CEPA DE TRICHODERMA ÚTIL PARA EL TRATAMIENTO YIO PREVENCiÓN DE INFECCIONES PROVOCADAS POR HONGOS PERTENECIENTES AL GÉNERO VERTICILLlUM
La presente invención se encuadra en el campo de la agricultura, la microbiología y los productos fitosanitarios, y específicamente se refiere al uso de la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040 para la prevención y/o tratamiento de infecciones de plantas y/o suelos provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium, más preferiblemente por Verticillium dahliae, agente causante de la verticilosis.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La verticilosis o marchitez vascular es una enfermedad causada por el
hongo hifomiceto Verticiflium dahliae Kleb. que puede atacar a una amplia gama de cultivos, tanto leñosos como herbáceos, entre ellos frutales,
legumbres, hortícolas, forestales, ornamentales y malas hierbas. Así, los ataques de verticilosis constituyen un serio problema en diversos cultivos como alcachofa, algodón, melón, tomate, patata u olivo.
Actualmente, en cultivos como el olivo, la verticilosis está considerada como uno de los problemas fitopatológicos más grave y amenazador,
causante de importantes pérdidas económicas. La verticilosis del olivo (VO) es una enfermedad en preocupante expansión en países donde el
olivar es un cultivo relevante, afectando severamente tanto a olivares adultos como a las plantaciones jóvenes, posiblemente como consecuencia, entre otras, del establecimiento de plantaciones intensivas en suelos infestados por el patógeno y/o de la utilización de material de plantación infectado. Los aislados de Verticillium dahliae que infectan olivos pueden ser diferenciados por su virulencia sobre la planta y
clasificarse así en los patotipos defoliante (O) o no defoliante (NO) por su capacidad o no de originar la caída generalizada de las hojas verdes de ramos infectados, respectivamente. La va puede llegar a producir la muerte de árboles enteros o la seca de ramas ocasionando un retraso en el crecimiento y mermas de producción.
En general, las verticilosis son enfermedades de difícil control, a lo cual
contribuyen factores tales como la capacidad del patógeno de sobrevivir prolongadamente en el suelo (hasta 15 años) , la amplia gama de plantas susceptibles a la infección por éste, la dificultad de llegar hasta el hongo, ya que se encuentra en el xi lema de la planta y enterrado en el suelo (a entre 10 Y 30 cm de profundidad) , y la ineficacia de los tratamientos químicos hasta ahora explorados para combatir al hongo durante su fase parasítica en el xi lema. Como sucede con otras verticilosis de plantas leñosas, el control eficiente de la VO requiere la aplicación de una estrategia de manejo integrado de la enfermedad.
Las medidas de control de las enfermedades fúngicas del olivo han sido en muchos casos indirectas (eliminación de plantas enfermas, utilización de abonos potásicos, etc.) . No obstante, desde la perspectiva de una agricultura sostenible y en una estrategia de control integrado de las enfermedades, una de las posibles medidas de control a aplicar es el uso de antagonistas microbianos con potencial como agentes de control
biológico (ACBs) de la enfermedad. El control biológico de los organismos fitopatógenos constituye una alternativa más atractiva que la de los productos químicos, ya que estos ACBs son menos perjudiciales para el
medio ambiente que los compuestos químicos habitualmente utilizados.
Sin embargo, el uso de dichos ACBs se ha visto limitado por diferentes causas, entre ellas, una inadecuada identificación de los mismos.
Algunas cepas del hongo filamentoso Trichoderma, como por ejemplo cepas pertenecientes a la especie Trichoderma harzianum, han sido utilizadas como agentes de control biológico contra hongos patógenos de plantas, debido a su capacidad protectora tanto contra hongos del suelo que infectan las raíces como contra los que producen enfermedades en las partes aéreas. Algunas de estas cepas tienen también un efecto fertilizante sobre las plantas, estimulando su vigor, crecimiento y mecanismos de defensa.
Las cepas de Trichoderma emplean distintos mecanismos para atacar a los hongos. Se han descrito relaciones de mico parasitismo entre Trichoderma harzianum y Rhizoctonia salani, Sclerotium rolfsii o Pythium,
donde las enzimas liticas juegan un papel primordial, y relaciones de competición entre Trichoderma harzianum y Botr y tis cinerea (en vid) o Fusarium (en algodón) . Así, cepas de Trichoderma harzianum,
Trichoderma virens y Trichoderma viride (Hermosa el al., 2000, Applied and Environmenla/ Microbi%gy, 66:5, pp. 1890--1898) , Y otras de Trichoderma asperellum, Trichoderma atroviride y Trichoderma inhamalum (ES2200602 A 1) , han sido utilizadas en combinación como ACBs en composiciones contra diferentes hongos patógenos de plantas. Un ejemplo de composición sinérgica de este tipo es aquella que comprende diferentes cepas de Trichoderma harzianum (aquellas con número de acceso en la colección NRRL 30595, 30596 Y 30597) que posee capacidad controladora de hongos fitopatógenos, es tolerante al estrés abiótico, estimula el crecimiento de la planta así como su contenido en fenoles e induce resistencia sistémica a enfermedades causadas por organismos fitopatógenos (W0200711 0686 A2) .
