Dendrimeros carbosilanos catiónicos obtenidos mediante “click chemistr y ”, su preparación y sus usos.
La presente invención se refiere a macromoléculas altamente ramificadas sintetizadas a partir de un núcleo 5 polifuncional, denominadas dendrímeros, de estructura carbosilano y funcionalizados en su periferia con grupos catiónicos que dan a la macromolécula una carga neta positiva. Estos dendrímeros contienen en su estructura grupos 1, 2, 3 triazoles resultantes al aplicar una reacción de cicloadición de Huisgen 1, 3-dipolar entre alquinos y azidas. Además la invención se refiere a su procedimiento de obtención y sus usos en biomedicina, tanto como vector no viral de ácidos nucleicos para procesos de terapia génica como su uso como agentes terapéuticos “per se”. 10
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La observación de las moléculas creadas en la naturaleza demuestra una preferencia hacia la formación de enlaces carbono-heteroátomo frente a la formación de enlaces carbono-carbono, así ocurre por ejemplo en los ácidos nucleicos, 15 proteínas u oligosacáridos que pueden ser considerados como polímeros de condensación de subunidades unidas a través de enlaces carbono-heteroátomo. Esto llevó a Sharpless y colaboradores (Hartmuth C. y cols, Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004) a proponer una estrategia sintética denominada “click-chemistr y ” basada en reacciones que permitan el acoplamiento de “bloques” modulares de una manera selectiva y eficiente tanto en aplicaciones a pequeña escala como en procesos a gran escala. Las reacciones que pueden considerarse dentro de esta estrategia “click” 20 deben cumplir una serie de requisitos bien definidos, como son los siguientes: debe ser modular, aplicable en un rango amplio de situaciones, de elevado rendimiento, generar como subproductos sustancias no tóxicas y debe ser estereoespecífica (no necesariamente enantioselectiva) . Además, estas reacciones se deben poder llevar a cabo en condiciones suaves, a partir de productos de partida fácilmente disponibles y en ausencia de disolventes o en pequeñas cantidades de los mismos y los productos finales deben ser fáciles de aislar. 25
Existen varios tipos de transformaciones que podrían incluirse dentro de la categoría de “click chemistr y ”, pero sin duda la reacción de cicloadición de Huisgen 1, 3-dipolar de alquinos y azidas catalizada por Cu (I) , para dar lugar a 1, 2, 3 triazoles es el ejemplo más característico y utilizado de todas ellas. Ello se debe a la facilidad de síntesis de derivados alquino y azida, junto a su estabilidad cinética y su tolerancia a una gran variedad de grupos funcionales y condiciones 30 de reacción. Esta reacción se puede llevar a cabo sin la presencia de grupos funcionales y en rendimientos prácticamente cuantitativos.
Las características específicas que presenta esta tecnología la hacen especialmente útil para abordar la síntesis de dendrímeros, que son especies que presentan una gran cantidad de grupos funcionales, ya que la funcionalización de 35 estos derivados es a menudo difícil y conduce a especies que se encuentran parcialmente funcionalizadas, si no se utilizan reacciones cuantitativas. Por ello, la reacción de cicloadición de Huisgen catalizada por Cu (I) ha sido ampliamente utilizada en la bibliografía para llevar a cabo de una manera cuantitativa y localizada la funcionalización de macromoléculas dendríticas, permitiendo una gran variedad de condiciones de reacción, ver por ejemplo, P. Wu, A. K. Feldman, A. K. Nugent, C. J. Hawker, A. Scheel, B. Voit, J. Pyun, J. M. J. Fréchet, K. B. Sharpless and V. V. Fokin. 40 Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 3928.
Por otro lado, los dendrímeros carbosilano de naturaleza catiónica se han mostrado como un nuevo tipo de compuestos útiles para aplicaciones en biomedicina, ver por ejemplo N. Weber, P. Ortega, M. I. Clemente, D. Shcharbin, M. Br y szewska, F. J. de la Mata, R. Gómez, M. A.Muñoz-Fernandez. J. of Controlled Released . 2008, 132, 55-64. Estos 45 derivados no son tóxicos en un rango de concentraciones entre 1 y 5 μM y son capaces de interaccionar de forma electrostática con material nucleico como oligonucleótidos o pequeños ARN de interferencia (siRNA) formando bioconjugados denominados “dendriplexes”. Estos “dendriplexes” han mostrado también una baja toxicidad, capacidad para proteger al material nucleico del ataque de las proteínas del suero y de las nucleasas y son capaces de transportar este material hasta el interior de las células, por lo que se pueden considerar como vectores no virales para la 50 transfección de material nucleico al interior de varios tipos de líneas celulares en procesos de terapia génica.
También, los dendrímeros carbosilano catiónicos han mostrado actividad antimicrobiana tanto frente a bacterias Gram positivas como frente a bacterias Gram negativas. Esta actividad parece estar relacionada con la multivalencia que presentan los dendrímeros, que permite la presencia de un número elevado de funcionalidades sobre una misma 55 molécula. Así, dendrímeros carbosilano con grupos amonio terminales de primera, segunda o tercera generación se han mostrado eficaces como biocidas multivalentes, mostrando una actividad antibacteriana que es más de dos órdenes de magnitud mayor que la de los compuestos análogos monofuncionales (Beatriz Rasines, Jose Manuel Hernández-Ros, Natividad de las Cuevas, Jose Luis Copa-Patiño, Juan Soliveri, María Angeles Muñoz-Fernández, Rafael Gómez, F. Javier de la Mata. Dalton Transactions , 2009, 40, 8704-8713; ES2265291) . 60
Otros posibles usos de los dendrímeros carbosilano catiónicos son: agentes antivirales, agentes antipriónicos o como vehículos de transporte de fármacos aniónicos.
La eficacia mostrada por los dendrímeros carbosilano catiónicos en diferentes campos de la biomedicina hace necesario el encontrar un método fácil y versátil que permita la obtención de estos derivados en un proceso de elevado rendimiento a partir de reactivos fácilmente accesibles y mediante reacciones químicas cuantitativas que toleren una gran variedad de condiciones de reacción.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Esta invención describe la funcionalización selectiva de dendrímeros que contienen un esqueleto de naturaleza carbosilano con grupos amina terminales, utilizando para ello reacciones de “click chemistr y ” entre dendrímeros carbosilano con grupos azida terminales y derivados amino que presentan un grupo alquino terminal en su estructura, 10 conduciendo a dendrímeros carbosilano funcionalizados en su superficie con grupos amino que se unen al esqueleto dendrimérico a través de la formación de derivados 1, 4 disustituidos, 1, 2, 3 triazoles. Además estas macromoléculas altamente ramificadas o dendrímeros, sintetizados a partir de un núcleo polifuncional y de estructura carbosilano, están funcionalizados en su periferia con grupos amonio de naturaleza catiónica, que dotan a la macromolécula de una carga neta positiva. Además, la invención proporciona un procedimiento, que hace uso de la denominada “click chemistr y ”, 15 para su obtención y se refiere también a sus usos en biomedicina.
Los dendrímeros carbosilanos con grupos amonio en su periferia de la presente invención son más estables y solubles en agua que otros dendrímeros carbosilano catiónicos del estado de la técnica, como por ejemplo los descritos en la patente ES2265291, esto confiere una ventaja a los dendrímeros de la invención ya que la estabilidad en agua es un 20 requerimiento esencial para algunas aplicaciones en biomedicina. Esta estabilidad en agua permite, en el caso de los dendrímeros descritos en la presente invención, poder estudiar su actividad antibacteriana y su capacidad de vehiculización de ácidos nucleicos en diferentes condiciones de pH y a distintos tiempos. Por otro lado, en este caso es posible llevar a cabo un estudio de la actividad de estos derivados en los procesos descritos anteriormente en función de la generación del dendrímero. 25
Además, la síntesis de los nuevos dendrímeros catiónicos descritos en esta solicitud de patente, a través de una reacción de tipo “click” es un proceso más sencillo que los procesos de hidrosililación de alquenilaminas descritos la patente ES2265291 y que transcurre en condiciones suaves y con elevados rendimientos. Además, estos dendrímeros carbosilano de la invención presentan una gran inercia química, lo que es muy útil para el estudio de cualquier 30 aplicación biomédica.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un dendrímero carbosilano que comprende:
- un núcleo polifuncional (Nu) , y
- una capa externa, que consiste total o parcialmente, en unidades iguales o diferentes de grupos de fórmula (I) : 35
SiXNNNR1R'3-pp
(I)
donde:
R´ es un alquilo C1-C4, 40
p es un número entero que varía entre 1 y 3, preferiblemente p es 1,
X un grupo alquilo C1-C6,
R1 se selecciona de entre los grupos de fórmula (II) , (III) o el grupo –O-R5:
(II) , (III)
R2, R3, R4, son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de entre un hidrógeno, un grupo alquilo C1-C4 45 o un grupo alquilo C1-C4 sustituido con un grupo amino terciario o cuaternario; con la condición de que al menos un grupo R2, R3 o R4 sea un grupo alquilo o alquilo sustituido; y R5 es un alquilo C1-C4 sustituido con al menos un grupo amino terciario o cuaternario.
Por “dendrímero carbosílano” se refiere en la presente invención a una macro
molécula
muy ramificada con forma esférica, donde el núcleo de crecimiento del dendrímero es polifuncional, las unidades, ramas o ramificaciones de crecimiento tienen esqueleto carbosilano y la capa externa, superficie o periferia del dendrímero incorpora grupos funcionales. Esta superficie o periferia sería la correspondiente a las extremidades de las ramificaciones.
Por “núcleo polifuncional” (Nu) se entiende en la presente invención a un elemento o compuesto polivalente enlazado de la manera covalente con al menos dos ramificaciones, es decir, al menos deberá ser divalente. En una realización preferida, el núcleo es tetravalente y más preferiblemente, el núcleo es de silicio (grupo sililo) . Sin embargo, el núcleo puede ser cualquiera derivado polifuncional a partir del cual sea posible crecer un dendrímero de naturaleza carbosilano, de los conocidos por un experto en la materia, como por ejemplo, y sin limitarse a un núcleo polifenólico, un 10 núcleo amino o poliamino.
El término “alquilo” se refiere en la presente invención a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas. En el caso de R’, R2, R3, R4, y R5 estas cadenas tienen de 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tert-butilo o sec-butilo, preferiblemente se seleccionan independientemente de entre un alquilo C1-C2, más 15 preferiblemente el grupo alquilo es un metilo. En el caso de X esta cadena tiene de 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tert-butilo o sec-butilo, preferiblemente X es un grupo butilo. Los grupos alquilo de R2, R3, R4, y R5, pueden estar opcionalmente sustituidos por grupos amina terciarias o cuaternarias, es decir, -NR6R7 o –N (+) R6R7R8 respectivamente, donde R6, R7 y R8 representan hidrógeno, grupos alquilo (C1-C4) o grupos alquilos (C1-C4) sustituidos por grupos amino terciarios o cuaternarios, tal y como se han definido anteriormente. 20
En una realización preferida, R1 es un grupo de fórmula (III) , más preferiblemente R2, R3 o R4, son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de entre un alquilo C1-C2, más preferiblemente R2, R3 o R4 son un grupo metilo.
En otra realización preferida, R1 es el grupo –O-R5 y R5 es un alquilo C1-C4 sustituido con un grupo amino terciario o 25 cuaternario, es decir, R5 es un grupo alquilo C1-C4 sustituido por -NR6R7 o –N (+) R6R7R8, donde R6, R7y R8 representan hidrógeno, grupos alquilo (C1-C4) o grupos alquilos (C1-C4) sustituidos a su vez por grupos amino terciarios o cuaternarios -NR6R7 o –N (+) R6R7R8) . Más preferiblemente, R5 es grupo etilo sustituido por un grupo amino terciario sustituido por un grupo etilo sustituido a su vez por un grupo amino terciario o cuaternario, más preferiblemente aún, un grupo etilo sustituido por un grupo cuaternario, donde preferiblemente R6, R7y R8 son, iguales o diferentes, un grupo 30 alquilo (C1-C4) , más preferiblemente un grupo alquilo (C1-C2) y aún más preferiblemente un grupo metilo.
En una realización preferida, el dendrímero de la invención puede ser de primera, segunda o tercera generación. El término “generación” se refiere al número de ramificaciones iterativas que son necesarias para la preparación del dendrímero. 35
Sin embargo, el dendrímero también puede ser de generación cero, tal y como se representa en la fómula (IV) :
(IV)
donde: Nu representa un núcleo polifuncional como se define anteriormente, Ra es un grupo alquilo (C1-C6) ; y es un 40 número entero que varía entre 2 y 6, preferiblemente y es 4 cuando el núcleo es de silicio; y R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito anteriormente. Si el núcleo es de silicio el dendrímero de fórmula (IV) puede ser de fórmula (IVa) :
(IVa) 45
donde: R y Ra están definidos anteriormente.
En otra realización preferida, el dendrímero es al menos de primera generación y se puede representar con la siguiente fórmula general (V) :
50
(V)
donde: Nu representa un núcleo polifuncional como se define anteriormente, Ra Rb y RII, son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (C1-C6) ; m es un número entero que varía entre 1 y 3 preferiblemente m es 2; y es un
número entero que varía entre 2 y 6; y R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito anteriormente. Si el núcleo es de silicio el dendrímero de fórmula (V) puede ser de fórmula (Va) :
(Va) 5
donde: R, Ra, Rb, R’’ y m están definidos anteriormente.
En otra realización preferida, el dendrímero es al menos de segunda generación y se puede representar con la siguiente fórmula (VI) :
10
(VI)
donde: Nu representa un núcleo polifuncional como se define anteriormente, Ra, Rb, Rc, RII y RIII, son iguales o diferentes, y representan un grupo alquilo (C1-C6) ; m y n son iguales o diferentes y son un número entero que varia entre de 1 y 3; preferiblemente m y/o n es 2; y es un número entero que varia entre 2 y 6; y R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito anteriormente. Si el núcleo es de silicio el dendrímero de fórmula (VI) puede ser 15 de fórmula (VIa) :
(VIa)
donde: R, Ra, Rb, Rc, RII, RIII, m y n están definidos anteriormente.
