicamentos aplicables a la
15 neutralización terapéutica de un fármaco de tipo organoboronato
(W02006/059083) ; (e) una solicitud de patente sobre una composición
biológicamente activa que contiene, entre otros principios, el ácido 9-
HOTE (W02006/01 0560A2) .
20 Actualmente algunas empresas de productos químicos finos
comercializan una gama de derivados hidroxilados de ácidos grasos de
18 a 22 carbonos, incluyendo los ácidos 13-HOTE y 13-HODE, para su
uso en estudios bioquímicos (ej. Cayman Chemical Company, USA) .
25 En lo que respecta a los métodos de obtención de éstos ácidos, se ha
descrito una síntesis estereoselectiva del ácido (13S) -HOTE, y varios
métodos de síntesis del ácido (13S) -HODE, así como la preparación de
este compuesto a través de la oxidación enzimática del LA. Más
recientemente se ha presentado una solicitud de patente sobre la
30 obtención de 13-HODE mediante una síntesis que implica la oxidación del LA con lipoxigenasa de maíz (W02008/133398A 1 ) .
Las microalgas son un grupo de organismos unicelulares, tanto procariotas como eucariotas, que se encuentran en ambientes acuáticos terrestres y marinos, y que en su mayoría son fotosintéticos. Su enorme biodiversidad, composición química, cortos tiempos de generación y la posibilidad de cultivo industrial hacen que las microalgas sean potencialmente una fuente muy interesante de productos con aplicaciones en la industria alimentaria, cosmética y farmacéutica.
Son escasos los datos sobre oxilipinas de microalgas. Se ha descrito el aislamiento de hidroxiácidos en las microalgas de la clase Cyanophyceae Lygnbya majuscu/a (ácido malyngico) , Anabaena flos-aquae f. flos-aquae (9R-HOTE y 9R-HODE) , Osci/latoria redeki HUB 051 (9-HODE y 13-HODE) y Nostoc sp. PCC7120 (9R-HOTE y 9R-HODE) y en la microalga de la clase Chlorophyceae Dunaliella acidophila (12R-HOTE y 9S-HOTE) . Por otro lado, en diatomeas (Bacilliarophyceae) se ha identificado una variedad de oxilipinas, principalmente aldehídos poliinsaturados, implicados en la defensa química de estas microalgas.
La única referencia sobre el uso de fuentes naturales para la obtención de ácidos grasos hidroxilados aislados, o aceites que contengan dichos ácidos, se refiere a derivados del ácido estearidónico (SDA) o del ácido ylinolénico (GLA) (US 2007/0248586A 1 ) . Esta solicitud de patente incluye el uso de animales, plantas y microorganismos para la obtención de aceites que contengan oxilipinas. En lo que respecta a microorganismos, dicha patente incluye el uso de determinadas especies de microalgas (ej. especies del género Scenedesmus) así como su manipulación genética (ej. especies del género Cr y pthecodinium) .
No se han encontrado datos sobre el uso de microalgas como fuente de oxilipinas derivadas de los ácidos a-linolénico y/o linoleico en general y de los hidroxiácidos 13-HOTE y 13-HODE en particular.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
5 1O Los autores de la presente solicitud han encontrado: (a) que diversas especies de microalgas cultivadas de la clase Chlorophyceae y Trebouxiophyceae contienen las oxilipinas (13S, 9Z, 11 E, 15Z) -13-hidroxioctadeca-9, 11, 15-trienoico [ (13S) -HOTE] y/o (13S, 9Z, 11 E) -13-hidroxioctadeca-9, 11-dienoico [ (13S) -HODE], (b) que estos compuestos presentan actividad in vitro como agentes antiinflamatorios, y (e) que la administración a modelos animales de un preparado basado en microalgas que contienen las citadas oxilipinas atenúa los daños de la enfermedad inflamatoria intestinal.