En el caso del patógeno Verticillium dahliae, se han caracterizado una amplia gama de antagonistas del mismo, entre los que se encuentran diferentes cepas de Trichoderma (Berg el al., 2005, Applied and Environmenlal Microbiology, 71 :8, pp. 4203-4213) . De hecho, uno de los métodos propuestos para el control biológico de este hongo fitopatógeno en el olivo se basa en la aplicación de esporas de Trichoderma harzianum, lo que además favorece la biofertilización (W02009083819 A1) .
Los criterios a utilizar para la elección de las cepas de Trichoderma adecuadas para su empleo como ACBs presentan como principales características: 1) producción de enzimas líticos y 2) buen desarrollo en condiciones de competición. Esto último también depende de: 3) las condiciones de producción y preparación del inóculo y de 4) factores ambientales, incluyendo la presencia de fungicidas y/o pesticidas. En este sentido, se ha desarrollado una cepa mutante de Trichoderma harzianum
CECT 2413, la cepa Trichoderma harzianum PF1, que posee una capacidad de producción de enzimas líticos superior a la de la cepa salvaje, y se ha ensayado su efecto en el crecimiento de agentes fitopatógenos como Rhizoctonia solani o Botr y tis cinerea, demostrándose que efectivamente su actividad antifúngica se encuentra incrementada con respecto a la de la cepa de la que procede (Rey el al., 2001, Applied Microbiology and Biolechnology, 55, pp. 604-608) .
En cuanto a la mejora de la capacidad de competición de las cepas en el
entorno, éste es un proceso complejo pero en algunas aproximaciones experimentales se ha intentado la obtención de cepas mejoradas, más adaptables al entorno (aumento de los mecanismos de resistencia a la sequedad, a la presencia de metales, a la producción de enzimas o sustancias tóxicas por parte de los patógenos, capacidad de colonizar suelos con pHs extremos, etc.) . Sobre todo , serían de interés cepas resistentes a fungicidas, lo que permitiría una mejor adaptación a un entorno tratado con estos compuestos y la posibilidad de un tratamiento integrado que combine pequeñas dosis de fungicidas a las que los patógenos sean sensibles combinadas con las cepas de Trichoderma resistentes. El efecto combinado permitiria un mejor control y una mayor
protección que el simple tratamiento químico o biológico. Por otro lado, la competencia de las cepas de Trichoderma en el suelo podría optimizarse aplicando de forma óptima el agente de biocontrol.
En resumen, seria deseable disponer de agentes de control biológico que proporcionasen un efecto paliativo mejorado frente a la infección por los patotipos ND y D del hongo fitopatógeno Verticilfium dahliae en variedades de plantas susceptibles de ser infectadas por el mismo, como por ejemplo, el olivo.
DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN
La presente invención propone el uso de la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040 para la prevención y/o tratamiento de infecciones de plantas y/o suelos provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al
género Verticillium, más preferiblemente por los patotipos defoliante o no defoliante de Verticillium dahliae, agente causante de la verticilosis.
Los ejemplos de la presente invención demuestran que la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 presenta una capacidad de inhibir el crecimiento del hongo fitopatógeno Verticilfium dahliae mejorada con respecto a otras cepas de su mismo género, y esta inhibición se observa tanto en aislados del patógeno con capacidad defoliante como no defoliante, y tanto sensibles como resistentes a hongos del género Trichoderma (Figuras 2 y 3) . Por tanto, la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040 posee un elevado valor paliativo y preventivo frente a la infección de plantas y/o suelos provocada por hongos fitopatógenos del género Verticillium, más preferiblemente por Verticillium dahliae, siendo aplicable tanto en condiciones de vivero como de campo.
Por todo ello, un aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040, y/o de los productos de su metabolismo, para la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Vertió/lium.
La cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 es conocida en el estado de la técnica y por tanto se encuentra accesible para un experto en la materia. Dicha cepa es identificable tanto por sus características morfológicas, las cuales se pueden encontrar descritas en bases de datos para Trichoderma tales como por ejemplo, pero sin limitarnos, la recogida en http://www.isth.info, como por ciertos marcadores moleculares, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la secuencia de los espaciadores internos de los genes de rRNA, ITS1 e ITS2.