En otra realización preferida, el dendrímero es al menos de tercera generación y se puede representar con la siguiente fórmula (VII) :
(VII)
donde: Nu representa un núcleo polifuncional como se define anteriormente, Ra, Rb, Rc, Rd, RII , RIII y RIV son iguales o 25 diferentes, y representan un grupo alquilo (C1-C6) ; m, n y q son iguales o diferentes y es un número entero que varía entre 1 y 3; preferiblemente es m, n y/o q es 2; y es un número entero que varía entre 2 y 6; y R es el grupo terminal de fórmula general (I) según se ha descrito anteriormente. Si el núcleo es de silicio el dendrímero de fórmula (VII) puede ser de fórmula (VIIa) :
(VIIa)
donde: R, Ra, Rb, Rc, Rd, RII , RIII, RIV, m, n y q se ha descrito anteriormente.
En estos dendrímeros de fórmula (IV) , (IVa) , (V) , (Va) , (VI) , (VIa) , (VII) o (VIIa) , los radicales Ra, Rb, Rc o Rd pueden ser iguales o diferentes, y preferiblemente representan un grupo alquilo (C2-C4) , más preferiblemente son un grupo butilo. En otra realización preferida, los radicales RII, RIII o RIV son, independiente unos de otros, y representar un grupo alquilo (C1-C4) , más preferiblemente son un grupo metilo.
Los dendrímeros de la presente invención además pueden ser catiónicos, con grupos amonio terminales de diferente naturaleza. Por lo tanto, la presente invención no solo incluye los dendrímeros por sí mismos, sino cualquiera de sus sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de cloruro, bromuro, ioduro o triflato. Preferiblemente las sales son de ioduro.
Esta familia de dendrímeros de naturaleza carbosilano que se describe puede ser preparada siguiendo un procedimiento de síntesis divergente (crecimiento desde dentro hacia fuera) , a partir de un núcleo polivalente, preferiblemente de silicio tetraalilo y posterior funcionalización de la superficie con diferentes grupos funcionales de naturaleza catiónica.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de los dendrímeros según se han descrito anteriormente, que comprende la síntesis de dendrímeros con grupos terminales amino, –NR2, y posterior cuaternización de estos grupos amino terminales con diversos agentes cuaternizantes como por ejemplo, pero sin limitarse, a HCl o yoduro de metilo (Mel) . Los grupos amino terminales se unen al esqueleto carbosilano a través de una reacción de cicloadición de Huisgen, utilizando para ello dendrímeros carbosilano funcionalizados con grupos azida 25 en la periferia y derivados amino que contienen un grupo alquino terminal.
Estos dendrímeros organosilano se pueden preparar de diferentes generaciones con rendimientos elevados, a través de métodos divergentes y utilizando la tecnología click chemistr y para su funcionalización. Su síntesis es relativamente sencilla, lo que facilita su obtención en grandes cantidades. 30
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención del dendrímero de la invención, que comprende las siguientes etapas:
a. adición de un dendrimero de tipo azida con fórmula (VIII) , (IX) , (X) o de siguientes generaciones a una alquinilamina en un medio líquido. 35
(VIII) (IX)
(X) 40
Donde: Nu es un núcleo polivalente como se ha definido anteriormente, Z es un grupo – (CH) x-N3, x es un valor de entre 1 a 4, preferiblemente x es 1, e y tiene un valor de entre 2 y 6. Preferiblemente Nu es de silicio e y es 4.
b. adición de un inhibidor de reacción a la disolución de la etapa (a) ,
c. extracción en un disolvente orgánico del dendrímero obtenido (b) , y
d. concentración del producto obtenido en (c) . 5
En una realización preferida del procedimiento de la invención, además comprende una etapa (e) de adición de un agente cuaternizante al producto obtenido en (d) . Los agentes cuaternizantes se pueden seleccionar de entre halogenuros de alquilo (C1-C24) , HCl, sulfatos de dialquilo (C1-C5) , triflato de metilo, o cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente se seleccionan de entre cloruro de metilo, bromuro de metilo, yoduro de metilo, cloruro de etilo, 10 bromuro de etilo, cloruro de propilo, cloruro de hexilo, cloruro de dodecilo, cloruro de arilo y halogenuros de bencilo, cloruro de bencilo, bromuro de bencilo o cualquiera de sus combinaciones.
En una realización preferida del procedimiento de la invención, la alquinilamina es una propalgilamina, más preferiblemente se puede seleccionar, pero sin limitarse a propargildimetilamina o propargildiamina. 15
En otra realización preferida del procedimiento de la invención, el medio líquido de la etapa (a) es de tipo orgánico, como por ejemplo pero sin limitarse a tetrahidrofurano, tolueno o DMF (
N, N-Dimetilformamida
) .
En otra realización preferida del procedimiento de la invención, el inhibidor de la etapa (b) es cualquier agente 20 acomplejante del cobre conocido por cualquier experto en la materia, como por ejemplo, pero sin limitarse al hidróxido amónico o EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) .
En otra realización preferida del procedimiento de la invención, la extracción de la etapa (c) se realiza con un disolvente orgánico, como por ejemplo, pero sin limitarse a acetato de etilo, diclorometano o éter etílico. 25
En otra realización preferida del procedimiento de la invención, la concentración de la etapa (d) se realiza a vacío.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (XI) :
30 SiXNNNR1Et3
(XI)
donde: Et es un grupo etilo y
X y R1 están descritos anteriormente
La presente invención se refiere también a los usos en biomedicina de los dendrímeros descritos anteriormente que 35 presentan grupos amino o amonio terminales, entre ellos destacan la utilización de los derivados catiónicos como agentes de transporte no virales para la transfección o internalización de material nucleico en el interior de diferentes líneas celulares en procesos de terapia génica o también el uso de estos dendrímeros como agentes terapéuticos “per se”, por ejemplo como agentes antibacterianos o antivirales.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los dendrímeros de la invención para la elaboración de un medicamento. Más preferiblemente, el medicamento se utiliza para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades causadas por virus, bacterias u hongos. Más preferiblemente la prevención y/o el tratamiento son para enfermedades causadas por el VIH.
Teniendo en cuenta la actividad biocida de los dendrímeros de la invención, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de estos dendrímeros como agentes biocidas para aplicaciones no terapéuticas, como por ejemplo para realizar controles, como pueden ser los usados con detergentes para impedir la aparición de microorganismos en superficies.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un dendrímero según se ha descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, esta composición farmacéutica puede comprende otro principio activo, preferiblemente un antibiótico, más preferiblemente un antibiótico del grupo de los
betalactámicos
, y aún más preferiblemente la penicilina.
Una composición farmacéutica que aúna el uso de los dendrímeros de la invención junto con algún antibiótico, como los descritos, produce una sinergia de su actividad como se puede observar por ejemplo en la Tabla 7 de los ejemplos. Además, al reducir la concentración necesaria de antibiótico disminuirían los problemas de aparición de resistencia a los
antibióticos y se podrían evitar otro tipo de resistencias, como por ejemplo los efectos de destrucción del antibiótico por enzimas, al protegerlo el dendrímero. Además, cuando un microorganismo presente resistencias intrínsecas a un antibiótico, el dendrímero puede vehiculizar el antibiótico saltándose esas barreras de resistencia.
Los “vehículos farmacéuticamente aceptables” que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos 5 conocidos por un experto en la materia.
Como ejemplos de preparaciones farmacéuticas se incluye cualquier composición sólida (comprimidos, píldoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (geles, soluciones, suspensiones o emulsiones) para administración oral, nasal, tópica o parenteral. 10
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento o prevención de enfermedades causadas por virus, bacterias u hongos en un mamífero, preferiblemente un humano, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende al menos un dendrímero de la invención. Preferiblemente, la administración de la composición se puede realizar por vía oral, nasal, tópica o parenteral. 15
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "cantidad terapéuticamente
efectiva
" se refiere a la cantidad de la composición calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de la composición, la edad, estado y antecedentes del paciente, la severidad de la enfermedad, y de la ruta y frecuencia de administración. 20
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los dendrímeros de la invención como vector no viral. Preferiblemente, el vector se utiliza para la transfección o internalización de material nucleico en procesos de terapia génica, es decir, los dendrímeros de la invención pueden actuar como agentes de transfección en terapia génica.
Por “material nucleico” se refiere en la presente invención a un material, aislado y/o purificado, que comprende una secuencia nucleótida y se puede seleccionar entre oligonucleotidos, ARNip o ADN.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector no viral que comprende al menos un dendrímero de la presente invención. Este vector además puede comprender material nucleico, tal y como se ha descrito anteriormente, 30
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del vector no viral de la invención, para la elaboración de un medicamento. Más preferiblemente, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer en terapia génica.
La posibilidad de síntesis y fácil manipulación de estos dendrímeros y la posibilidad de agregar a este tipo de polímeros, ligandos que permitan su direccionamiento hacia un lugar específico de acción, supone una gran ventaja frente a otros vectores utilizados en terapia génica.
La mayor ventaja de los complejos, dendrímero/material nucleico formulados en la presente invención, reside en que 40 poseen una estructura uniforme y flexible permitiendo la posibilidad de modificar de manera versátil el esqueleto y la superficie de los mismos.
También es posible el uso de los dendrímeros de la invención como vehículos de transporte de moléculas, preferiblemente moléculas con actividad farmacológica (principios activos) , y más preferiblemente moléculas aniónicas, 45 el principio activo puede ser un antibiótico, entre ellos por ejemplo y sin limitarse a un antibiótico del grupo de los
betalactámicos
, como puede ser la penicilina.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y 50 características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS 55
FIG. 1. Gel de retardo para los distintos complejos preparados. Línea 1: ADN desnudo. Línea 2: complejo con PAMAM comercial. Líneas 3 a 5: complejos Familia 1 G0. Líneas 6 a 8: complejos Familia 1 G1. Líneas 9 a 11: complejos Familia 1 G2. Todos los poliplejos de la Familia 1 se prepararon a relaciones de carga 1, 5 y 20 respectivamente. Líneas 12 a 15: complejos Familia 2 G0. Líneas 16 a 19: complejos Familia 2 G1. Todos los poliplejos de la Familia 2 se 60 prepararon a relaciones de carga 1, 5, 20 y 30 respectivamente.
FIG. 2. Transfección in vitro para la Familia 1 en la línea celular HepG2 (A) y en la línea celular HeLa (B) . La cantidad de ADN por pocillo fue de 1 µg. Los datos se representan como la media ± desviación estándar (d.s.) de tres pocillos.
FIG. 3. Transfección in vitro para la Familia 2 en la línea celular HepG2 (A) y en la línea celular HeLa (B) . La cantidad de ADN por pocillo fue de 1 µg. Los datos se representan como la media ± d.s. de tres pocillos
FIG. 4. Toxicidad de los complejos dendrímero/ADN de la Familia 1 evaluada en la línea celular HepG2 (A) y en la línea celular HeLa (B) . Los resultados se expresan como la media ± d.s. de tres pocillos. 5
FIG. 5. Toxicidad de los complejos dendrímero/ADN de la Familia 2, evaluada en la línea celular HepG2 (A) y en la línea celular HeLa (B) . Los resultados se expresan como la media ± d.s. de tres pocillos.
FIG. 6. Muestra la viabilidad de las dos generaciones de dendrímeros click sintetizados en la Familia 1 y Familia 2, en 10 un rango de creciente de concentraciones (1 µM, 5 µM, 10 µM y 15 µM) en las líneas celulares de linfocitos T SupT1 y Jurcat. En todos los casos se observa un límite de toxicidad superior a 10 µM. Figuras A y B, ensayo de MTT (Bromuro de 3- (4, 5-
Di
metil
tiazol
-2-il) -2, 5-di
fenil
tetrazolio) de actividad mitocondrial de los dendrímeros de la FAMILIA 2. Figuras C y D, ensayo de MTT de los dendrímeros de la FAMILIA 1. El Trit-0, 2 (triton x-100) al 0, 2 % representa el 100% de toxicidad. Dextrano se utiliza como control de molécula inocua. 15
FIG. 7. Muestra la viabilidad de las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) según el ensayo MTT, en presencia de distintas concentraciones de los compuestos de mayor generación de cada una de las familias: G1-ckN8-8MeI (compuesto 15) y G1-ckN16-16MeI (compuesto 19) .
FIG 8. Caracterización de la unión dendrímero/siRNA a una concentración de siNEF de 400 nM de los compuestos sintetizados de mayor generación de ambas familias: G1-ckN8-8MeI (compuesto 15) y G1-ckN16-16MeI (compuesto 19) a los distintos ratios 1:1, 1:2, 1:4 y 1:8.
FIG 9. Muestra la inhibición de la entrada del VIH (virus de la inmunodeficiencia humana) en CMSP tras 48 horas de 25 tratamiento con los compuestos sintetizados de mayor generación de ambas familias: G1-ckN8-8MeI (compuesto 15) y G1-ckN16-16MeI (compuesto 19) y de los complejos dendrímero/siRNA a ratio 1:4. Se infectaron las células antes de añadir los dendrímeros con las cepas X4 VIH NL4.3.
EJEMPLOS 30
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad de los dendrímeros carbosilano y sus procedimientos de síntesis.
Síntesis de dendrímeros carbosilano con núcleos de silicio y con grupos amino y amonio terminales obtenidos vía “click chemistr y ”. 35
La síntesis de dendrímeros de estructura carbosilano con grupos amino terminales se llevó a cabo mediante la utilización de la metodología “click chemistr y ” para la unión de propargildimetilamina o la propargildiamina (HCC-CH2OCH2CH2N (Me) CH2CH2NMe2) sobre dendrímeros carbosilano de diferentes generaciones con funcionalidades azida terminales. 40
En general los dendrímeros que se describen en este apartado se pueden representar como ck-Gn- (F) x, donde:
ck indica que se trata de dendrímeros obtenidos por acoplamiento click entre un grupo azida y un triple enlace carbono carbono.
n indica el número de la generación G. 45
F, indica la naturaleza de los grupos funcionales situados en la periferia del dendrímero.
x denota el número de unidades terminales presentes en el dendrímero.
Esta ruta sintética conlleva inicialmente la preparación de dendrímeros carbosilano, crecidos a partir de un núcleo de silicio tetraalilo, con grupos azida terminales. La preparación de estos derivados azida se llevó a cabo a partir de dendrímeros carbosilano de diferentes generaciones con grupos –CH2Br terminales. La posterior reacción de estos 50 derivados con azida de sodio da lugar a los dendrímeros de estructura carbosilano con grupos azida terminales Gn-[Si-CH2CH2CH2CH2N3]x (trietilsililo, x = 1 (1) ; n = 0, x = 4 (2) ; n = 1, x = 8 (3) ; n = 2, x = 16 (4) ) (ver esquema 1) .