15 20 De acuerdo con ello, la presente invención se refiere al uso de los ácidos 13-HOTE y/o 13-HODE y compuestos derivados de los mismos, así como de fracciones, extractos o biomasa de las microalgas que los contienen, en la preparación de composiciones dietéticas o farmacéuticas para su empleo en el tratamiento y/o prevención de procesos inflamatorios en general, y de la enfermedad inflamatoria intestinal en particular.
25 Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula general (1) (a partir de ahora compuesto de la invención) :
(1)
30 donde: == representa un enlace doble o simple; R1 se selecciona de la lista que comprende hidrógeno, un grupo
alquilo (C1-C1º) , alquenilo (C2-C1º) , alquinilo (C2-C10) o acilo; y R2 se selecciona de entre hidrógeno o un grupo alquilo (C1-C1º) ,
o cualquiera de sus sales o esteroisómeros farmacéuticamente aceptables, para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de enfermedades inflamatorias del tracto digestivo.
Cuando representa un enlace doble la fórmula general sería la siguiente (la) :
(la) Cuando == representa un enlace sencillo la fórmula general sería la siguiente (lb) :
(lb)
El enlace ondulado en las fórmulas indica que la configuración de ese carbono puede ser Ro S, o una mezcla racémica.
Los compuestos de la presente invención, representados por la fórmula (1) , descrita anteriormente pueden incluir cualquiera sus sales, éster, solvato o sus esteroisómeros, en particular cualquiera de sus enantiómeros (R ó S) o una mezcla racémica.
El término "sales farmacéuticamente aceptables " se refiere a cualquier sal farmacéutica o cualquier otro compuesto que, siendo administrado a un receptor, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto descrito en el presente documento. Sin embargo se observará que las sales farmacéuticamente inaceptables están también en el ámbito
de la invención ya que estas últimas pueden ser útiles en la preparación
de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales,
estereoisómeros y derivados pueden ser llevadas a cabo por medio de
métodos conocidos en la materia.
5
El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a cadenas
hidrocarbonadas saturadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 1 O
átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo,
terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Preferiblemente el grupo
1 O alquilo tiene entre 1 y 6 átomos de carbono. Los grupos alquilo pueden
estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como
alquinilo, alquenilo, halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo,
acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro o mercapto.
15 El término "alquenilo" se refiere, en la presente invención, a cadenas
hidrocarbonadas insaturadas, lineales o ramificadas, que tienen de 2 a 1 O
átomos de carbono, preferiblemente de 2 a 6, y que contienen uno o más
enlaces carbono-carbono dobles y que opcionalmente puede contener
algún enlace triple, por ejemplo, vinilo, 1-propenilo, alilo, isoprenilo, 2
20 butenilo, 1 , 3-butadienilo, etc. Los radicales alquenilo pueden estar
opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como alquilo,
alquinilo, halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo,
alcoxicarbonilo, amino, nitro o mercapto.
25 El término "alquinilo" se refiere a cadenas hidrocarbonadas, lineales o
ramificadas, de 2 a 1 O átomos de carbono, preferiblemente de 2 a 6, y que
contienen al menos uno o más enlaces carbono-carbono triples y que
opcionalmente puede contener algún enlace doble, por ejemplo, etilino,
propinilo, butinilo, etc. Los radicales alquinilo pueden estar opcionalmente
30 sustituidos por uno o más sustituyentes tales como alquilo, alquenilo, halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino,
nitro o mercapto.
El término "grupo acilo" se refiere a una cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, saturada o insaturada, en la que el primer carbono de la cadena es un grupo carbonilo, es decir, el grupo acilo tiene como fórmula -CO-R', siendo R' un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo según se ha descrito anteriormente.
En una realización preferida de la presente invención, R1 es hidrógeno. En otra realización preferida de la presente invención, R2es hidrógeno. 10 En una realización más preferida R1 y R2 son hidrógeno.