Tal y como se utiliza en la presente invención, el término "productos del
metabolismo" o "metabolitos" se refiere a cualquier molécula excretada por la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040, preferiblemente cuando dicha cepa se encuentra creciendo en presencia de medio de cultivo PDA (Agar Patata-Dextrosa) . Ejemplos de estos metabolitos son,
aunque sin limitarnos, aminoácidos, nucleótidos, vitaminas, ácidos orgánicos, alcoholes, como los polioles, azúcares, como los polisacáridos,
antibióticos, enzimas, tales como por ejemplo, aunque sin limitarnos, enzimas hidrolíticas de pared celular, etc.
Una vez excretados, los productos del metabolismo de la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 pueden ser aislados y aplicados, solos o en combinación con dicha cepa, directamente a la planta, tanto a las raíces como a la parte aérea, al material vegetal, incluyendo pero sin limitarnos semillas, hojas o frutos, o al suelo. Cuando los productos del
metabolismo son administrados en combinación con la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040, el modo de administración puede ser simultáneo o secuencial. O bien, la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 puede ser
administrada sola tanto a las raíces como a la parte aérea de la planta, al material vegetal, incluyendo pero sin limitarnos semillas, hojas o frutos, o al suelo, de manera que produzca dichos productos del metabolismo in
situ.
La cepa Trichoderma atroviride IMI 206040, y/o los productos de su metabolismo, pueden administrarse a, por ejemplo pero sin limitarnos, una planta, tanto a las raíces como a la parte aérea, al material vegetal, incluyendo pero sin limitarnos semillas, hojas o frutos, o al suelo, en una cantidad efectiva para el tratamiento y/o prevención de infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad suficiente de la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040, ylo de los productos de su metabolismo, que permita obtener los resultados deseados. Dicha cantidad efectiva puede administrarse en una sola vez o en varias administraciones. En términos de tratamiento y prevención, una "cantidad suficiente" es la cantidad suficiente para evitar, paliar, mejorar, estabilizar, revertir, retardar o retrasar los efectos derivados de las infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticilfium. Preferiblemente, la cantidad efectiva a administrar de la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 es de entre 10' Y 10' esporas/mi de agua de riego, y más preferiblemente de 105 esporas/mi (a partir de 1, 4 x 10" unidades formadoras de colonias/g) .
El modo de administración de la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040, y/o de los productos de su metabolismo, puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante el agua de riego, pulverización, rociado, revestimiento, fumigación, impregnación, mezcla con el sustrato, inmersión de la raíz de la planta en una solución que comprenda la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040, o esporas de la misma pregerminadas, y/o los productos de su metabolismo.
Los "hongos fitopatógenos" son aquellos organismos pertenecientes al
reino Fungi capaces de provocar infecciones, y en ocasiones enfermedades, en las plantas por medio de alteraciones en su metabolismo, mediante por ejemplo, aunque sin limitarnos, la secreción de enzimas, toxinas, fitoreguladores y otras sustancias y, además,
mediante la absorción de nutrientes de la planta para su propio crecimiento. Los hongos fitopatógenos de la presente invención son aquellos pertenecientes al género Verticillium.
El género de hongos Verticillium pertenece a la división o filo Ascomicota,
familia Plectosphaereflaceae e incluye diversos grupos que comprenden parásitos y saprófitos de plantas, insectos, nemátodos, huevos de moluscos y otros hongos, por lo que el género tiene un amplio rango de grupos taxonómicos, conteniendo unas 51 especies, entre las que se encuentran, aunque sin limitarnos, Verticillium dahliae, Verticillium alboatrum, Verticillium nubilium, Verticillium nigrescens o Verticillium tricorpus. Las especies de este género son las causantes de las enfermedades conocidas como verticilosis.