Esquema 1
Los compuestos 1-4 son sólidos aceitosos estables al aire y a la humedad, solubles en la mayoría de los disolventes orgánicos de uso común y pueden ser almacenados sin descomposición durante largos periodos de tiempo. Estos compuestos han sido caracterizados por análisis elemental de carbono, hidrógeno y nitrógeno, resonancia magnética nuclear de 1H, 13C y 29Si, y espectrometría de masas.
Una vez preparados los dendrímeros con grupos azida terminales, la síntesis de dendrímeros con grupos amino (-NR2) en la superficie se produce por una reacción de tipo “click chemistr y ”, entre los compuestos 1-4 y diferentes propargil aminas como por ejemplo, propargildimetilamina o la propargildiamina (HCC-CH2OCH2CH2N (Me) CH2CH2NMe2) . En el caso de llevar a cabo la reacción de “click chemistr y ” con propargildimetilamina se obtienen los derivados ck-Gn-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2NMe2]x (trietilsililo, x = 1 (5) ; n = 0, x = 4 (6) ; n = 1, x = 8 (7) ; n = 2, x = 16 (9) ) (ver esquema 2) . 10
Esquema 2
Estructuras de los dendrímeros ck-Gn-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2NMe2]x (trietilsililo, x = 1 (5) ; n = 0, x = 4 (6) ; n = 1, x = 8 (7) ; n = 2, x = 16 (8) ) 15
(5) (6)
(7) (8)
Si la amina utilizada es la propargildiamina (HCC-CH2OCH2CH2N (Me) CH2CH2NMe2) se obtienen los siguientes compuestos ck-Gn-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2OCH2CH2N (Me) CH2CH2NMe2]x (trietil sililo, x = 1 (9) ; n = 0, x = 4 (10) ; n = 1, x = 8 (11) ; n = 2, x = 16 (12) ) (ver esquema 3) . 5
Las estructuras propuestas para los dendrímeros ck-Gn-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2OCH2CH2N (Me) CH2CH2NMe2]x (trietilsililo, x = 1 (9) ; n = 0, x = 4 (10) ; n = 1, x = 8 (11) ; n = 2, x = 16 (12) ) son las siguientes:
(9)
(10)
5
(11)
(12)
Los compuestos 5-12 son sólidos aceitosos estables al aire y a la humedad, solubles en la mayoría de los disolventes orgánicos de uso común y pueden ser almacenados sin descomposición durante largos periodos de tiempo.
A partir de estos compuestos, 5-12, la obtención de dendrímeros catiónicos con grupos amonio terminales, se produce mediante una reacción de cuaternización utilizando un derivado RX como agente cuaternizante (R= hidrógeno, alquilo; X= Cl, Br, I) , como por ejemplo yoduro de metilo, MeI. Así hemos obtenido las familias de compuestos que se describen a continuación.
La reacción de adición de yoduro de metilo (MeI) sobre los dendrímeros terminados en grupos –NMe2, 5-8, utilizando las condiciones de reacción descritas en el esquema 4 permiten obtener los dendrímeros ck-Gn-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2NMe3+, I-]x (trietilsililo, x = 1 (13) ; n = 0, x = 4 (14) ; n = 1, x = 8 (15) ; n = 2, x = 16 (16) ) como sólidos blancos solubles en agua. Esta solubilidad en agua va disminuyendo al aumentar la generación como consecuencia del aumento de la lipofilia del esqueleto carbosilano al ir creciendo la generación. 15
Los dendrímeros 13 a 16 tienen las estructruras: ck-Gn-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2NMe3+, I-]x (trietilsililo, x = 1 (13) ; n = 0, x = 4 (14) ; n = 1, x = 8 (15) ; n = 2, x = 16 (16) )
(13) 20
(14)
(15)
(16)
La reacción de adición de yoduro de metilo (MeI) sobre los dendrímeros terminados en grupos –N (Me) CH2CH2NMe2, 9-12, utilizando las condiciones de reacción descritas en el esquema 5 permiten obtener los dendrímeros ck-Gn-5 [Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2OCH2CH2N+ (Me2) CH2CH2N+Me3, 2I-]x (trietilsililo, x = 1 (17) ; n = 0, x = 4 (18) ; n = 1, x = 8 (19) ; n = 2, x = 16 (20) ) como sólidos amarillos solubles en agua. Esta solubilidad en agua va disminuyendo al aumentar la generación como consecuencia del aumento de la lipofilia del esqueleto carbosilano al ir creciendo la generación.
Los dendrímeros 17 a 20 tienen las estructuras: 10
(17)
(18)
(19)
(20)
Los dendrímeros neutros 1-12 y los catiónicos 13-20 han sido caracterizados por análisis elemental de carbono, hidrógeno y nitrógeno, resonancia magnética nuclear de 1H, 13C y 29Si, y espectrometría de masas. Los datos analíticos y espectroscópicos obtenidos están de acuerdo con las estructuras propuestas para estos derivados. 5
La síntesis y caracterización de estos compuestos, junto con los datos analíticos y espectroscópicos obtenidos para alguno de ellos, se describen en los ejemplos detallados de síntesis de dendrímeros que se encuentran a continuación en la presente invención.
1. SÍNTESIS Y CARACTERIZACION DE DENDRÍMEROS CARBOSILANO.
Ejemplo 1: Síntesis de Et3-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2NMe2] (5)
En un matraz schlenk se disuelven 100 mg (0, 47 mmol) de la azida de partida 1 en 5 ml de THF (tetrahidrofurano) y se 15 añaden 0, 06 ml (0, 56 mmol) de N, N-dimetilpropargilamina. A continuación, se añade una disolución recién preparada de 11 mg (0, 06 mmol) de ascorbato sódico en 0, 2 ml de agua destilada y una disolución recién preparada de 6 mg de sulfato de cobre pentahidratado en 0, 2 ml de agua destilada. La mezcla resultante se deja agitar a temperatura ambiente. Transcurridas 4 horas la reacción se interrumpe añadiendo 0, 5 ml de una disolución al 23 % de hidróxido amónico y se deja agitar durante 15 minutos. La mezcla se extrae con acetato de etilo (3x5 ml) , las fases orgánicas se 20 juntan, se lavan con una disolución saturada de cloruro sódico (10 ml) , se secan sobre MgSO4. A continuación se filtra y se concentra a vacio para obtener un aceite amarillo que se caracteriza como el compuesto 5 (101 mg, 73%) .
RMN-1H (CDCl3) : δ 7, 45 (1H, s, NCHCN) , 4, 33 (2H, t, CH2CH2N) , 3, 61 (2H, s, CCH2N) , 2, 27 (6H, s, N (CH3) 2) , 1, 90 (2H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 29 (2H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 0, 88 (9H, t, SiCH2CH3) , 0, 47 (8H, m, SiCH2CH3 y SiCH2CH2CH2CH2N) . RMN-13C {1H} (CDCl3) : δ 145, 0 (NCHCN) , 121, 9 (NCHCN) , 54, 3 (CCH2N) , 49, 7 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 45, 0 (N (CH3) 2) , 34, 0 (SiCH2CH2CH2CH2N) 20, 7 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 10, 7 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 7, 2 (SiCH2CH3) , 3, 0 (SiCH2CH3) . ANÁLISIS ELEMENTAL C15H32N4Si: Calc. %: C, 60, 76; H, 10, 88; N, 18, 99; Exp. %: C 5 60, 02; H, 10, 61; N, 18, 96.
Ejemplo 2: Síntesis de ck-G0-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2NMe2]4 (6)
La preparación del dendrímero de primera generación, 6, con cuatro grupos amino terminales se realiza de un modo similar al descrito para el compuesto 5. En un schlenk se disuelven 300 mg (0, 37 mmol) del dendrímero de primera 10 generación con grupos azida en la superficie, 2, en 20 ml de THF y 0, 17 ml (1, 61 mmol) de N, N-dimetilpropargilamina. A continuación, se añade una disolución recién preparada de 34 mg (0, 18 mmol) de ascorbato sódico en 1, 7 ml de agua destilada y una disolución recién preparada de 18 mg (0, 07 mmol) de sulfato de cobre pentahidratado en 0, 14 ml de agua destilada. La mezcla resultante se deja agitar a temperatura ambiente. Transcurridas 15 horas la reacción se interrumpe añadiendo 1, 5 ml de una disolución al 23 % de hidróxido amónico y se deja agitar durante 15 minutos. La 15 mezcla se extrae con acetato de etilo (3x15 ml) , las fases orgánicas se juntan, se lavan con una disolución saturada de cloruro sódico (20 ml) , se secan sobre MgSO4, se filtra la suspensión resultante y se concentra a vacio para obtener un aceite amarillo que se identifica como 6 (382 mg, 91%) .
RMN-1H (CDCl3) : δ 7, 41 (4H, s, NCHCN) , 4, 28 (8H, t, SiCH2CH2CH2CH2N) , 3, 55 (8H, s, CCH2N) , 2, 21 (24H, s, N (CH3) 2) , 1, 85 (8H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 25 (16H, m, SiCH2CH2) , 0, 49 (24, m, SiCH2) , -0, 13 (24H, s, Si (CH3) 2) . RMN-13C 20 {1H} (CDCl3) : δ 145, 0 (NCHCN) , 122, 0 (NCHCN) , 54, 4 (CCH2N) , 49, 8 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 45, 1 (N (CH3) 2) , 33, 9 (SiCH2CH2CH2CH2N) 20, 8-14, 7 (SiCH2CH2 y SiCH2) , -3, 5 (Si (CH3) 2) .. ANÁLISIS ELEMENTAL C56H117N16Si5: Calc. %: C, 58, 28; H, 10, 13; N, 19, 42; Exp. %: C 58, 07; H, 10, 61; N, 18.96.
Ejemplo 3: Síntesis de ck-G1-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2NMe2]8 (7) 25
La preparación del dendrímero de segunda generación, 7, con ocho grupos amino terminales se realiza de un modo similar al descrito para el compuesto 5. En un matraz schlenk se disuelven 300 mg (0, 15 mmol) del dendrímero de segunda generación con grupos azida en la superficie, 3, en 20 ml de THF y 0.14 ml (1, 29 mmol) de N, N-dimetilpropargilamina. A continuación se añade una disolución recién preparada de 29 mg (0, 15 mmol) de ascorbato sódico en 1, 5 ml de agua destilada y una disolución recién preparada de 15 mg (0, 06 mmol) de sulfato de cobre 30 pentahidratado en 0, 13 ml de agua destilada. La mezcla resultante se deja agitar a temperatura ambiente. Transcurridas 14 horas la reacción se interrumpe añadiendo 1, 2 ml de una disolución al 23% de hidróxido amónico y se deja agitar durante 15 minutos. La mezcla se extrae con acetato de etilo (3x15 ml) , las fases orgánicas se juntan, se lavan con una disolución saturada de cloruro sódico (20 ml) , se secan sobre MgSO4, se filtra la suspensión resultante y se concentra a vacio para obtener un aceite amarillo que se identifica como 7 (345 mg, 86%) . 35
RMN-1H (CDCl3) : δ 7, 39 (8H, s, NCHCN) , 4, 26 (16H, t, SiCH2CH2CH2CH2N) , 3, 52 (16H, s, CCH2N) , 2, 19 (48H, s, N (CH3) 2) , 1, 83 (16H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 21 (40H, m, SiCH2CH2) , 0, 46 (64H, m, SiCH2) , -0, 01 (12H, s SiCH3) , -0, 15 (24H, s, Si (CH3) 2) . RMN-13C {1H} (CDCl3) : δ 145, 0 (NCHCN) , 121, 9 (NCHCN) , 54, 3 (CCH2N) , 49, 7 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 45, 0 (N (CH3) 2) , 33, 8 (SiCH2CH2CH2CH2N) 20, 8-14, 7 (SiCH2CH2 y SiCH2) , -3, 5 (Si (CH3) 2) , -5, 2 (SiCH3) . ANÁLISIS ELEMENTAL C128H268N32Si13: Calc. %: C, 58, 66; H, 10, 31; N, 17, 10; Exp. %: C 58, 50; H, 10, 67; N, 40 16, 32.
Ejemplo 4: Síntesis de ck-G2-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2NMe2]16 (8)
La preparación del dendrímero de tercera generación, 8, con dieciséis grupos amino terminales se realiza de un modo similar al descrito para el compuesto 5. En un matraz schlenk se disuelven 300 mg (0, 07 mmol) del dendrímero de 45 tercera generación con grupos azida en la superficie, 4, en 30 ml de THF y 0, 13 ml (1, 21 mmol) de N, N-dimetilpropargilamina. A continuación, se le añade una disolución recién preparada de 27 mg (0, 14 mmol) de ascorbato sódico en 1, 4 ml de agua destilada y una disolución recién preparada de 14 mg (0, 06 mmol) de sulfato de cobre pentahidratado en 0, 12 ml de agua destilada. La mezcla resultante se deja agitar a temperatura ambiente. Transcurridas 14 horas la reacción se interrumpe añadiendo 1, 2 ml de una disolución al 23% de hidróxido amónico y se deja agitar 50 durante 15 minutos. La mezcla se extrae con acetato de etilo (3x15 ml) , las fases orgánicas se juntan, se lavan con una disolución saturada de cloruro sódico (20 ml) , se secan sobre MgSO4, se filtra la suspensión resultante y se concentra a vacio para obtener un aceite amarillo que se identifica como 8 (252 mg, 64%) .
RMN-1H (CDCl3) : δ 7, 42 (16H, s, NCHCN) , 4, 27 (32H, t, SiCH2CH2CH2CH2N) , 3, 54 (32H, s, CCH2N) , 2, 20 (96H, s, N (CH3) 2) , 1, 84 (32H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 22 (88H, m, SiCH2CH2) , 0, 47 (144, m, SiCH2) , 0, 00 (12H, s, SiCH3) , -55 0, 14 (120H, s, Si (CH3) 2 y SiCH3) . RMN-13C {1H} (CDCl3) : δ 144, 9 (NCHCN) , 122, 0 (NCHCN) , 54, 3 (CH2N) , 49, 8 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 45, 0 (N (CH3) 2) , 33, 9 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 20, 8-14, 7 (SiCH2CH2 y SiCH2) , -3, 5 (Si (CH3) 2) , -5, 1 (SiCH3) . ANÁLISIS ELEMENTAL C272H572N64Si29: Calc. %: C, 58, 82; H, 10, 38; N, 16, 14; Exp. %: C 56, 67; H, 10, 51; N, 11, 56.