En una realización aún más preferida los compuestos de la invención son los siguientes: (13S, 9Z, 11 E, 15Z) -13-hidroxioctadeca-9, 11, 15-trienoico 15 [ (13S) -HOTE]
OH y (13S, 9Z, 11 E) -13-hidroxioctadeca-9, 11-dienoico [ (13S) -HODE] C02H
OH
Estos compuestos antiinflamatorios de la invención pueden obtenerse a partir de ciertas especies de microalgas mediante extracción de la biomasa con disolventes orgánicos. El extracto puede separarse mediante técnicas cromatográficas y obtenerse fracciones que contienen los compuestos antiinflamatorios. Dependiendo de los pasos de purificación,
25 puede llegarse a la obtención de los compuestos puros. Por ejemplo el compuesto (13S) -HOTE se ha obtenido a partir de la biomasa seca de la microalga Chlamydomonas debar y ana. El compuesto aislado presenta una alta actividad como inhibidor de la producción de TNF-a, una importante citoquina proinflamatoria.
5 El agente antiinflamatorio puede usarse en forma pura o bien como un constituyente de un extracto o de una composición basada en la biomasa de microalgas, típicamente un extracto o composición de biomasa donde la concentración del agente antiinflamatorio es conocida a fin de que se pueda controlar la dosis. Además, otros componentes presentes en el extracto o la biomasa pueden reforzar los efectos del compuesto antiinflamatorio.
1 O Por tanto, otra realización de la presente invención se refiere al uso del compuesto de formula (1) , según se ha descrito anteriormente, en una forma pura o en un extracto o biomasa de microalgas.
15 Por "compuesto en una forma pura" o "compuesto puro" se entiende al compuesto obtenido a partir de un extracto natural mediante sucesivas etapas de purificación o bien sintetizado químicamente por métodos conocidos por un experto en la materia.
20 Por "biomasa de microalgas" se entiende a un material obtenido tras separación de la masa de microalgas del medio de cultivo y posterior secado.
25 30 Por "extracto de microalgas" se entiende la mezcla de compuestos orgánicos, entre los que se encuentran los compuestos de la invención, obtenida por tratamiento de la biomasa seca de microalgas con disolventes orgánicos, preferiblemente metanol, seguido de la evaporación del disolvente. Por extracto también consideramos una fracción del mismo, es decir, por "Fracción" se entiende una mezcla de compuestos orgánicos obtenida por separación de un extracto mediante técnicas cromatográficas.
En una realización preferida, las microalgas son de la clase Chlorophyceae o Trebouxiophyceae. Más preferiblemente son del género Chlamydomonas, Nannochloris o Chlorella y aún más preferiblemente de las especies Chlamydomonas debar y ana o Ch/orella sorokiniana.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de microalgas de la clase Chlorophyceae, preferiblemente del género Chlamydomonas, más preferiblemente de la especie Chlamydomonas debar y ana, para la obtención del compuesto de fórmula general (1) descrito anteriormente.
Otro aspecto más de la presente invención se refiere al uso de microalgas de la clase Trebouxiophyceae, preferiblemente de los géneros Nannoch/oris o Chlorella, más preferiblemente de la especie Chlorella sorokiniana para la obtención del compuesto de fórmula general (1) anteriormente descrito.
Los compuestos de la invención, como se demuestra en los ejemplos se pueden utilizar como agentes antiinflamatorios.
Por "enfermedades inflamatorias del tracto digestivo" se refiere a enfermedades que cursan con procesos inflamatorios agudos y/o crónicos, de intensidad elevada o leve, producidas en el tracto digestivo, considerando como tal al sistema de órganos capaces de la ingestión, la digestión, la absorción y la excreción de alimentos en un animal, en especial en un humano. Estas enfermedades están particularmente asociadas a trastornos inmunológicos.