La presencia de hongos fitopatógenos del género Verticiflium en las plantas o en el suelo puede detectarse mediante técnicas de biología molecular conocidas en el estado de la técnica para llevar a cabo dicha identificación, como por ejemplo, amplificando mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) o O-PCR, una región del genama del hongo fitopatógeno presente en una muestra biológica aislada del suelo o de la planta y comparando el producto de amplificación obtenido con las secuencias génicas disponibles en bases de datos tales como, por ejemplo, pero sin limitarnos, GenBank, especificas de organismos del género Vertici/lium, para determinar el tipo de patógeno presente en la muestra. La presencia de hongos fitopatógenos del género Vertici/lium en las plantas o en el suelo también podría llevarse a cabo mediante técnicas inmunohistoquímicas, como por
ejemplo, pero sin limitarnos, ELlSA; o bien mediante el crecimiento in vi/ro de los organismos contenidos en la muestra biológica aislada de suelo o de la planta en medios de cultivo selectivos específicos de patógenos pertenecientes al género Verticillium. En este sentido, el método más sencillo para identificar patógenos de este género mediante el cultivo en un medio selectivo es, por ejemplo, aunque sin limitarnos, el cultivo en medio PDA (Agar Patata-Dextrosa) a temperatura ambiente, donde las colonias crecen de color blanco y el color del fondo de las placas es entre incoloro y amarillento. Algunos cultivos pueden tener un perfil bajo con bordes redondeados y formando curvas. Las especies Verticillium alboatrum, Verticillium dahliae y Verticillium tricorpus presentan colonias postradas y de un color amarillo anaranjado en medio de cultivo PDA, la especie Verticillium nubilium forma clamidosporas globosas y Verticillium nigrescens forma clamidosporas abundantes.
En una realización preferida, el hongo fitopatógeno es Verticilfium dahliae.
La especie Verticillium dahliae se caracteriza por la producción de conidióforos con fiálidas dispuestas en verticilo y la formación de numerosos microesclerocios, estructuras de resistencia. El hongo se puede encontrar en el suelo en forma de micelio y conidios, o en forma de microesclerocios. Algunos cultivos infectados por este patógeno pueden ser asintomáticos, pero en general se distinguen dos tipos de síndromes derivados de esta infección que origina la enfermedad denominada "verticilosis": apoplejía y decaimiento lento. Los síntomas iniciales del primer síndrome consisten en la pérdida de coloración de las hojas, más tarde se produce una seca rápida de brotes y ramas que suele comenzar
desde la punta y que puede ocasionar la muerte del árbol. La corteza de las ramas afectadas puede tomar color morado o púrpura y a veces también se observa una coloración marrón en los tejidos del xi lema. Los síntomas más típicos del decaimiento lento son la necrosis y momificado de las inflorescencias mientras que las hojas generalmente se desprenden, excepto las del extremo. En el contexto de la presente invención, se incluyen dentro del término "Verticillium dahliae" tanto su patotipo defoliante (D) como su patotipo no defoliante (ND) . El patotipo D
de Verticillium dahliae se caracteriza por provocar la caída generalizada de las hojas verdes de ramos infectados, al contrario que el patotipo ND. El diagnóstico de la infección por uno u otro pato tipo de Verticilfium
dahliae podría llevarse a cabo mediante técnicas de visualización fenotípica en base a la característica sintomática anteriormente mencionada, o bien mediante técnicas moleculares de caracterización de ambos patotipos, como por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante PCR (Mercado-Blanco et al., 2002, Olivae: revista oficial del Consejo Oleícola Internacional, 94:41-46) .
Ejemplos de plantas susceptibles a la infección por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium, y preferiblemente por Verticillium dahliae, son, pero sin limitarnos, alcachofa, algodón, melón, tomate, patata u olivo. Por tanto, en otra realización preferida, la planta afectada por el hongo fitopatógeno se selecciona de la lista que comprende: alcachofa, algodón, melón, tomate, patata u olivo. En una realización más preferida, la planta es el olivo. Cuando Verticilfium dahliae infecta al olivo provoca lo que se denomina "verticilosis del olivo o VO". La presente invención se refiere tanto a las variedades de olivo muy susceptibles al
patotipo D, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, Picualo Arbequina, como a las variedades susceptibles al patotipo ND.
El término "tratamiento", tal como se entiende en la presente invención , se refiere a combatir los efectos provocados como consecuencia de una infección causada por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticilfium, preferiblemente por Verticillium dahliae, en una planta, en un cultivo o en un suelo. Este término incluye:
(i) inhibir la infección, es decir, detener su desarrollo;
(ii) aliviar los efectos provocados por la infección, es decir, causar su regresión; (jii) estabilizar los efectos provocados por la infección.
El término "prevención", tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar la aparición de daños cuya causa sean las infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium, preferiblemente por Verticillium dahliae; es decir, evitar que se produzca la infección en una planta, en un cultivo o en un suelo, en particular, cuando dicha planta, cultivo o suelo tienen predisposición a la infección pero aún no se ha diagnosticado que la tengan.