Ejemplo 5: Síntesis de [HCC-CH2OCH2CH2N (Me) CH2CH2NMe2]
Esta propagil diamina se prepara siguiendo el procedimiento experimental que se cita a continuación. A 652 mg (16, 32 mmol) de hidruro sódico al 60% se le añaden 10 ml de hexano, la mezcla se filtra y sobre el sólido se adicionan 50 ml de THF. La suspensión resultante se enfría a -30 ºC y se añaden 2, 21 ml (13, 6 mmol) de 2-{[2 (dimetilamino) etil]metilamino}etanol gota a gota. Transcurridas 3 horas se acopla un embudo de adición al matraz 65
schlenk y se transfieren sobre la suspensión anterior, gota a gota, 1, 8 ml (16, 32 mmol) de bromuro de propargilo al 80% en tolueno, disueltos en 16 ml de THF. La reacción se mantiene con agitación durante 16 horas, dejando que se alcance lentamente la temperatura ambiente. Para interrumpir la reacción se añade gota a gota una disolución saturada de cloruro amónico hasta que no se observe desprendimiento de hidrogeno. La mezcla se extrae con acetato de etilo (3x50 ml) , las fases orgánicas se juntan y se lavan con 100 ml de una disolución saturada de cloruro sódico. Las fase orgánica 5 se secan sobre MgSO4, se filtra y se elimina el disolvente a vacio, obteniendo un aceite amarillo oscuro (1, 27 g, 51%)
RMN-1H (CDCl3) : 4, 14 (2H, d, CCH2O) , 3, 62 (2H, t, NCH2CH2O) , 2, 60 (2H, t, CH2CH2O) , 2, 51 y 2, 40 (5H, m, CH2CH2N, solapado con CCH) , 2, 28 (3H, s, NCH3) , 2, 22 (6H, s, N (CH3) 2) . RMN-13C {1H} (CDCl3) : δ 79, 6 (CCH) , 74, 2 (CCH) , 67, 6 (CH2CH2O) , 58, 0 (CCH2O) , 57, 2 (NCH2CH2O) , 56, 9 (NCH2CH2N) , 55, 7 (NCH2CH2N) , 45, 7 (N (CH3) 2) , 42, 8 (NCH3) . ANÁLISIS ELEMENTAL C10H20N2O: Calc. %: 65, 18; H. 10, 94; N, 15, 20; Exp. %: C 64, 32; H, 10, 56; N, 14, 81. 10
Ejemplo 6: Síntesis de
Et3-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2OCH2CH2N (Me) CH2CH2NMe2] (9)
Este compuesto se prepara siguiendo un método similar al descrito para el complejo 5, utilizando la propargil diamina del ejemplo anterior para llevar a cabo el acoplamiento click. En un matraz schlenk se disuelven 300 mg (0, 47 mmol) de 15 la azida de partida, 1, en 15 ml de THF y se añaden 259 mg (1, 41 mmol) de N, N, N´-trimetil-N´- (2- (prop-2-iniloxi) etil) etano-1, 2-diamina (HCCHCH2OCH2CH2N (Me) CH2CH2NMe2) . A continuación se añade una disolución recién preparada de 34 mg (0, 17 mmol) de ascorbato sódico en 0, 2 ml de agua destilada y una disolución recién preparada de 18 mg (0, 07 mmol) de sulfato de cobre pentahidratado en 0, 2 ml de agua destilada. La mezcla resultante se deja agitar a temperatura ambiente. Transcurridas 4 horas la reacción se interrumpe añadiendo 1, 5 ml de una disolución al 23% de 20 hidróxido amónico y se deja agitar durante 15 minutos. La mezcla se extrae con acetato de etilo (3x15 ml) , las fases orgánicas se juntan, se lavan con una disolución saturada de cloruro sódico (30 ml) , se secan sobre MgSO4, se filtra y se elimina el disolvente a vacio, obteniendo un aceite amarillo que se identifica como 9 (510 mg, 91%) .
RMN-1H (CDCl3) : δ 7, 50 (1H, s, NCHCN) , 4, 63 (2H, s, CCH2O) , 4, 32 (2H, t, SiCH2CH2CH2CH2N) , 3, 61 (2H, t, OCH2CH2N) , 2, 61 (2H, t, OCH2CH2N) , 2, 50 y 2, 37 (4H, m, NCH2CH2N) , 2, 26 (3H, s, NCH3) , 2, 21 (6H, s, N (CH3) 2) , 1, 90 25 (2H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 32 (2H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 0, 89 (9H, t, SiCH2CH3) , 0, 48 (8H, m, SiCH2CH3 y SiCH2CH2CH2CH2N) . RMN-13C {1H} (CDCl3) : δ 144, 7 (NCHCN) , 122, 1 (NCHCN) , 68, 1 (OCH2CH2N) , 64, 3 (CCH2O) , 56, 9 (OCH2CH2N) 56, 5 (NCH2CH2N) , 55, 0 (NCH2CH2N) , 49, 6 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 45, 1 (N (CH3) 2) , 42, 7 (NCH3) , 34, 0 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 20, 7 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 10, 6 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 7, 2 (SiCH2CH3) , 3, 0 (SiCH2CH3) . ANÁLISIS ELEMENTAL C20H43N5OSi: Calc. %: C, 60, 40; H, 10, 90; N, 17, 61; Exp. %: C 60, 66; H, 11, 17; N, 18, 47. 30
Ejemplo 7: Síntesis de
ck-G0-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2OCH2CH2N (Me) CH2CH2NMe2]4 (10)
El compuesto 10 se prepara siguiendo un procedimiento similar al descrito para el derivado anterior 9. En un matraz schlenk se disuelven 300 mg (0, 47 mmol) del dendrímero de primera generación con grupos azida en la superficie, 2, en 35 12 ml de THF y se añaden 269 mg (1, 46 mmol) de N, N, N´-trimetil-N´- (2- (prop-2-iniloxi) etil) etano-1, 2-diamina. A continuación se añade una disolución recién preparada de 35 mg (0, 17 mmol) de ascorbato sódico en 0, 2 ml de agua destilada y una disolución recién preparada de 18 mg (0, 07 mmol) de sulfato de cobre pentahidratado en 0, 2 ml de agua destilada. La mezcla resultante se deja agitar a temperatura ambiente. Transcurridas 14 horas la reacción se interrumpe añadiendo 1.5 ml de una disolución al 23% de hidróxido amónico y se deja agitar durante 15 minutos. La mezcla se 40 extrae con acetato de etilo (3x10 ml) , las fases orgánicas se juntan, se lavan con una disolución saturada de cloruro sódico (20 ml) , se secan sobre MgSO4, se filtra y se elimina el disolvente a vacio, obteniendo un aceite amarillo oscuro que se identifica como 10 (473 mg, 91%) .
RMN-1H (CDCl3) : δ 7, 51 (8H, s, NCHCN) , 4, 63 (8H, s, CCH2O) , 4, 31 (8H, t, SiCH2CH2CH2CH2N) , 3, 61 (8H, t, OCH2CH2N) , 2, 61 (8H, t, OCH2CH2N) , 2, 52 y 2, 40 (16H, m, NCH2CH2N) , 2, 26 (12H, s, NCH3) , 2, 23 (24H, s, N (CH3) 2) , 45 1, 90 (8H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 28 (16H, m, SiCH2CH2) , 0, 52 (24, m, SiCH2) , 0, 08 (24H, s, Si (CH3) 2) . RMN-13C {1H} (CDCl3) : δ 144, 9 (NCHCN) , 122, 2 (NCHCN) , 68, 3 (OCH2CH2N) , 64, 4 (CCH2O) , 57, 1 (OCH2CH2N) , 57, 0 y 55, 6 (NCH2CH2N) 55, 6, 49, 8 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 45, 6 (N (CH3) 2) , 42, 9 (NCH3) , 33, 9 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 20, 9-14, 8 (SiCH2 y SiCH2CH2) , -3, 5 (Si (CH3) 2) . ANÁLISIS ELEMENTAL C76H160N20O4Si5: Calc. %: C, 58, 56; H, 10, 35; N, 17, 97; Exp. %: C 58, 07; H, 10, 61; N, 16, 96. 50
Ejemplo 8: Síntesis de
ck-G1-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2OCH2CH2N (Me) CH2CH2NMe2]8 (11)
El compuesto 11 se prepara siguiendo un procedimiento similar al descrito para el derivado anterior 9. En un matraz schlenk se disuelven 494 mg (0, 25 mmol) del dendrímero de segunda generación con grupos azida en la superficie, 3, 55 en 20 ml de THF y se añaden 373 mg (2, 02 mmol) de N, N, N´-trimetil-N´- (2- (prop-2-iniloxi) etil) etano-1, 2-diamina. A continuación, se añade una disolución recién preparada de 48 mg (0, 24 mmol) de ascorbato sódico en 0, 25 ml de agua destilada y una disolución recién preparada de 25 mg (0, 10 mmol) de sulfato de cobre pentahidratado en 0, 3 ml de agua destilada. La mezcla resultante se deja agitar a temperatura ambiente. Transcurridas 16 horas la reacción se interrumpe añadiendo 2 ml de una disolución al 23% de hidróxido amónico y se deja agitar durante 15 minutos. La mezcla se extrae 60 con acetato de etilo (3x20 ml) , las fases orgánicas se juntan, se lavan con una disolución saturada de cloruro sódico (40 ml) , se secan sobre MgSO4, se filtra y se elimina el disolvente a vacio, obteniendo un aceite amarillo oscuro que se identifica como 11 (721 mg, 83%) .
RMN-1H (CDCl3) : δ 7, 51 (8H, s, NCHCN) , 4, 62 (16H, s, CCH2O) , 4, 31 (16H, t, SiCH2CH2CH2CH2N) , 3, 61 (16H, t, OCH2CH2N) , 2, 61 (16H, t, OCH2CH2N) , 2, 50 y 2, 37 (32H, m, NCH2CH2N) , 2, 26 (24H, s, NCH3) , 2, 21 (48H, s, N (CH3) 2) , 65
1, 90 (16H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 28 (48H, m, SiCH2CH2) , 0, 53 (80H, m, SiCH2) , -0, 08 (12H, s, SiCH3) , -0, 10 (48H, s, Si (CH3) 2) . RMN-13C {1H} (CDCl3) : δ 144, 9 (NCHCN) , 122, 0 (NCHCN) , 68, 3 (OCH2CH2N) , 64, 4 (CCH2O) , 57, 1 (OCH2CH2N) , 57, 0 y 56, 0 (NCH2CH2N) , 49, 7 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 45, 6 (N (CH3) 2) , 42, 8 (NCH3) , 33, 8 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 20, 8-14, 7 (SiCH2 y SiCH2CH2) , -3, 3 (Si (CH3) 2) , -5, 0 (SiCH3) . ANÁLISIS ELEMENTAL C168H356N40O8Si13: Calc. %: C, 58, 83; H, 10, 46; N, 16, 33; O, 3, 73; Si, 10, 64; Exp. %: C 57, 61; H, 10, 42; N, 15, 29. 5
Ejemplo 9: Síntesis de
ck-G2-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2OCH2CH2N (Me) CH2CH2NMe2]16 (12)
El compuesto 12 se prepara siguiendo un procedimiento similar al descrito para el derivado anterior 9. En un matraz 10 schlenk se disuelven 200 mg (0, 05 mmol) del dendrímero de tercera generación con grupos azida en la superficie, 4, en 20 ml de THF y se añaden 140 mg (0, 76 mmol) de N, N, N´-trimetil-N´- (2- (prop-2-iniloxi) etil) etano-1, 2-diamina. A continuación, se añade una disolución recién preparada de 18 mg (0, 09 mmol) de ascorbato sódico en 0, 1 ml de agua destilada y una disolución recién preparada de 9 mg (0, 10 mmol) de sulfato de cobre pentahidratado en 0, 1 ml de agua destilada. La mezcla resultante se deja agitar a temperatura ambiente. Transcurridas 18 horas la reacción se interrumpe 15 añadiendo 2 ml de una disolución al 23% de hidróxido amónico y se deja agitar durante 15 minutos. La mezcla se extrae con acetato de etilo (3x20 ml) , las fases orgánicas se juntan, se lavan con una disolución saturada de cloruro sódico (40 ml) , se secan sobre MgSO4, se filtra y se elimina el disolvente a vacio, obteniendo un aceite amarillo oscuro que se identifica como 12 (155 mg, 46%) .
RMN-1H (CDCl3) : δ 7, 45 (16H, s, NCHCN) , 4, 55 (32H, s, CCH2O) , 4, 24 (32H, t, CH2CH2N) , 3, 54 (32H, t, OCH2CH2N) , 20 2, 54 (32H, t, OCH2CH2N) , 2, 50 y 2, 37 (64H, m, NCH2CH2N) , 2, 20 (48H, s, NCH3) , 2, 15 (96H, s, N (CH3) 2) , 1, 82 (32H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 28 (96H, m, SiCH2CH2) , 0, 51 (0.54 (160H, m, Si CH2) , -0, 02 (48H, s, SiCH3) , -0, 15 (96H, s, ) , -0, 17 (24H, s, SiCH3) . RMN-13C {1H} (CDCl3) : δ 144, 9 (NCHCN) , 122, 0 (NCHCN) , 68, 3 (OCH2CH2N) , 64, 4 (CCH2O) , 57, 1 (OCH2CH2N) 57, 0 (NCH2CH2N) , 55, 7 (NCH2CH2N) , 50, 0 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 45, 7 (N (CH3) 2) , 42, 9 (NCH3) , 33, 9 (CH2CH2N) , 20, 8-14, 7 (SiCH2 y SiCH2CH2) , -3, 5 (Si (CH3) 2) , -5, 1 (SiCH3) . 25
Ejemplo 10: Síntesis de Et3-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2NMe3+, I-] (13)
A una disolución del compuesto con un grupo dimetil amino terminal 5, (101 mg, 0, 34 mmol) en 5 ml de THF, se le añaden 0, 031 ml (0, 51 mmol) de ioduro de metilo y se deja agitar 13 horas a temperatura ambiente. La suspensión 30 resultante se filtra y se seca a vacío obteniéndose un sólido blanco que se identifica como 13 (148 mg, 99%) .