En particular por "enfermedades inflamatorias intestinales" se refiere en la presente invención a las que se producen en el tracto digestivo, especialmente en el intestino delgado y grueso, y que puede provocar una gran cantidad de síntomas en el individuo que lo padezca, como por ejemplo pérdidas de peso, sangre en heces y/o diarreas, entre otros, que conllevan a un deterioro considerable en su calidad de vida. Estas enfermedades se pueden seleccionar de entre, aunque sin limitarse a, colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
Además, en base a evidencias recientes que demuestran el desarrollo de ciertos procesos tumorales como consecuencia de patologías inflamatorias previas mal controladas, incluyendo le enfermedad inflamatoria intestinal y el cáncer colorrectal, los compuestos de la invención se pueden utilizar para la prevención del cáncer de colon.
Independientemente de la forma en la que se encuentre, puro o en un extracto o biomasa de microalgas, pero en particular cuando se trate del compuesto puro, el compuesto de la invención se formula para facilitar su aplicación y biodisponibilidad, preferiblemente con portadores o excipientes aceptables farmacéuticamente.
El compuesto de la invención puede ser utilizado con otros ingredientes activos o fármacos que potencien los efectos antiinflamatorios o que ofrezcan otros beneficios adicionales. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o pueden ser proporcionados en una composición separada para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
Además, el compuesto de la invención puro o un extracto o una composición basada en la biomasa se puede formular sólo o con otros ingredientes, en la forma de polvos, gránulos, pastillas, suspensiones, disoluciones o emulsiones que pueden contener otros compuestos habitualmente usados en el ámbito de la preparación de este tipo de productos.
La dosificación del compuesto de la invención variará de acuerdo con la formulación particular, la condición inflamatoria específica a tratar y el modo de aplicación.
A lo largo de la presente descripción, el término "tratamiento" se refiere a eliminar, reducir o disminuir la causa o efectos de la enfermedad. Para los propósitos de esta invención, tratamiento incluye, aunque sin quedar limitados a los mismos, aliviar, disminuir o eliminar uno o más síntomas de la enfermedad; reducir el grado de enfermedad, estabilizar (es decir, no empeorar) el estado de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, aliviar o mejorar el estado de la enfermedad y remitir (ya sea total o parcial) .
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (1) descrito anterioremente y en cualquiera de sus formas, como aditivo en alimentos funcionales o complementos alimentarios o dietéticos.
De esta manera, los compuestos descritos en la presente invención se pueden utilizar, además de en composiciones farmacéuticas, en alimentos (incluidos los etiquetados como funcionales o nutraceúticos) o en complementos alimentarios o dietéticos no sólo para prevenir la aparición de procesos inflamatorios sino también para mejorar las defensas del organismo como parte del sistema inmune.
En la presente invención se entiende como "alimento funcional" a un alimento o complemento alimenticio incluidos los llamados "nutracéuticos", que posee un efecto beneficioso sobre la salud.
Por "complementos alimentarios o dietéticos" se refieren a composiciones no alimenticias, es decir, que no son alimentos, pero que aportan a la dieta un efecto beneficioso sobre la salud, dichos complementos pueden
contener otro tipo de suplementos como vitaminas, antioxidantes, entre otros. Estas composiciones pueden ser administradas de la misma forma que lo descrito para las composiciones farmacéuticas.
5 Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un alimento funcional o un complemento alimentario o dietético que comprende un compuesto de fórmula (1) según se ha descrito en la presente invención y en cualquiera de sus formas.
1O 15 A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Ejemplos
20 A continuación, la invención se ilustrará mediante una serie de ensayos realizados por los inventores.
EJEMPLO 1
25 Este ejemplo ilustra cómo se han aislado los ácidos 13-HOTE y 13-HODE a partir de microalgas y los métodos utilizados para su identificación.