Se entiende por "infección" la colonización de un organismo huésped, por
ejemplo, aunque sin limitarnos, una planta, por agentes patógenos, los cuales en el contexto de la presente invención consisten en hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium, que invaden el
organismo y se multiplican en él, produciendo sustancias tóxicas. El organismo colonizador es perjudicial para el funcionamiento normal y la supervivencia del huésped, por lo que se califica al agente como patógeno o, en el contexto de la presente invención, como fitopatógeno. Dentro del término "infección" se incluyen tanto las infecciones localizadas que afectan a una única área del organismo huésped, como las infecciones generalizadas que afectan a todo el organismo; y tanto las infecciones sintomáticas como asintomáticas. Asimismo, dentro de dicho término se incluyen también infecciones de suelos provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium, preferiblemente por Verticillium dahliae.
En los ejemplos de la presente invención se demuestra la eficacia, no solo de la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 Y de sus productos del
metabolismo, sino también de otras cepas de Trichoderma, en concreto de Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT
20756, Trichoderma harzianum PF1 y Trichoderma harzianum CECT
2413, y de los productos del metabolismo de éstas, para inhibir el
crecimiento de hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium,
como por ejemplo, pero sin limitarnos, de Verticillium dahliae. Por ello,
S otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso
de la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040, y/o de los
productos de su metabolismo, en combinación con al menos una cepa de
Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma
atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 20756,
10 Trichoderma harzianum PF1 o Trichoderma harzianum CECT 2413, para
la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por hongos
fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium.
En los ejemplos de la presente invención también se demuestra la
15 eficacia de la combinación de las cinco cepas de Trichoderma:
Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma atroviride CECT 20755,
Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma harzianum CECT
20756 y Trichoderma harzianum PF1 , para inhibir el crecimiento de
hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium, como por
20 ejemplo, aunque sin limitarnos, de Verticiflium dahliae. Por ello, una
realización más preferida se refiere al uso de la cepa de hongos
Trichoderma atroviride IMI 206040, y/o de los productos de su
metabolismo, en combinación con las cepas de Trichoderma: Trichoderma
atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma
25 harzianum CECT 20756 y Trichoderma harzianum PF1, para la
prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por hongos
fitopatógenos pertenecientes al género Verticiflium.
Las cepas Trichoderma harzianum PF1, Trichoderma atroviride CECT
30 20755, Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT
2413 y Trichoderma harzianum CECT 20756 pueden administrarse a una
planta, tanto a las raíces como a la parte aérea, al material vegetal,
incluyendo pero sin limitarnos semillas, hojas o frutos, o al suelo, para el tratamiento y/o prevención de infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium, preferiblemente por Verticillium dahliae, de manera simultánea o secuencial. Además, dichas cepas pueden administrarse en combinación con elementos necesarios para su crecimiento y desarrollo, como por ejemplo aunque sin limitarnos, fuentes de carbono, sales minerales y/o nutrientes orgánicos e inorgánicos.
En una realización aun más preferida las cepas de Trichoderma Trichoderma harzianum PF1, Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 y/o Trichoderma harzianum CECT 20756 se encuentran en estado esporulado.
Se entiende por "estado esporulado" el estadio del hongo en el que éste se encuentra en forma de espora. El término "espora" se refiere a la célula reproductora producida en los esporangios de los hongos, ya sea asexualmente o como resultado de un proceso de reproducción sexual, generalmente haploide y unicelular, que al mismo tiempo permite la dispersión y la supervivencia por largo tiempo (dormancia) en condiciones adversas. La espora produce un nuevo organismo al dividirse por mitosis sin fusión con otra célula, produciendo un gametofito pluricelular. Cuando la espora germina surge de ella una primera hila, por cuya extensión y
ramificación se va constituyendo un micelio.
Los ejemplos de la presente invención demuestran que cuando se inoculan hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium, tales como por ejemplo, aunque sin limitarnos, Verticilfium dahliae, en un medio de cultivo donde previamente ha crecido la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 Y excretado toda clase de metabolitos antes de ser retirada de dicho medio, existe inhibición del crecimiento del hongo litopatógeno.
También demuestran dicha inhibición cuando el patógeno se inocula en un medio de cultivo donde previamente han crecido las cepas de
Trichoderma Trichoderma harzianum PF1 , Trichoderma atroviride CECT
20755, Trichoderma harzianum CECT 2413 y/o Trichoderma harzianum CECT 20756 y excretado toda clase de metabolitos antes de ser retiradas de dicho medio. Así, los inventores ponen de manifiesto que tanto el
micelio de la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 Y de estas otras cepas de Trichoderma, como los metabolitos excretados al medio por las mismas, son capaces de inhibir el crecimiento de hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticillium, tales como por ejemplo, aunque sin limitarnos, Verticillium dahliae. Por ello, otra realización preferida se refiere al uso de la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040,
y/o de los productos de su metabolismo, en combinación con productos del metabolismo de al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma harzianum PF1, Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 2413 o Trichoderma harzianum CECT 20756, para la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al
género Verticiflium. Una realización más preferida se refiere al uso de la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040, y/o de los productos de su metabolismo, en combinación con productos del metabolismo de las cepas de Trichoderma: Trichoderma harzianum PF1 , Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 2413 y Trichoderma harzianum CECT 20756, para la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al
género Verticillium.