RMN-1H (DMSO-d6) : δ 8, 44 (1H, s, NCHCN) , 4, 68 (2H, s, CCH2N) , 4, 43 (2H, t, SiCH2CHCH2CH2N) , 3, 06 (9H, s, N (CH3) 3) , 1, 85 (2H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 22 (2H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 0, 85 (9H, t, SiCH2CH3) , 0, 46 (8H, m, SiCH2CH3 y SiCH2CH2CH2CH2N) . RMN-13C {1H} (DMSO-d6) : δ 134, 7 (NCHCN) , 127, 3 (NCHCN) , 58, 4 (CCH2N) , 51, 2 (N (CH3) 2) , 48, 7 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 32, 8 (SiCH2CH2CH2CH2N) 19, 6 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 9, 6 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 35 6, 7 (SiCH2CH3) , 2, 2 (SiCH2CH3) .
Ejemplo 11: Síntesis de ck-G0-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2NMe3+, I-]4 (14)
A una disolución del dendrímero de primera generación 6 (0, 38 g, 0, 33 mmol) en 15 ml de THF, se añaden 0, 13 ml (2, 02 mmol) de ioduro de metilo y se deja agitar 13 horas a temperatura ambiente. El sólido resultante se filtra y se seca a 40 vacío para dar un sólido amarillento que se identifica como 14 (478 mg, 84%) .
RMN-1H (DMSO-d6) : δ 8, 42 (4H, s, NCHCN) , 4, 66 (8H, s, CCH2N) , 4, 41 (8H, t, SiCH2CHCH2CH2N) , 3, 05 (24H, s, N (CH3) 3) , 1, 83 (8H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 27 (16H, m, SiCH2CH2) , 0, 51 (24, m, SiCH2) , -0, 10 (24H, s, Si (CH3) 2) . RMN-13C {1H} (DMSO-d6) : δ 134, 7 (NCHCN) , 127, 3 (NCHCN) , 58, 5 (CCH2N) , 51, 3 (N (CH3) 2) , 48, 7 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 32, 8 (SiCH2CH2CH2CH2N) 19, 8-13, 7 (SiCH2 y SiCH2CH2) , -3, 9 (Si (CH3) 2) . ANÁLISIS 45 ELEMENTAL C60H129I4N16Si5: Calc. %: C, 41, 85; H, 7, 49; N, 13, 02; Exp. %: C 41, 25; H, 7, 60; N, 11, 21.
Ejemplo 12: Síntesis de ck-G1-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2NMe3+, I-]8 (15)
A una disolución del dendrímero de segunda generación 7 (0, 24 g, 0, 08 mmol) en 10 ml de THF, se añaden 0, 04 ml 50 (0, 68 mmol) de yoduro de metilo y se deja agitar 13 horas a temperatura ambiente. El sólido resultante se filtra y se seca a vacío para dar un sólido amarillento que se identifica como 15 (244 mg, 81%) .
RMN-1H (DMSO-d6) : δ 8, 44 (8H, s, NCHCN) , 4, 64 (16H, s, CCH2N) , 4, 40 (16H, s, SiCH2CH2CH2CH2N) , 3, 05 (72H, s, N (CH3) 3) , 1, 81 (16H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 25 (40H, m, SiCH2CH2) , 0, 50 (64H, m, SiCH2) , -0, 10 (60H, s, SiCH3 y Si (CH3) 2) . RMN-13C {1H} (DMSO-d6) : δ 134, 8 (NCHCN) , 127, 3 (NCHCN) , 58, 5 (CCH2N) , 48, 8 (N (CH3) 2) , 50, 5 55 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 32, 8 (SiCH2CH2CH2CH2N) 19, 8-13, 8 (SiCH2CH2 y SiCH2) , -3, 9 (SiCH3) . ANÁLISIS ELEMENTAL C136H292I8N32Si13: C, 43, 49; H, 7, 84; I, 27, 03; N, 11, 93; Exp. %: C 43, 75; H, 7, 63; N, 9, 86
Ejemplo 13: Síntesis de ck-G2-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2NMe3+, I-]16 (16)
A una disolución del dendrímero de tercera generación 8 (0, 32 g, 0, 06 mmol) en 15 ml de THF, se añaden 0, 006 ml (0, 09 mmol) de ioduro de metilo y se deja agitar 13 horas a temperatura ambiente. El sólido resultante se filtra y se seca a vacío para dar un sólido amarillento que se identifica como 16 (302 mg, 68%) .
RMN-1H (DMSO-d6) : δ 8, 38 (16H, s, NCHCN) , 4, 62 (32H, t, SiCH2CH2CH2CH2N) , 4, 39 (32H, s, CCH2N) , 3, 04 (144H, s, N (CH3) 2) , 1, 83 (32H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 27 (88H, m, SiCH2CH2) , 0, 51 (144, m, SiCH2) , -0, 10 (132H, s, Si (CH3) 2 y 65
SiCH3) RMN-13C {1H} (DMSO-d6) : δ 134, 8 (NCHCN) , 127, 4 (NCHCN) , 58, 5 (CCH2N) , 48, 8 (N (CH3) 2) , 45, 0 (CH2N) , 33, 0 (CH2CH2CH2CH2N) 19, 9-13, 8 (SiCH2CH2 y SiCH2) , -3, 9 (SiCH3) .
Ejemplo 14: Síntesis de
Et3-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2OCH2CH2N+ (Me2) CH2CH2NMe3+] 2I- (17) 5
A una disolución del compuesto 9 (0, 50 g, 1, 26 mmol) en 20 ml de THF, se añaden 0, 195 ml (3, 14 mmol) de ioduro de metilo y se deja agitar 13 horas a temperatura ambiente. El sólido resultante se filtra y se seca a vacío para dar un sólido amarillento que se identifica como 17 (751 mg, 88%) .
RMN-1H (DMSO-d6) : δ 8, 17 (1H, s, NCHCN) , 4, 63 (2H, s, CCH2O) , 4, 35 (4H, t, SiCH2CH2CH2CH2N) , 3, 97 (4H, s, 10 NCH2CH2N) , 3, 93 (2H, t, OCH2CH2N) , 3, 67 (2H, t, OCH2CH2N) , 3, 21 (6H, s, N (CH3) 2) , 3, 18 (9H, s, N (CH3) 3) , 1, 81 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 23 (2H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 0, 86 (9H, t, SiCH2CH3) , 0, 48 (8H, m, SiCH2CH3 y SiCH2CH2CH2CH2N) . RMN-13C {1H} (DMSO-d6) : δ 142, 4 (NCHCN) , 123, 5 (NCHCN) , 62, 7 (CCH2O) , 62, 6 (OCH2CH2N) , 62, 4 (OCH2CH2N) 56, 4 y 55, 0 (NCH2CH2N) , 52, 5 (N (CH3) 3) , 51, 2 (N (CH3) 2) , 48, 4 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 33, 1 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 19, 6 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 9, 6 (SiCH2CH3) , 6, 8 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 2, 2 (SiCH2CH3) . 15
Ejemplo 15: Síntesis de
ck-G0-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2OCH2CH2N+ (Me2) CH2CH2NMe3+]4 8I- (18)
A una disolución del dendrímero de primera generación 10 (0, 47 g, 0, 30 mmol) en 20 ml de THF, se añaden 0, 16 ml 20 (2, 59 mmol) de ioduro de metilo y se deja agitar 13 horas a temperatura ambiente. El sólido resultante se filtra y se seca a vacío para dar un sólido amarillento que se identifica como 18 (658 mg, 83%) .
RMN-1H (DMSO-d6) : δ 8, 18 (4H, s, NCHCN) , 4, 63 (8H, s, CCH2O) , 4, 33 (8H, t, SiCH2CH2CH2CH2N) , 3, 94 (24H, s, NCH2CH2N y OCH2CH2N) , 3, 66 (8H, s, OCH2CH2N) 3, 20 (24H, s, N (CH3) 2) , 3, 17 (36H, s, N (CH3) 3) , 1, 79 (8H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 1, 24 (16H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 0, 52 (16, m, SiCH2) , -0, 10 (24H, s, Si (CH3) 2) . RMN-13C {1H} 25 (DMSO-d6) : δ 142, 4 (NCHCN) , 123, 4 (NCHCN) , 62, 8 (CCH2O) , 62, 6 (OCH2CH2N) , 62, 4 (OCH2CH2N) , 56, 5 y 55, 5 (NCH2CH2N) , 52, 5 (N (CH3) 3) , 51, 2 (N (CH3) 2) , 48, 5 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 33, 0 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 19, 8-13, 7 (SiCH2 y SiCH2CH2) , -3, 8 (Si (CH3) 2) .
Ejemplo 16: Síntesis de 30
ck-G1-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2OCH2CH2N+ (Me2) CH2CH2NMe3+]8 16I- (19)
A una disolución del dendrímero de segunda generación 11 (0, 47 g, 0, 30 mmol) en 20 ml de THF, se añaden 0, 16 ml (2, 59 mmol) de ioduro de metilo y se deja agitar 13 horas a temperatura ambiente. El sólido resultante se filtra y se seca a vacío para dar un sólido amarillento que se identifica como 19 (658 mg, 83%) . 35
RMN-1H (DMSO-d6) : δ 8, 18 (8H, s, NCHCN) , 4, 62 (16H, s, CCH2O) , 4, 33 (16H, t, SiCH2CH2CH2CH2N) , 3, 94 (48H, s, NCH2CH2N y OCH2CH2N) , 3, 66 (16H, s, OCH2CH2N) 3, 20 (120H, s, N (CH3) 2 y N (CH3) 3) , 1, 79 (16H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 0, 51 (56, m, SiCH2) , -0, 10 (24H, s, Si (CH3) 2 y Si (CH3) ) . RMN-13C {1H} (DMSO-d6) : δ 142, 4 (NCHCN) , 123, 4 (NCHCN) , 62, 8 (CCH2O) , 62, 7 (OCH2CH2N) , 62, 4 (OCH2CH2N) , 56, 4 y 55, 6 (NCH2CH2N) , 52, 5 (N (CH3) 3) , 51, 2 (N (CH3) 2) , 48, 5 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 33, 0 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 19, 8-13, 7 (SiCH2 y SiCH2CH2) , -3, 9 40 (Si (CH3) 2) .
Ejemplo 17: Síntesis de
ck-G2-[Si (CH2) 4 (N3C2H) CH2OCH2CH2N+ (Me2) CH2CH2NMe3+]16 32I- (20)
A una disolución del dendrímero de segunda generación 12 (0, 16 g, 0, 02 mmol) en 5 ml de THF, se añaden 0, 04 ml 45 (0, 70 mmol) de ioduro de metilo y se deja agitar 14 horas a temperatura ambiente. El sólido resultante se filtra y se seca a vacío para dar un sólido amarillento que se identifica como 20 (140 mg, 60%) .
RMN-1H (DMSO-d6) : δ 8, 17 (16H, s, NCHCN) , 4, 62 (32H, s, CCH2O) , 4, 33 (32H, t, SiCH2CH2CH2CH2N) , 3, 92 (96H, s, NCH2CH2N y OCH2CH2N) , 3, 66 (32H, s, OCH2CH2N) 3, 20 (240H, s, N (CH3) 2 y N (CH3) 3) , 1, 79 (32H, m, SiCH2CH2CH2CH2N) , 0, 51 (144, m, SiCH2) , -0, 10 (132H, s, Si (CH3) 2 y Si (CH3) ) . RMN-13C {1H} (DMSO-d6) : δ 142, 4 50 (NCHCN) , 123, 4 (NCHCN) , 62, 8 (CCH2O) , 62, 7 (OCH2CH2N) , 62, 4 (OCH2CH2N) , 56, 4 y 55, 6 (NCH2CH2N) , 52, 5 (N (CH3) 3) , 51, 2 (N (CH3) 2) , 48, 5 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 33, 0 (SiCH2CH2CH2CH2N) , 19, 8-13, 7 (SiCH2 y SiCH2CH2) , -3, 9 (Si (CH3) 2) .
2. ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LOS DENDRÍMEROS 55
A continuación se muestra una evaluación de la biocompatibilidad, capacidad para actuar como vectores no virales para la liberalización de ADN en células tumorales, efecto microbicida y microestático y capacidad para vehiculizar fármacos de naturaleza aniónica de los nuevos dendrímeros catiónicos sintetizados.
2.1. ACTIVIDAD COMO VECTORES NO VIRALES PARA LA LIBERIZACIÓN DE ADN EN CÉLULAS TUMORALES.
2.1.1 Materiales y métodos
CULTIVOS CELULARES.
Las líneas celulares empleadas en este estudio fueron HepG2 (células de hepatocarcinoma humano) y HeLa (células de carcinoma cervical) . Se mantuvieron a 37°C en atmósfera humidificada con un 5% de CO2. El medio de cultivo utilizado fue DMEM (“Dulbecco´s Modified Eagle Medium-High Glucose” con 4500 mg/l de glucosa y glutamax-l) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) , penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml) . Todos los productos 5 empleados en los cultivos celulares se obtuvieron de Invitrogen Technologies (Reino Unido) .
DENDRÍMEROS.
Para este estudio se han utilizado los dendrímeros carbosilano catiónicos de generación cero, primera y segunda generación descritos en el apartado anterior. Para la discusión de este apartado los dendrímeros se han dividido en dos 10 familias, la FAMILIA 1, engloba a los dendrímeros de generación cero, primera y segunda generación con un solo nitrógeno cargado positivamente en cada rama del dendrímero (compuestos 14, 15 y 16) . La FAMILIA 2 se refiere a los dendrímeros de generación cero y primera generación que contienen 2 átomos de nitrógenos cargados positivamente en cada rama del dendrímero (compuestos 18 y 19) .
Para facilitar el seguimiento del estudio biomédico de estos dendrímeros se ha adoptado una nueva nomenclatura para simplificar la representación de estos dendrímeros. Según esta nueva nomenclatura, los dendrímeros G0-ckN4-4MeI, G1-ckN8-8MeI y G2-ckN16-16MeI se corresponden con los compuestos 14, 15 y 16 respectivamente (familia 1) , mientras que la formulación G0-ckN8-8MeI y G1-ckN16-16MeI alude a los dendrímeros 18 y 19 de la familia 2.
PURIFICACIÓN DEL PLÁSMIDO
El plásmido empleado en los estudios (pCMVLuc) , se obtuvo tras el crecimiento de bacterias E. coli modificadas en placas de cultivo agar-agar con kanamicina a una concentración de 50 µg/ml. Se tomó una unidad formadora de colonias y se creció primero en 5 ml de precultivo LB (del inglés “Lysogeny Broth”) (1% p/v peptona de caseína, 0, 5% p/v de extracto de levadura y 0, 5 % p/v de NaCl) , y kanamicina (50 µg/ml) durante 4 horas a 37°C, y después en 2 l del 25 mismo medio durante 12 horas a la misma temperatura bajo agitación orbital en un agitador Shaker modelo 625 (New Brunswick Scientific, Co. Inc, Edison, EE.UU) .