30 Materiales y métodos La cromatografía en columna se realizó con silica gel Merck (70-230 ¡Jm) . Las separaciones en HPLC se realizaron en un equipo LaChrom-Hitachi con columnas LiChrospher Si-60 (Merck) y un detector de UV L-7400. Los disolventes utilizados eran de calidad para su uso en HPLC. Los
espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Varian INOVA 600
utilizando CD300 como disolvente. Los desplazamientos químicos se
referenciaron respecto a la señal del disolvente (<>H 3.30 y <>e 49.0) . Los
espectros COSY, HSQC, HMBC, and NOESY se realizaron utilizando las
5 secuencias de pulsos estándar de Varian.
Extracción y aislamiento de productos
La biomasa seca de la microalga Chlamydomonas debar y ana se extrajo
con una mezcla 1:1 de acetona-metano!. Tras la evaporación del
1O disolvente a presión reducida, el extracto obtenido se sometió a
separación mediante cromatografía en columna de gel de sílice eluida con
mezclas de hexano-dietil éter de polaridad creciente y posteriormente con
mezclas de cloroformo metanol de polaridad creciente. Las fracciones
elu idas con dietil éter y con cloroformo-metano! (9: 1 y 8:2) se
15 suspendieron en metanol-agua (9:1) y se pasaron a través de cartuchos
RP-18. La disolución obtenida se evaporó a presión reducida y la mezcla
resultante se separó mediante HPLC en fase normal utilizado como
eluyente mezclas de cloroformo-metano! o hexano-isopropanol-ácido
acético hasta la obtención de los compuestos puros.
20
Identificación de compuestos
El ácido (13S) -HOTE se identificó a partir de los espectros de 1H-RMN y
13C-RMN (Tabla 1) , COSY, HSQC, HMBC y NOESY. La configuración
absoluta en C-13 se estableció a partir del valor de la rotación óptica
25 (Yadav et al. 1992, Tetrahedron 58: 4465-4474) .
El ácido (13S) -HODE se identificó a partir de los espectros de 1H-RMN y
13C-RMN (Tabla 2) , COSY, HSQC, HMBC y NOESY. La configuración
absoluta en C-13 se estableció a partir del valor de la rotación óptica
30 (Yadav et al. 1992, Tetrahedron 58: 4465-4474) .
Tabla 1. Datos de 1H y 13C-RMN del ácido 13-HOTE (600 MHz, CD30D)
te 613Cm 61H (m, Jen Hz) IC fi13Cm fi1H (m, J en Hz)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1n.1s 35.0t 26.1 t 30.1* t 30.2* t 30.3* t 30.7 t 28.6t 133.0d 2.27 (t. 7.4) 1.59 (m) 1.32 (m) 1.32 (m) 1.32 (m) 1.38 (m) 2.19 (dl7.7, 7.7) 5.40 (dl10.7, 7.7) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 129.3 d 126.6 d 136.7 d 73.3d 36.3t 125.5 d 134.6 d 21.7 t 14.5c 5.96 (dd, 10.9, 10.9) 6.49 (dd. 15.3, 11.0) 5.63 (dd, 15.3, 6.6) 4.10 (dt, 6.4, 6.4) 2.29 (m) , 2.24 {m) 5.35 (dtt, 10.7, 7.3, 1.5) 5.45 (dtt. 10.7, 7.3, 1.6) 2.05 (de. 7.5, 7.5) 0.95 (t. 7.5)
*Asignaciones intercambiables Tabla 2. Datos de 1H y -13C-RMN del ácido 13-HODE (600 MHz, CD30D)
#C 613Cm fi1H (m, Jen Hz) #C 613Cm 6 1H (m, J en Hz)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 177.7 S 35.0t 26.1 t 30.1* t 30.2* t 30.3* t 30.7t 28.6t 132.9d 2.27 (t. 7.5) 1_59 (m) 1.30 (m) 1.30 (m) 1.::10 (m) 1.:39 (m) 2.18 (dt. 7.5, 7.5) 5.40 (dt. 10.8, 7.8) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 129.4 d 126.5 d 137.3 d 73.4 d 38.4t 26.3t 33.0t 23.7t 14.4 e 5.97 (dd, 11.1, 11.1) 6.48 (dd, 15.2, 11.0) 5.60 (dd, 15.1, 6.8) 4.07 (dt. 6.4, 6.4) 1.52 (m) . 1.46 (m) 1.30 (m) 1.30 (m) 1.30 (m) 0.90 (t. 7.0) •Asignaciones intercambiables EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra la actividad de los compuestos puros en ensayos de actividad antiinflamatoria in vitro.