Las cepas Trichoderma harzianum PF1 , Trichoderma harzianum CECT
2413, y los mutantes Trichoderma atroviride CECT 20755 y Trichoderma harzianum CECT 20756, se encuentran accesibles para un experto en la materia. Trichoderma harzianum PF1 es una cepa mutante derivada de Trichoderma harzianum CECT 2413 inducida con nitrosoguanidina,
caracterizada por su capacidad superexcretora de enzimas hidrolíticas (glucanasas, proteasas y/o quitinasas) . Esta cepa comparte las características morfológicas de la cepa de la que procede. La cepa Trichoderma harzianum CECT 2413 es identificable tanto por sus características morfológicas, las cuales se pueden encontrar descritas en bases de datos para Trichoderma tales como por ejemplo, pero sin limitarnos, la recogida en http://www.isth.info. como por ciertos marcadores moleculares, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, la secuencia de los espaciadores internos de los genes de rRNA, ITS 1 e ITS2. El mutante derivado de Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma atroviride CECT 20755 o RCU1 , y el mutante derivado de
Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma harzianum CECT
20756 o RCU2, ambos resistentes a cobre, comparten las caracteristicas morfológicas de las cepas de las que proceden.
Las cepas Trichoderma atroviride CECT 20755 o RCUl y Trichoderma harzianum CECT 20756 o RCU2 son resistentes a cobre, metal utilizado como fungicida principalmente en el sector del olivar. Por tanto, esta capacidad permite el uso de las mismas de manera combinada con otros agentes antifúngicos en un método de tratamiento y/o prevención de infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al
género Verticillium. Por ello, otra realización preferida se refiere al uso de la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040, y/o de los productos de su metabolismo, en combinación con otros agentes antifúngicos, para la prevención y/o tratamiento de infecciones provocadas por hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticilfium. Cuando la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040, y/o los productos de su metabolismo, se administra en combinación con una de las cepas RCUl o RCU2, o con las dos, puede ser utilizada en combinación con otros agentes antifúngicos de naturaleza química.
El término "agente antifúngico" se refiere a aquellas sustancias, tanto de naturaleza biológica como química, que se emplean para inhibir el crecimiento (fungistáticos) o para matar (fungicidas) a los hongos capaces de provocar infecciones en las plantas y/o suelos, preferiblemente a Verticillium, más preferiblemente a Verticillium dahliae. El término se refiere tanto a agentes antifúngicos protectores o de contacto, que se aplican antes de que se produzca la infección, como a agentes antifúngicos erradicadores o sistemáticos, que se aplican una vez producida la infección, así como a agentes antifúngicos de uso en revestimientos de semillas, de uso para desinfección del suelo, para su aplicación sobre las plantas, etc. Un ejemplo de agente antifúngico de naturaleza biológica son los microorganismos que actúan como agentes de control biológico de hongos fitopatógenos, como por ejemplo, pero sin limitarnos, hongos del género Trichoderma distintos a los descritos en la presente invención, hongos pertenecientes a otros géneros o bacterias, y sus mezclas, siempre y cuando éstos no sean incompatibles con las cepas Trichoderma harzianum PF1 , Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma harzianum CECT 2413 y Trichoderma harzianum CECT 20756. Algunos tipos de "agentes antifúngicos de naturaleza química" son , aunque sin limitarnos, aquellos compuestos por cloruro de cobre, oxicloruro de cobre, óxido cúprico,
"caldo bordelés", quinolinolato de cobre-S, carbonato de cobre básico, naftenato de cobre, sulfato de cobre, cromato de cobre u oleato de cobre.
Por otro lado, los hongos pertenecientes al género Trichoderma con frecuencia actúan como agentes fertilizantes. Por esta razón , y porque además la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 posee capacidad para inhibir el crecimiento de hongos fitopatógenos pertenecientes al género Verticilfium, los cuales pueden comprometer la viabilidad y el desarrollo de la planta a la que infectan o la idoneidad del suelo de cultivo, otra aplicación de la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 y/o de los productos de su metabolismo, es su uso como fertilizante, preferiblemente en plantas de olivo. Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040, y/o de los productos de su metabolismo, en combinación con al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma harzianum PF1 , Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 2413 o Trichoderma harzianum CECT 20756, como fertilizante. Una realización más preferida se refiere al uso de la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040, y/o de los productos de su metabolismo, en combinación con las cepas de Trichoderma: Trichoderma harzianum PF1 , Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 2413 y Trichoderma harzianum CECT 20756, como fertilizante.
Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040, y/o de los productos de su metabolismo, en combinación con productos del metabolismo de al menos una cepa de Trichoderma seleccionada de la lista que comprende: Trichoderma harzianum PF1 , Trichoderma afroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 2413 o Trichoderma harzianum CECT 20756, como fertilizante. Una realización más preferida se refiere al uso de la cepa de hongos Trichoderma atroviride IMI 206040,
y/o de los productos de su metabolismo, en combinación con productos del metabolismo de las cepas de Trichoderma: Trichoderma harzianum PF1 , Trichoderma atroviride CECT 20755, Trichoderma harzianum CECT 2413 Y Trichoderma harzianum CECT 20756, como fertilizante.
El término "fertilizante" se refiere a cualquier sustancia o mezcla de sustancias químicas y/o biológicas, de origen natural o sintético, utilizada para suministrar los elementos inorgánicos u orgánicos al suelo con el fin de que la planta los absorba y favorecer así su crecimiento o vigor.
El término "género" se refiere a la categoría de la clasificación biológica (categoria taxonómica) que se ubica entre la familia y la especie y que comprende una o más especies morfológicamente similares relacionadas filogenéticamente. Por "categoría taxonómica" se entiende el nivel de jerarquía utilizado para la clasificación de los organismos.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Muestra los resultados de los ensayos de enfrentamiento directo entre la cepa Trichoderma afroviride IMI 206040, o una combinación de Trichoderma atroviride IMI 206040 Y Trichoderma harzianum CECT 2413, y distintos aislados de Verticillium dahliae. Placas de Petri conteniendo PDA a distintos tiempos de incubación (3 y 15 dias) a 22 'e en las que se encuentran creciendo: (A) diferentes aislados de V. dahliae (control) , (B) diferentes aislados de V. dahliae en un extremo y Trichoderma atroviride IMI 206040 en otro extremo, (e) diferentes aislados de V. dahliae en un extremo y una combinación de las cepas Trichoderma atroviride IMI 206040 Y Trichoderma harzianum eEeT 2413 en otro extremo.
Fig. 2. Muestra el crecimiento de distintos aislados de Verticillium dahliae durante los ensayos de enfrentamiento directo con las cepas Trichoderma harzianum CECT 2413 (2413) , Trichoderma viride CECT 2423 (2423) o Trichoderma atroviride IMI 206040 (IMI) , o combinaciones de las mismas, a los 3 (blanco) , 6 (gris) y 15 (negro) dias de incubación. (A) Aislado de V. dahliae 1A-2. (B) Aislado de V. dahliae 1A-3. (e) Aislado de V. dahliae 1A-4. (D) Aislado de V. dahliae 2A-12. (E) Aislado de V. dahliae 2A-16. (F) Aislado de V. dahliae 2A-17.
(G) Aislado de V. dahliae 4B-31. (H) Aislado de V. dahliae 4B-34. (1) Aislado de V. dahliae 4B-35.
Fig. 3. Muestra los resultados de los ensayos de enfrentamiento directo entre las cepas de Triehoderma Triehoderma alroviride IMI 206040, Triehoderma alroviride RCU1, Triehoderma harzianum CECT 2413, Triehoderma harzianum RCU2 y/o Triehoderma harzianum PF1 , y dos aislados de Verlieillium dahliae. (A) Placas de Petri en las que se encuentran creciendo en un extremo las cepas Trichoderma atroviride IMI
206040, Triehoderma atroviride Re U1 o Triehoderma harzianum e Ee T 2413, Y en el extremo opuesto los aislados de Vertieillium dahliae 1 A-2 ó 2A-12. (B) Placas de Petri en las que se encuentran creciendo en un extremo las cepas Trichoderma harzianum RCU2, Trichoderma harzianum PFl o una combinación de las cinco cepas Trichoderma afroviride IMI
206040, Triehoderma atroviride Re U1 , Triehoderma harzianum e ECT 241 3, Triehoderma harzianum Re U2 y Triehoderma harzianum PF1 , formada por 1/5 de cada una (formulación) , y en el extremo opuesto los aislados de Vertici/lium dahliae 1 A-2 ó 2A-12. Control: cajas de Petri en las que únicamente se inoculó Vertieil/ium dahliae 1 A-2 ó 2A-12. Las imágenes se tomaron tras 18 días de crecimiento.