Tras la centrifugación de las bacterias a 6.000 r.p.m y 4°C durante 15 min en una centrífuga Beckman J2-HS, la purificación se llevó a cabo con el kit “Qiagen Endofree Plasmid Giga” (Qiagen, Alemania) . Una vez purificado, el 30 plásmido fue resuspendido en 1 ml de agua estéril. La concentración y pureza del plásmido se determinaron mediante espectroscopía UV midiendo la absorbancia del ADN plasmídico purificado a 310, 280 y 260 nm en un espectrofotómetro UV-visible Hewlett Packard 8452 (EE.UU) . El cociente de las absorbancias A260/ A280 de todas las muestras fue siempre mayor o igual a 1, 8, indicando un grado de pureza adecuado para el plásmido. La concentración del plásmido se calculó mediante la ley de Lambert-Beer, según la cual una unidad de absorción a 260 nm equivale a 50 35 µg/ml de ADN de doble cadena o a 40 µg/ml de ADN de cadena sencilla. Además, para garantizar la pureza del ADN plasmídico (pADN) , las muestras fueron sometidas a digestión con enzimas de restricción, comparando los fragmentos obtenidos con los productos de digestión de un pCMVLuc patrón. Para ello se tomó 1 µg de pADN, 0, 5 µL de enzima Pst I, 0, 5 µL de enzima Xho I, 2 µL de REact 2 (Invitrogen Life Technologies, Reino Unido) y la cantidad suficiente de agua para alcanzar 20 µL. Tras mantener la muestra en un baño a 37° C durante 2 horas, se analizaron los productos 40 de la digestión mediante electroforesis en gel de agarosa al 0, 8% usando TBE (
Tris
,
borato
y
EDTA
) como tampón. La fuente electroforética utilizada fue un Power Pac 300 de BioRad (EE.UU) . Las muestras se sometieron a un voltaje continuo de 80 mV durante 2 h. El ADN se visualizó mediante luz UV en una cámara oscura de aislamiento Gel doc 2000, (BioRad, EE.UU.) tras la intercalación con bromuro de etidio.
PREPARACIÓN DE LAS NANOPARTÍCULAS DENDRÍMERO/ADN
Los complejos se prepararon mediante la mezcla de volúmenes iguales de una solución de pADN con una solución de dendrímero, ambas preparadas en BHG (Tampón Hepes Glucosado) (HEPES 10 mM, glucosa al 10%, pH 7, 4) . La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. La concentración final del ADN en los complejos fue de 5 µg/ml. Las cantidades de dendrímeros y ADN fueron calculadas para obtener complejos a distintas relaciones de carga 50 (+/-) respecto al número de grupos amino terminales del polímero frente al número de grupos fosfato del ADN. Para cada familia y generación de dendrímero se obtuvieron complejos con relaciones de carga desde 1/1 hasta 30/1 (dendrímero/ADN) (+ / -) .
DETERMINACIÓN DEL TAMAÑO Y POTENCIAL ZETA 55
El tamaño y el potencial zeta se midieron por difractometría de láser en un Zetasizer Nano Series (Malvern Instruments, Reino Unido) . Para ello, se diluyeron 200 µl de complejo en 1 ml de agua bidestilada. Las medidas se realizaron por triplicado.
CARACTERIZACIÓN DE LA UNIÓN DENDRÍMERO/ADN EN LOS COMPLEJOS 60
Se prepararon complejos para las dos familias de cada generación de dendrímero a distintas relaciones de carga. Se incubaron 15 min y se sometieron a electroforesis. La cantidad de pADN por pocillo fue de 1 µg. Las condiciones de electroforesis fueron las siguientes: agarosa al 1, 2 % y un voltaje constante de 80 mV durante 2 h en TBE.
ESTUDIOS DE TRANSFECCIÓN IN VITRO EN CULTIVOS CELULARES 65
Para los cultivos de transfección se utilizaron las líneas celulares HepG2 y HeLa. Se sembraron 3 x 105 células por pocillo en DME-10 sobre placas de 48 pocillos (Iwaki Microplate 48-Well, Japón) . Cuando el grado de confluencia fue del 80% se procedió a la transfección. En cada pocillo se añadieron 300 µl de medio sin suero y 200 µl de complejo. La cantidad de pADN por pocillo fue de 1 µg. Tras 4 h de incubación a 37°C y 5% CO2 en un incubador (Forma Scientific, Inc, ) , se sustituyó el medio de transfección y se agregó DME-10. Después de 48 h, las células se lavaron con PBS 5 (tampón fosfato salino) y se lisaron con 100 µl de tampón de lisis 1X (RLB, “Reporter Lisis Buffer”) (Promega, EE.UU) . Posteriomente, se sometieron a dos ciclos de congelación descongelación a -80°C. Se analizaron 20 µl de muestra obtenida de cada pocillo, midiendo la expresión de luciferasa con el kit “Luciferase Assay” y la cantidad de proteína total mediante el kit “BioRad Dc Protein Assay”. Los resultados se expresaron en ng de luciferasa por mg de proteína.
ESTUDIOS DE TOXICIDAD DE LOS DENDRÍMEROS
Los estudios de toxicidad de los dendrímeros se llevaron a cabo mediante el ensayo “Alamar Blue”, que permite cuantificar la viabilidad celular. Para ello, se sembraron 3x105 células por pocillo en DME-10 sobre placas de 48 pocillos (Iwaki Microplate 48-Well, Japón) . Las células fueron transfectadas según el procedimiento del epígrafe anterior. Tras 4 h de incubación a 37°C y 5% CO2, se sustituyó el medio de transfección y se anadió DME-10. Después de 48 h, se 15 retiró el medio de cultivo y se añadió 1 mL de solución Alamar Blue al 10% en DME-10. Tras 2 h de incubación, se determinó la absorbancia a 570 nm y 600 nm de 200 µL de sobrenadante, mediante un lector de placas Gems READER (Labsystem, Finlandia) . El porcentaje de viabilidad de las células tratadas con cada uno de los complejos se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:
% viabilidad= (A570-A600) células tratadas x 100
(A570-A600) células sin tratar
2.1.2 Resultados.
CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA
Influencia de la generación del dendrímero y de la relación de cargas dendrímero/ADN sobre el tamaño de partícula
El tamaño de partícula se analizó mediante difractometría de láser. Se prepararon formulaciones con la Familia 1 y con la Familia 2 en todas sus generaciones a distintas relaciones de carga como se indicó en el apartado “Material y 30 Métodos”. En todos los casos se utilizó como control PAMAM G4 (comercial) a una relación de carga 5/1 (+/-) .
En la Tabla 1 se observa para la Familia 1 cómo la generación del dendrímero influye en el tamaño de los complejos, siendo los complejos preparados con la generación 2 de mayor tamaño respecto a aquellos preparados con la generación 1 y con la generación 0. Esto se observa para la mayoría de las formulaciones estudiadas. 35
Tabla 1. Tamaño de los complejos para la Familia 1 en función de la generación del dendrímero y de la relación de carga dendrímero/ADN (o poliplejo) utilizando como control PAMAM comercial G4 a una relación de carga 5/1
TAMAÑO DE PARTÍCULA (nm)
Relación de cargas
PAMAM comercial
FAMILIA 1
(+/-)
Poliplejo G4
Poliplejo G0
Poliplejo G1
Poliplejo G2
1/1
-
169 + 18
182 + 7
283 + 15
5/1
138 ± 11
116 + 15
202 + 15
217 + 16
10/1
-
108 + 12
158 + 5
163 + 11
20/1
-
+ 2
119 + 20
301 + 18
30/1
-
+ 3
+ 1
100 + 0
En cuanto a la influencia de la relación de carga (cargas positivas del dendrímero frente a negativas del ADN) en el tamaño de partícula, se observa que en general para las generaciones 0 y 1 se cumple que a medida que aumenta la relación de cargas hay una disminución en el tamaño de la partícula. Esto se cumple también para la generación 2 con excepción de la relación de cargas 20/1 donde se observa un tamaño especialmente grande respecto al resto de las formulaciones. 45
Como indica la Tabla 1 los complejos formulados con las generaciones 1 y 2 a una relación de carga 5/1, tienen un tamaño superior a la formulación con PAMAM G4 (comercial) , utilizada como control, a igual relación de carga. Respecto a la generación 0, el tamaño del complejo en estudio es similar al obtenido con la formulación control.
En la Tabla 2 se observa para la Familia 2 cómo la generación del dendrímero influye en el tamaño de los complejos, teniendo los complejos preparados con la generación 1 mayor tamaño respecto a aquellos preparados con la generación 0. Esto se observa en todas las relaciones de carga estudiadas.
Tabla 2. Tamaño de los complejos para la Familia 2 en función de la generación del dendrímero y de la relación de carga dendrímero/ADN, utilizando como control PAMAM comercial G4 a una relación de carga 5/1.
TAMAÑO DE PARTÍCULA (nm)
Relación de cargas
PAMAM comercial
FAMILIA 2
(+/-)
Poliplejo G4
Poliplejo G0
Poliplejo G1
1/1
-
107 + 4
226 + 9
5/1
147 + 3
+ 7
131 + 2
10/1
-
+ 8
121 + 7
20/1
-
+ 5
+ 11
30/1
-
+ 2
+ 1
En cuanto a la influencia de la relación de carga (cargas positivas del dendrímero frente a negativas del ADN) en el 5 tamaño de partícula para las dos generaciones se observa que a medida que aumenta la relación de carga existe una significativa disminución en el tamaño del complejo o poliplejo. Como indica la Tabla 2 en los complejos formulados con las generaciones 0 y 1 se observa que a igual relación de carga, el tamaño de los complejos en estudio es inferior al obtenido con PAMAM G4 comercial, utilizado como control.
Respecto a la influencia de la Familia en el tamaño de partícula (Tablas 1 y 2) se observa que no existen claras diferencias significativas entre el tamaño de partícula de las dos familias estudiadas para igual relación de carga y generación. Sí se observa mayor homogeneidad en el tamaño de los poliplejos preparados con el dendrímero correspondiente a la Familia 2 respecto a la Familia 1.
Influencia de la generación del dendrímero y de la relación de cargas dendrímero/ADN sobre el potencial zeta
Para estudiar la influencia de la generación del dendrímero y de la relación de carga sobre la carga superficial de las partículas (potencial zeta) , se prepararon complejos con las Familias 1 y 2 en todas sus generaciones y a distintas relaciones de carga.
Para la Familia 1 (Tabla 3) , en la generación 0 y 1, a partir de la relación 5/1 los valores son positivos; en estas dos generaciones también se observa que el potencial zeta aumenta con la relación de carga. En cuanto a la generación 2, no existe una relación entre potencial zeta de la partícula/relación de cargas dendrímero/ADN en las formulaciones estudiadas y los valores de potenciales positivos comienzan a partir de 10/1.
Respecto a la formulación con PAMAM utilizada como control, comparando los valores de las generaciones 0 y 1 con el control, se observa que no existen diferencias significativas en los valores de potencial zeta obtenidos.
Tabla 3. Potencial zeta de los complejos para la Familia 1 en función de la generación del dendrímero y de la relación de carga dendrímero/ADN utilizando como control PAMAM comercial G4 a una relación de carga 5/1 30
POTENCIAL ZETA (mV)
Relación de cargas
PAMAM comercial
FAMILIA 1
(+/-)
Poliplejo G4
Poliplejo G0
Poliplejo G1
Poliplejo G2
1/1
-
- 28 + 8
- 26 + 10
- 7 + 4
5/1
± 1
+ 3
+ 2
- 21 ± 1
10/1
-
+ 5
+ 3
± 3
20/1
-
+ 3
+ 6
+ 5
30/1
-
+ 2
29 + 10
+ 4
Para la Familia 2 (Tabla 4) , en las dos generaciones estudiadas se observa que el potencial zeta de las partículas se modifica hasta la relación de carga 10/1; a partir de este punto los valores alcanzan una meseta y se mantienen constantes alrededor de 30 y 40 mV para la generación 0 y 1 respectivamente. En cuanto a la formulación control se 35 observa que los valores de potencial zeta obtenidos con la generación 0 y 1 correspondientes a la Familia 2 (Tabla 4) son notablemente superiores al valor obtenido con PAMAM como complejo control a igual relación de carga.
Tabla 4. Potencial zeta de los complejos para la Familia 1 en función de la generación del dendrímero y de la relación de carga dendrímero/ADN 40
POTENCIAL ZETA (mV)
Relación de cargas
PAMAM comercial
FAMILIA 2
(+/-)
Poliplejo G4
Poliplejo G0
Poliplejo G1
1/1
-
- 34 + 1
- 9 + 10
5/1
8+ 2
+ 0
+ 1
10/1
-
+ 5
+ 3
20/1
-
+ 3
+ 8
30/1
-
+ 3
+ 0
Respecto a la influencia de la relación de carga, para las dos familias (Tablas 3 y 4) , Para la generación 1 se observa que a todas las relaciones de carga estudiadas los valores de potencial obtenidos con la Familia 2 son mayores que los obtenidos con la Familia 1.
CARACTERIZACIÓN DE LA UNIÓN DENDRÍMERO/ADN EN LOS COMPLEJOS
Para demostrar la unión del dendrímero al ADN se realizó un gel de retardo. Los resultados obtenidos se observan en la FIG. 1. El gel de retardo es el resultado de los efectos electrostáticos y estéricos debidos a la formación del complejo cargado entre el dendrímero catiónico y el ADN.
En la primera columna del gel aparecen las bandas del ADN correspondientes tanto al ADN circular abierto, como superenrrollado. En la segunda columna se observa solo una banda en la línea correspondendiente al ADN complejado con la formulación PAMAM comercial. En el resto de las columnas se observa que ambas familias son capaces de retener e inmovilizar al pADN en el gel en todas las relaciones de carga. La retención total del plásmido se produce en todas relaciones de carga correspondientes a las generaciones de las dos familias, desde 5/1 hasta 20/1 para la Familia 15 1 y desde 5/1 hasta 30/1 para la Familia 2.
EVALUACIÓN IN VITRO EN CULTIVOS CELULARES
Para la evaluación in vitro de las formulaciones galénicas preparadas se realizaron estudios de eficacia de transfección y de toxicidad de los dendrímeros en dos líneas celulares: HepG2 (células de hepatocarcinoma humano) y HeLa 20 (células de carcinoma cervical) .