Metodología Las células del sistema inmune responden a diversos estímulos secretando una gran cantidad y diversidad de citoquinas. En el proceso inflamatorio, entre estas citoquinas destaca el TNF-a, que tiene un papel fundamental en las fases más tempranas del proceso (Popa et al. 2007, J. Lipid Res.
48: 751-762) .
La medida de la actividad antiinflamatoria se realizó sobre la línea de leucemia monocitaria humana THP-1, tras inducir su diferenciación a macrófagos con acetato-miristato de forbol (PMA) 0.2 J..tM, y estimulando la producción de citoquinas, durante 24h, con lipolisacárido (LPS) a una concentración de 1 J..tg ml-1. A las células diferenciadas se les adicionaron los compuestos puros 13-HOTE y 13-HODE obtenidos de microalgas (ejemplo 1) a una concentración de 50 J..tM, concentración que no es citotóxica para THP-1. La producción de TNF-a se cuantificó por enzimoinmunoanálisis (ELISA) utilizando kits comerciales (Calbiochem, EMD Chemicals lnc. Alemania) .
Inhibición de la citoquina TNF-a La estimulación con LPS aumentó la producción de TNF-a desde 4.5 ±
3.0 hasta 111.62 ± 3.1 ng mr, mientras que en presencia de los compuestos 13-HOTE y 13-HODE se redujo hasta 27.05 ± 0.5 y 65.45 ±
0.5 ng mr1, respectivamente, lo que supone una inhibición de la producción de TNF-a del 79 y 44 %, respectivamente. Por tanto, estos compuestos puros poseen una alta actividad antiinflamatoria, sobre todo el compuesto 13-HOTE.
También se estudió el efecto de los compuestos 13-HOTE y 13-HODE
sobre la producción de TNF-a por monocitos TPH-1 no diferenciados a
macrófagos. La estimulación con LPS aumentó la producción de TNF-a
desde 9.9 ± 3.3 hasta 31.5 ± 9.9 ng mr 1 , mientras que en presencia de los
5 compuestos se redujo hasta 9.8 ± 1.3 y 17.7 ± 0.79 ng mr 1 , para los
compuestos 13-HOTE y 13-HODE, respectivamente, lo que supone una
inhibición de la producción de TNF-a del 100 y 64 %, respectivamente.
Por tanto, la acción antiinflamatoria de estos compuestos se ejerce tanto
sobre monocitos como sobre macrófagos, y es especialmente notable en
1O el compuesto 13-HOTE.
EJEMPLO 3
Este ejemplo ilustra la actividad antiinflamatoria in vivo de la biomasa de
15 microalgas que contienen 13-HOTE y 13-HODE.
Se realizó un ensayo agudo (5 días) en ratas Wistar, valorando la actividad
de un liofilizado de microalgas frente a la colitis intestinal inducida por el
hapteno ácido trinitro-bencenosulfónico (TNBS; Morris et al. 1989,
20 Gastroenterology 96: 795-803) . Cada gramo de liofilizado de microalga
contenía 0.54 mg de 13-HOTE y 0.44 mg de 13-HODE. El TNBS se aplicó
por vía rectal y el liofilizado en estudio (en suspensión en solución salina
con Tween 80 al 5%, y a concentraciones de 100 y 400 mg kg-1 de animal)
fue administrado por vía oral, utilizando una sonda intragástrica de teflón.
25 El liofilizado se administró desde el día 1 al 5, y la colitis se indujo al tercer
día de tratamiento. Este modelo experimental da lugar a una inflamación
localizada y alteraciones en el colon con características similares a las que
han sido encontradas en enfermedades inflamatorias crónicas en
humanos. Los resultados que se obtienen de este estudio pueden orientar
30 sobre la capacidad preventiva y/o curativa de los compuestos, en un rango de dosis activas, incidiendo en la capacidad antiinflamatoria que tuvieran.
Se analizaron las variaciones de peso, las adherencias intestinales (escalas 0-3) , la diarrea (escala 0-1) y la relación peso/longitud total del colon aislado (g cm-1) . Igualmente se hicieron valoraciones del daño determinándose el daño macroscópico y microscópico en el colon de cada animal. La administración intracolónica de 1 O mg de TNBS produjo en los animales un cuadro importante de colitis aguda, con una importante pérdida de peso corporal y aumento de diarrea. Los cambios en la fracción colónica estaban asociados a un incremento significativo (p<0.01) en la relación peso/longitud del colon (0.169 ± 0.01 g cm-1en tratados con TNBS, frente a 0.081 ± 0.004 g cm-1 en control sano) . Los resultados obtenidos en los animales tratados con el liofilizado sugerían, en conjunto, cambios indicativos de cierta mejoría. El liofilizado redujo moderadamente la pérdida del peso corporal y provocó un marcado descenso en la presencia de diarrea y las adherencias a la dosis más alta ( 400 mg kg-1) . En cuanto a la relación peso/longitud del colon se observó una disminución con ambas dosis ensayadas, siendo significativa {p<0.01) a la dosis de 100 mg kg-1. Los datos obtenidos tras la medición de la superficie ulcerada reflejan que ambas dosis del liofilizado (100 y 400 mg kg-1) atenuaron significativamente la extensión y severidad del daño colónico. Estas dosis fueron capaces de reducir la superficie ulcerada en más de un 30% en comparación con el control TNBS.
Para el estudio histológico, las muestras fijadas e incluidas en parafina, fueron cortadas a 5-7 ¡Jm de grosor y teñidas con hematoxilina/eosina. En los cortes histológicos obtenidos tras el tratamiento con el liofilizado, se detectaron menores descamaciones de las células epiteliales y se observó una mejor conservación de la estructura glandular. Además, se detectó una disminución de infiltrado inflamatorio con respecto al control TNBS y un menor tamaño de la capa necrótica superficial.
El estudio se completó con dos pruebas bioquímicas en muestras de
colon; se determinó la actividad de enzima mieloperoxidasa (MPO) ; esta
actividad se relaciona con el grado de inflamación, ya que se trata de una
enzima constitutiva de los neutrófilos, y permite estimar el grado de
5 infiltración neutrofílica. Se cuantificó la MPO mediante una prueba calorimétrica, basada en la oxidación dependiente de H20 2 de un donador
de electrones artificial (TMB) . Los resultados se expresan como unidades de actividad de la enzima por mg de tejido (U mg1) . Los resultados
1O indicaron que la concentración mayor de liofilizado disminuyó significativamente (p<0.01) el infiltrado inflamatorio. Se observó un descenso de la MPO desde 7.37 ± 0.42 U mg1 (TNBS) hasta 6.89 ± 0.54 U mg1 (TNBS y 100 mg kg-1 del liofilizado) y hasta 2.55 ± 0.28 U mg1 (TNBS y 400 mg kg-1 del liofilizado) , siendo de 2.15 ± 0.31 U mg1 el valor
correspondiente a los controles sanos.
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Todos estos resultados muestran la actividad antiinflamatoria in vitro de
los ácidos 13-HOTE y 13-HODE y la capacidad in vivo de un preparado
que los contiene para prevenir daños similares a los observados en
enfermedades inflamatorias intestinales en humanos.
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