Eficacia de transfección
Los resultados de eficacia de transfección de las Familias 1 y 2 aparecen recogidos en las Figuras 2 y 3, respectivamente. Las células fueron transfectadas con los complejos preparados con las diferentes generaciones de las 25 Familias 1 y 2 a relaciones de carga descritas en las Tablas 1 y 2 de este mismo apartado. Las células también fueron transfectadas con las siguientes formulaciones utilizadas como control:
ADN desnudo para poder evaluar las diferencias entre ADN libre y condensado.
PAMAM generación 4 a una relación de carga 5/1 como control de la formación del complejo.
Para la línea celular HepG2 (FIG 2A y 3A) , tras varios ensayos realizados con las diferentes formulaciones, para cada generación, se eligieron aquellos complejos que mostraron valores de transfección más elevados.
En cuanto a la Familia 1 para la línea celular HepG2 (FIG. 2A) se observa que la mayor eficacia de transfección se obtiene con la generación 1 a una relación de cargas 5/1. Este valor de eficacia es mayor que el valor obtenido con la 35 formulación de PAMAM comercial utilizada como control. Para la línea celular HeLa (FIG. 2B) se observa que en las tres generaciones estudiadas, la eficacia de transfección aumenta con la relación de carga. En cuanto a la relación de carga 20/1 se observa que los valores obtenidos con la generación 2 son muy superiores a los obtenidos con la generación 0 y con la generación 1.
Para la línea HepG2 (FIG. 3A) en la Familia 2, por comparación entre las dos generaciones estudiadas se observa que la mayor eficacia de transfección se obtiene con la generación 1 a una relación de cargas 5/1.
Para la línea celular HeLa (FIG. 3B) , en la Familia 2, para las dos generaciones, la eficacia de transfección aumenta hasta la relación de carga 10/1, observándose para relaciones de carga superiores una ligera tendencia a la disminución 45 de la expresión génica.
Toxicidad de los dendrímeros
Como se muestra en las Figuras 4 y 5, los complejos preparados resultaron no ser tóxicos, ya que los porcentajes de viabilidad celular obtenidos en este ensayo fueron cercanos al 100% y en ningún caso inferiores al 75%, 50 independientemente de la relación de carga, la generación y la familia empleada.
2.1.3 Discusión de resultados.
Para caracterizar los complejos preparados en este trabajo, se han realizado medidas de tamaño, carga superficial y estudios de caracterización de la unión dendrímero/ADN en gel de agarosa. 55
La Familia 2 dobla en su número de nitrógenos terminales a la Familia 1, es decir, posee un mayor número de cargas positivas, lo que explicaría que los complejos de la Familia 2 tengan mayor carga (B. Singh, A. T. Florence. Int. J. Pharm. 2005, 298, 348) (Tablas 1 y 2) . En las dos familias estudiadas se observa que al aumentar la generación hay un aumento en el tamaño de los complejos formados, siendo en la mayoría de las formulaciones para la Familia 1, los 60 complejos correspondientes a la generación 2 los de mayor tamaño en todas las relaciones de carga analizadas y para la Familia 2 los complejos correspondientes a la generación 1 los de mayor tamaño en todas las relaciones de carga estudiadas. Esto podría explicarse debido a que los pesos moleculares de las dos familias de dendrímeros aumentan en
relación con la generación, siendo la generación 2 para la Familia 1 y la generación 1 para la Familia 2 las generaciones con peso molecular más elevado. Cabe destacar que el dendrímero correspondientes a la generación 2 de la Familia 1 tiene un peso molecular mayor que el resto de todos los dendrímeros utilizados en estos ejemplos.
En general, para cada generación de las dos familias de dendrímeros se cumple que el tamaño de los complejos 5 formados disminuye con el incremento en la relación de carga ya que a mayor número de cargas positivas mayor capacidad de condensación.
Resultados similares han sido descritos por Ramaswamy y colaboradores en un estudio realizado con polilisina (C. Ramaswamy, T. Sakthivel, A. Wilderspin, A. T. Florence. Int. J. Pharm. 2003, 254, 17) . Esto no se observa a la relación 10 de carga 20/1 de la generación 2 para la Familia 1. Cabría pensar que esta diferencia en el tamaño pudiera deberse a una tendencia a la agregación, que se explicaría debido a que en generaciones grandes un aumento en la relación de cargas conlleva una disminución en el tamaño del complejo y una mayor superficie de interacción.
Por otro lado, con el incremento en la relación de carga, el exceso de cargas positivas es mayor, haciendo que los 15 complejos aumenten su potencial zeta en prácticamente todas las generaciones.
El ensayo de caracterización de la unión dendrímero/ADN (FIG. 1) demostró que todas las formulaciones preparadas de las dos familias son capaces de retener e inmovilizar al pADN en el gel de agarosa a todas las relaciones de carga estudiadas. 20
La evaluación de la eficacia de transfección in vitro mostró diferencias significativas entre los diferentes complejos. La familia (1 ó 2) , la generación del dendrímero y la relación de carga influyen en la eficacia de transfección (FIG’s 2 y 3) .
Para la Familia 1, en la línea celular HepG2 (FIG. 2A) , la eficacia de transfección es notablemente superior para la 25 generación 1 a relación de carga 5/1 respecto a la generación 0, e incluso superior a la eficacia de transfección del PAMAM comercial a igual relación de carga. En la línea celular HeLa, para esta misma familia, se observa que en las tres generaciones a mayor relación de carga, mayor potencial zeta y mayor eficacia de transfección. En cuanto a la Familia 2, en la línea celular HepG2, la mayor eficacia de transfección se obtiene con la generación 1 a relación de carga 5/1. Para la Familia 2, en la línea celular HeLa, se observa que en las dos generaciones, hay un incremento en la 30 eficacia de transfección en relación con el incremento en la relación de carga.
Este aumento en la eficacia de transfección puede deberse a que los complejos formulados con mayor relación de carga tienen mayor potencial zeta. Un exceso de cargas positivas favorece la interacción con las proteínas aniónicas y los fosfolípidos de la membrana celular y con ello la internalización del complejo. 35
Las dos líneas celulares presentan niveles de expresión muy distintos, obteniéndose mejores resultados en las células HepG2 (Figuras 2A y 3A) . Cabría pensar que las diferencias de eficacia de transfección de los distintos complejos y líneas celulares, se pudieran deber a diferencias en la toxicidad de los complejos, sin embargo, los estudios de toxicidad realizados en este trabajo demostraron que todas las formulaciones estudiadas resultaron no ser tóxicas, ya que en 40 todos los casos se observó una viabilidad celular cercana al 100% y en ningún caso inferior al 75% (FIG’s 4 y 5) .
2.2. ACTIVIDAD COMO VECTORES NO VIRALES PARA EL TRANSPORTE DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN PROCESOS DE TERAPIA GÉNICA FRENTE AL VIH.
A continuación se muestra una evaluación de la toxicidad celular, la caracterización de la unión de los dendrímeros sintetizados con pequeños ARN de interferencia (siRNA) , la caracterización de la unión dendrímero/siRNA en los complejos y por último la inhibición del VIH debida a estas moléculas sintetizadas.
2.2.1 Materiales y métodos 50
CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA (CMSP) :
La sangre se obtuvo de buffy coats procedentes de donantes sanos del Centro de Transfusiones de Madrid. Dicha sangre se diluye 2 veces con solución salina tamponada con fosfato 6, 7 mM (PBS, Bio-Whittaker®) y se procede a su centrifugación en gradiente de densidad (Ficoll-Isopaque®) . Tras dicha centrifugación se recupera el halo que contiene 55 las CMSP y se procede a dos ciclos de lavado-centrifugado posteriores con PBS (10 minutos a 1.500 r.p.m.) . Las CMSP resultantes se resuspenden en medio de completo y en condiciones de cultivo.
LÍNEA CELULAR T JURKAT CLON E6 (ATCC; línea celular de linfocitos T) :
Se creció de forma rutinaria en RPMI 1640 (Biochrom KG Seromed, Berlin, Alemania) suplementado con 5% suero fetal 60 de ternera (FCS) inactivado por calor, 1% penicilina/streptomicina, y 2 mM L-glutamina (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA-U.S.A.) a 37ºC en una atmósfera de 5% CO2.
LÍNEA SUPT1 (HUMAN LEUKEMIA T-LYMPHOCYTES) :
Se obtuvo de Amerian Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA) (catCRL 1942) . Se cultivaron en medio complete RPMI 1640 (Biochrom AG) suplementado con 10% suero bovino fetal inactivado (FBS) , 2 mM L-glutamina, 1% ampicilina, 1% cloxaciclina, 0, 32% gentamicina, 10 mM ácido 4 (2-hidroxityl) 1-piperazinaetansulfúrico (HEPES) , 1mM piruvato sódico y 4, 5 g/l de glucosa. Se incubaron a 37ºC y 5% CO2. 5
DENDRÍMEROS
Para este estudio se han utilizado los dendrímeros carbosilano catiónicos de generación cero, primera y segunda generación descritos en el apartado 2.1. Para la discusión de este apartado los dendrímeros se han dividido en dos familias, la FAMILIA 1, engloba a los dendrímeros de generación cero, primera y segunda generación con un solo 10 nitrógeno cargado positivamente en cada rama del dendrímero (compuestos 14, 15 y 16) . La FAMILIA 2 se refiere a los dendrímeros de generación cero y primera generación que contienen 2 átomos de nitrógenos cargados positivamente en cada rama del dendrímero (compuestos 18 y 19) . Los estudios de inhibición frente al VIH se han ejemplificado con los resultados obtenidos para los dendrímeros de primera generación 15 y 19.
EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD
Se utilizaron distintas técnicas con el fin de evaluar la viabilidad en diferentes aspectos: la integridad de membrana se comprobó mediante la inclusión de azul de tripano por microscopía óptica y la inclusión de yoduro de propidio por citometría de flujo y la actividad mitocondrial se midió por el reactivo MTT. Estas técnicas se aplicaron para el estudio de la toxicidad de las generaciones de dendrímeros en líneas celulares T (Jurcat y SupT1) así como en cultivos primarios 20 (CMSP humanas) .
a) Tinciones con azul de tripano
Se preparó una solución con azul de tripano (Sigma®) al 0, 8%. Las células tratadas con los dendrímeros se centrifugaron y se decantó el sobrenadante; tras resuspender el sedimento celular, se trató con la solución de azul de 25 tripano durante 30 segundos, procediéndose a centrifugación y lavado posteriormente con PBS dos veces. Las células se observaron bajo microscopía óptica y se contaron las positivas para la presencia de azul de tripano (las células azules están muertas o su membrana está dañada) en relación con el porcentaje de células negativas (células vivas) . Para ello se seleccionó un campo amplio con al menos 100 células cada vez.
b) Ensayo MTT
Esta técnica se utilizó para evidenciar efectos deletéreos sobre el metabolismo celular. Se trata de un ensayo colorimétrico basado en la capacidad selectiva de las células viables para reducir el bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difenil tetrazolio (MTT, Sigma®) en cristales insolubles de formazán. Tras el tiempo deseado de incubación de las distintas poblaciones celulares con diferentes concentraciones de dendrímeros en placa de 96 pocillos (100.000 35 células/pocillo respectivamente) , y con 3 pocillos como control positivo de inactividad celular [20% de dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma®) ], el sobrenadante que contenía dendrímero se retiró y se sustituyó por 200 μl de un medio de cultivo sin suero ni rojo fenol (Opti-MEM®) . Además de los 200 μl de Opti-MEM®, se añadieron 20 μl de MTT filtrado previamente para conseguir su esterilidad (Azul de Tiazolil, Sigma®) en PBS a una concentración de 5 mg/ml (concentración final en pocillo de 0, 5 mg MTT/ml) . Después de 4 horas de incubación en condiciones de cultivo, se 40 procedió a la centrifugación de la placa a 2.000 r.p.m. 10 minutos y a la posterior retirada del sobrenadante con el exceso MTT que no reaccionó. Los cristales de formazán se observaron al microscopio de contraste de fase y se disolvieron posteriormente con 200 μl de DMSO. La placa se agitó a 700 r.p.m. en un agitador Eppendorf ® para asegurar la correcta disolución de dichos cristales. La concentración de formazán se determinó por espectrofotometría utilizando un lector de placas a una longitud de onda de 570 nm con una referencia de 690 nm. El espectrofotómetro se 45 calibró utilizando Opti-MEM® sin células. La viabilidad celular relativa (%) respecto del control (células sin tratar) se calculó en base a la fórmula: [A] test / [A] control x 100. Cada concentración de dendrímero se ensayó por triplicado, siguiendo las directivas del ATCC. Se utilizó como control de lisis de las células Tritón x-100 al 0, 2%.
CARACTERIZACIÓN DE LA UNIÓN DENDRÍMERO/siRNA EN LOS COMPLEJOS 50
Se realizaron ensayos para evaluar la capacidad de retención de pequeños ARN de interferencia (siRNA o ARNpi) con los distintos dendrímeros sinterizados. Para ello, se utilizó el ARNi siNEF (5’-GUGCCUGGCUAGAAGCACAdTdT-3’, marcado con cianina 3 (cy3) en el extremo 5’ de la hebra sentido (SEQ ID NO: 1) y el siNEF antisentido (SEQ ID NO: 2) : 3’-UGUGCUUCUAGCCAGGCACdTdT-5’. Los complejos se formaron en H2O estéril y se almacenaron a 4ºC. La concentración dependió en cada caso del ratio de cargas deseado (desde ratio 1:1 hasta 1:8) . Para comprobar la 55 formación de los complejos, con los siRNA y valorar su total retención por parte del dendrímero, se realizaron electroforesis en las que se analizó la capacidad del dendrímero para evitar la migración del siRNA al polo positivo. El complejo formado en su totalidad se queda retenido en el pocillo o migra al polo negativo, según el ratio de cargas de cada complejo. Las mezclas se incubaron a 37ºC durante 30 minutos, se cargaron en un gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio, y se corrieron a 90 V durante 30 min. Los geles se visualizaron con luz UV. La caracterización de la 60 unión dendrímero/siRNA en los complejos se ha ejemplificado con los resultados obtenidos para los dendrímeros de primera generación 15 y 19.
ENSAYOS DE INHIBICIÓN DEL VIH
a) Preparación de la cepa X4 VIH-1NL4-3
El aislado viral X4 VIH-1NL4-3 es una cepa viral de laboratorio establecida y se utilizaron células MT-2 (línea celular de leucemia de células T con ADN de HTLV-1 integrado, que se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC) para la expansión del virus. Se lavaron 2x106 células MT-2 dos veces con medio completo (RPMI 1640 (Gibco) 5 suplementado con con 10% de Suero Fetal de Ternera (SFT) , 2mM L-glutamina y antibióticos (1% cloxaciclina, 1% ampicilina y 0.32% gentamicina) ] en placas de 24 o 96 pocillos, en condiciones de cultivo (37°C en una atmósfera de 5% CO2 y 95% de humedad relativa) y se transfirieron a un tubo cónico de 15 ml a una concentración de 2x106 células/ml en medio completo. Posteriormente, se añadió VIH-1NL4-3 a una concentración de 1 partícula por célula o lo que es lo mismo, 1 M.O.I. (“Multiplicity Of Infection”) . Se cultivaron las MT-2 con el virus durante 2 horas en condiciones 10 de cultivo, agitando el cultivo cada 15-30 minutos. Finalmente se lavaron los cultivos (células-virus) dos veces para retirar el virus no integrado en el genoma celular. Las células se transfirieron a un pocillo de placa de seis pocillos en un volumen de 3-4 ml. Se dejó en cultivo durante 2-3 días y se observó la presencia de sincitios en el pocillo. Cuando la presencia de sincitios alcanzó un 80-90% de producción, se añadieron 12 ml de medio completo con 20x106 MT-2 y se dispensaron en placa petri. A los 2-3 días, se centrifugó todo el volumen y se recogió el sobrenadante. Se añadieron 12 15 ml de medio completo con 20x106 MT-2 a las células anteriores (MT-2 infectadas) y se dispensaron en placa petri. Se repitió este proceso hasta 3 veces. El sobrenadante se alicuotó y se almacenó en un tanque de nitrógeno líquido, para posteriormente ser titulado.
b) Titulación de los virus 20
El aislado viral VIH-1NL4-3 se tituló en la línea celular MT-2. Se cultivaron 2x104 células MT-2 con medio completo en placas de 96 pocillos y se añadieron 40μl de la preparación viral a distintas concentraciones, para lo que se realizaron las correspondientes diluciones. Se dispusieron las diluciones por octuplicado y se mantuvieron en condiciones de cultivo durante una semana. Transcurrido este tiempo se procedió a la lectura de la titulación por visualización del efecto citopático. El título se calculó aplicando la fórmula de Spearman-Karber. También se tituló mediante cuantificación de 25 proteína p24 por un inmunoensayo enzimático (ELISA p24. INNOTESTTM HIV antigen mAB, Innogenetics®) con el que se establece la relación partículas infectivas por ml y µg de virus por ml. El aislado viral VIH-1Ba-L se tituló mediante cuantificación de proteína p24 por ELISA. Para asegurar la pureza del virus, las alícuotas descongeladas se filtraron a través de filtros de 0, 22 µm antes de la cuantificación.
c) Infección in vitro de los cultivos celulares primarios
Las CMSP se estimularon durante 48 horas con 2 μg/ml de PHA (fitohemaglutinina) y 50 UI de IL-2 (interleuquina 2) , para provocar una activación policlonal; a las 48 horas se lavan las células con PBS. La concentración deseada de células se incubó con el número de partículas de VIH deseado en medio completo durante 2 horas en condiciones de cultivo. Tras este tiempo se recogen las células del cultivo y se lavan tres veces con PBS para eliminar el virus no 35 integrado en el genoma celular. A continuación, las CMSP previamente infectadas se colocan en una placa de 96 pocillos (2x105 células por pocillo) en medio completo (200 µl por pocillo) y se les añade los distintos complejos a ratio 1:4. Como controles se usan los fármacos AZT (Zidovudina®) , inhibidor de la retrotranscriptasa análogo de nucleósido y T20 (Fuzeon®) , inhibidor de la entrada viral, en particular de la fusión. Tras la adición de los dendrímeros se incuba a 37ºC y 5% CO2 durante 48 horas. Trascurrido el tiempo se recoge el sobrenadante para cuantificar antígeno p24 por 40 ELISA.
2.2.2 Resultados
EVALUACIÓN DE LA CITOTOXICIDAD DE LOS DENDRÍMEROS
Para realizar una completa caracterización de las dos generaciones de cada nuevo dendrímero sintetizado, se elaboró 45 un sistema de screening para determinar las concentraciones biocompatibles que requerían un estudio más detallado. Antes de nada, se establecieron los límites de solubilidad de los dendrímeros de cada generación en agua. Se disolvieron los dendrímeros a concentraciones de 3 mM, 2 mM y 1 mM, siendo esta última la que mejor solubilidad presentaba sin la ayuda de factores físicos adicionales para su perfecta solubilización (vortex, calor, etc) . Una vez asentada la concentración de partida en todos los dendrímeros ensayados, se procedió a evaluar su citotoxicidad en las 50 células diana de nuestro estudio, las líneas celulares T Jurkat y SupT1. A concentraciones crecientes de dendrímero y se contó el porcentaje de células muertas a las 24 h mediante la técnica de azul de tripano.
Las células mostraron tinción azul superior al control a partir de 15 µM de dendrímero, por lo que se decidió centrar los estudios de viabilidad en una concentración determinada, 10 µM. La citotoxicidad se evaluó llevando a cabo ensayos de 55 actividad celular de la mitocondria, donde la reducción de sales de tetrazolio a cristales de formazán es un reflejo indirecto del correcto metabolismo de las células. Véase la Figura 6, donde se evaluaron inicialmente las 3 generaciones de los dos tipos de dendrímeros, obteniendo unos niveles aceptables de biocompatibilidad y siempre dentro de los márgenes de aceptabilidad indicados para este ensayo (no más de una disminución del 20% en la actividad celular) . Este experimento se llevó a cabo en las líneas celulares Jurkat y SupT1. A las 24 horas de tratamiento, se evaluó la 60 viabilidad celular cuantificando la reducción de sales de tetrazolio (MTT) por la mitocondria de los distintos tipos de células tratadas 24 h con los dendrímeros. Se obtuvieron niveles de producción de cristales de formazán por encima de un 80% y se determinó que la concentración de dendrímero de 10 μM es biocompatible con el metabolismo celular de las Jurkat y SupT1 tras 24h. El control de células tratadas con una molécula inerte como el dextrano no mostró toxicidad. 65
Para reproducir la toxicidad en una línea más fisiológica, se evaluó la toxicidad en CMSP de los dendrímeros de mayor generación G1-ckN8-8MeI (compuesto 15) y G1-ckN16-16MeI (compuesto 19) . La viabilidad en este caso fue similar a la obtenida en líneas celulares observándose el punto de inflexión a partir de 10 µM. Véase la Figura 7. Se observó una buena integridad de la membrana a las 24 horas con respecto al control. Otros factores pueden modificar la lectura por espectrofotometría, y se aceptó ese ligero aumento de la viabilidad debido a la presencia del dendrímero. El control 5 positivo de muerte, el Tx-100 al 0, 2%, funcionó en ambos experimentos y representó el 0% de viabilidad frente al control. La toxicidad se presentó a partir de 10 µM. La actividad mitocondrial se mostró estable a la concentración de 10 µM. El bajo daño que produce a la membrana de células fisiológicas como las CMSP, unido a la óptima actividad mitocondrial de las células en presencia de una concentración de 10 µM, determinó que los G1-ckN8-8MeI (compuesto 15) y G1-ckN16-16MeI (compuesto 19) se seleccionaran para poner a punto los ensayos de inhibición del VIH en 10 CMSP.
CARACTERIZACIÓN DE LA UNIÓN DENDRÍMERO/SIRNA EN LOS COMPLEJOS
Tras 3h de incubación, se observa la formación del complejo dendrímero/siRNA en los compuestos G1-ckN8-8MeI (compuesto 15) y G1-ckN16-16MeI (compuesto 19) a partir de los ratios 1:4 y 1:8 respectivamente caracterizada por la 15 falta de expresión de la banda a nivel del siRNA. A ratios inferiores, se observa una ligera unión caracterizada por una menor expresión de banda a nivel del siRNA a partir del ratio 1:2. El patrón de retención observado con el dendrímero G2-ckN8-8MeI (compuesto 15) se mantiene a lo largo del tiempo. Sin embargo, en el compuesto G1-ckN16-16MeI (compuesto 19) se observa que a ratio 1:4 se ha producido formación total del complejo dendrímero/siRNA. Véase la figura 8. Como ejemplo se muestran los geles de retención de los dendrímeros G1-ckN8-8MeI (compuesto 15) y G1-20 ckN16-16MeI (compuesto 19) .
ENSAYOS DE INHIBICIÓN DEL VIH
Se evaluó el posible efecto terapéutico de los dendrímeros sintetizados. Como ejemplo se muestran los ensayos de inhibición llevados a cabo con los dendrímeros G1-ckN8-8MeI (compuesto 15) y G1-ckN16-16MeI (compuesto 19) . 25 Ambos compuestos mostraron una elevada capacidad de inhibición del VIH (77% y 87%, respectivamente) , lo que confirma la aplicación terapéutica como antiviral de estos dendrímeros en un sistema más fisiológico como es una línea primaria linfoide. Se potencia de esta forma la inhibición de la replicación viral en células ya infectadas por el VIH-1 NL4.3. Se utilizó T-20 (Fuzeon) y AZT como controles de inhibición de la fusión viral y de la retrotranscriptasa inversa. Como ejemplo se muestran los ensayos de inhibición llevados a cabo con los dendrímeros G1-ckN8-8MeI (compuesto 30 15) y G1-ckN16-16MeI (compuesto 19) . Véase la Figura 9. La inhibición observada debida a los complejos fue similar a la observada con los dendrímeros sin complejar (84% y 88%, respectivamente) . Véase la Figura 9.
2.3. EFECTO BACTERICIDA/BACTERIOSTÁTICO DE LOS DENDRÍMEROS CARBOSILANO CATIÓNICOS.
2.3.1 Materiales y métodos
La concentración mínima inhibitoria (CMI) de los productos se determinó en microplacas de 96 pocillos, utilizando el método estándar ISO 20776–1. El ensayo se realiza por sextuplicado para cada concentración analizada. Para los ensayos se utilizaron las bacterias Escherichia coli (Gram negativa) y Staphylococcus aureus (Gram positiva) . Ambas cepas fueron proporcionadas por la “Colección Española de cultivos tipo” (CECT) . Se prepara una disolución madre 40 disolviendo 0, 01024 g del compuesto en estudio en 10 ml de agua destilada. Después de eso, se añade agua destilada estéril hasta obtener la concentración deseada. Las microplacas se incubaron a 37ºC durante 24 h utilizando un lector de microplacas ELX808iu (Bio-Tek Instruments) . La concentración mínima bactericida (CMB) se calcula inoculando 100 μl de las muestras utilizadas para el cálculo de CMI, en una placa de Petri con agar Mueller–Hinton (ref. 02–136, Scharlau) . Tras 48 h de incubación a 37ºC, se midió la presencia de colonias. La CMB se determinó como la 45 concentración mínima en la que no se detecta el crecimiento de bacterias.
2.3.2 Resultados
La invención recoge el estudio de la capacidad antibacteriana de los dendrímeros 14-16 y el dendrímero de primera generación 19, así como las del derivado monofuncional 13, sobre bacterias Gram positiva y Gram negativa, 50 comparando los datos obtenidos con los del antibiótico penicilina V utilizado como referencia. En particular, hemos medido la CMI y CMB (concentración mínima bactericida) de nuestros dendrímeros frente a Staphylococcus aureus (Gram positiva) y Escherichia coli (Gram negativa) . El termino CMI representa la concentración mínima de un dendrímero que puede inhibir el crecimiento de un microorganismo (efecto bacteriostático) , mientras que CMB indica la concentración mínima de un agente que puede matar a un microorganismo (efecto bactericida) . 55
Los datos de actividad biocida obtenidos para los dendrímeros recogidos en esta memoria aparecen en las tablas 5-7.
Tabla 7:- Resultados obtenidos utilizando Escherichia coli como microorganismo para analizar la capacidad antimicrobiana de la penicilina, del dendrímero y del dendrímero a una concentración sin actividad frente al microorganismo junto con penicilina. CMI, concentración mínima inhibitoria. CMB, concentración mínima bactericida.
E. coli
CMI
CMB
mg/L
µM
mg/L
µM
Penicilina
Dendrímero 15
136, 3
136, 3
Dendrímero 15 (32 mg/l) + Penicilina (512-0, 125 mg/l)
191, 4
191, 4
La capacidad bactericida de estos sistemas depende de la multivalencia del sistema dendrítico, ya que incluso el dendrímero de generación cero, con 4 cargas positivas en la periferia, es bastante más potente que su correspondiente derivado monofuncional. No obstante, la capacidad antibacteriana de estas moléculas está supeditada a una situación de compromiso entre el tamaño y el número de cargas en la periferia.
Las tablas 5 y 6 muestran que los dendrímeros carbosilano catiónicos 14-16 son más activos frente a bacterias gram positivas que frente a bacterias gram negativas, donde únicamente el dendrímero de generación cero 14 presenta una actividad moderada. Dada la poca actividad del dendrímero de primera generación 15 frente a Escherichia coli, decidimos llevar a cabo un estudio para analizar la posible sinergia entre este dendrímero y un antibiótico como la penicilina V cuya actividad frente a este tipo de bacterias es también muy limitada. Para ello llevamos a cabo la adición 15 de cantidades variables de penicilina V sobre una cantidad constante de 32 mg/l del dendrímero 15, concentración a la cual estamos seguros que el dendrímero no presenta efecto bacteriostático ni bactericida (ver tabla 5) . En la tabla 7 se puede observar como si bien, tanto la penicilina como el dendrímero carecen prácticamente de actividad antibacteriana frente a esta bacteria gram negativa, la utilización conjunta de ambos sistemas aumenta en 4 veces la capacidad biocida de la penicilina frente a esta bacteria, pasando su CMI y CMB de 256 mg/l a 64 mg/l. Así pues, este resultado 20 muestra la capacidad de nuestros dendrímeros catiónicos de interaccionar con fármacos aniónicos como la penicilina V, vehiculizándolos y ayudándolos a ejercer su acción biocida, por lo que podrían ser propuestos como agentes potenciadores de la actividad antibacteriana de antibióticos u otros compuestos con actividad antimicrobiana.