Fig. 4. Muestra la inhibición del crecimiento (%) en cultivos de diez días de los distintos aislados de Verlieillium (1A2, 1A3, 1A4, 2A12, 2A16, 2A17, 4B31 , 4B34, 4B35) por los metabolitos de las cepas T. harzianum CECT 2413 (2413) , T. atroviride IMI 206040 (IMI) Y T. viride CECT 2423 (VIRIDE) o por los melabolilos de las combinaciones de
estas cepas entre sí.
Fig. 5. Muestra el crecimiento de dos aislados de Verticillium dahliae, lA-2 (A) Y 2A-12 (B) , en medios donde habían crecido previamente las cepas de Trichoderma, Trichoderma atroviride IMI 206040 (T. atroviride) , Trichoderma atroviride RCU1, Trichoderma harzianum CECT 2413 (T. harzianum) , Trichoderma harzianum RCU2 o Trichoderma harzianum PF1, o una combinación de estas cinco cepas formada por l/S de cada una (formulación) . La figura muestra el crecimiento de dos aislados del patógeno en presencia de metabolitos excretados por las diferentes cepas de Trichoderma. Control: crecimiento de Verticillium dah/iae 1A·2 (A) ó 2A·12 (B) en cajas de Petri en las que no había crecido ninguna cepa de Trichoderma previamente.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de la cepa Trichoderma atroviride IMI 206040 en la inhibición del crecimiento de aislados representativos de los patotipos defoliante y no defoliante del hongo fitopatógeno Verticillium dah/iae. Estos ejemplos especificos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1. Ensayos de antagonismo in vitro de distintas cepas de Trichoderma y aislados de Verticillium dahliae.
Se procedió a la realización de un conjunto de ensayos de antagonismo in vi/ro de distintas cepas de Trichoderma. o combinaciones de cepas. con el objeto de determinar su capacidad antifúngica frente a aislados de Vertici/lium dahliae suministrados por el Instituto de Agricultura Sostenible (IAS-CSIC-Córdoba) . Así, se realizaron dos tipos de ensayos de antagonismo: uno de confrontación directa y otro de capacidad de crecimiento de distintos aislados de Verticillium dahliae en un medio donde Trichoderma había crecido previamente y excretado toda clase de metabolitos (incluidos antibióticos y enzimas hidrolíticas de pared celular) .
Como se explicará más adelante, los ensayos incluyeron enfrentamiento directo en medio sólido y ensayos con celofanes para ver el efecto de las sustancias secretadas por Trichoderma, siguiendo protocolos habituales en el laboratorio para ensayos con Rhizoctonia y Fusarium.
Las cepas de Trichoderma utilizadas en los ensayos fueron : Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma viride CECT 2423 y Trichoderma atroviride IMI 206040, así como las siguientes combinaciones de las mismas: T atroviride IMI 206040 + T viride CECT 2423, T harzianum CECT 2413 + T atroviride IMI 206040, Y T harzianum CECT 2413 + T viride CECT 2423, y en combinación con los aislados de Verticiflium 1 A-2, 1A-3, 1 A-4, caracterizados como patotipos defoliantes, y 2A-12, 2A-1 6, 2A-17, 4B-31, 4B-34, 4B-35, con capacidad no defoliante.
Además, se procedió al desarrollo y caracterización de mutantes espontáneos resistentes a cobre (a 4 mM de Cu, SO, ) derivados de Trichoderma harzianum y de Trichoderma atroviride, con el objeto de disponer así de cepas resistentes a los contaminantes metálicos utilizados como antifúngicos, entre los cuales el cobre es ampliamente utilizado en el sector del olivar. Concretamente, dichas cepas mutantes son las que a continuación se detallan y que en la actualidad se encuentran depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) :
- Trichoderma atroviride RCU1 (número de depósito en la CECT 20755) , derivado de Trichoderma atroviride IMI 206040. -Trichoderma harzianum RCU2 (número de depósito en la CECT 20756) , derivado de Trichoderma harzianum CECT 2413.
Además, en los ensayos de la presente invención se incluyó también la cepa Trichoderma harzianum PF1, mutante inducido con nitrosoguanidina derivado de Trichoderma harzianum CECT 2413 con una elevada capacidad antifúngica y que se caracteriza como superexcretor de enzimas hidroliticas (glucanasas, proteasas y quitinasas) .
Se han realizado también ensayos para comprobar la eficacia in vitro de una composición que comprende cinco cepas de Trichoderma:
Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma atroviride RCU1 , Trichoderma harzianum CECT 2413, Trichoderma harzianum RCU2 y Trichoderma harzianum PF1 .
En los experimentos se pretendía, por tanto, establecer la capacidad de distintas cepas del hongo Trichoderma de controlar a aislados de Verticillium dahliae causantes de la verticilosis en el olivo.
1.1. Ensayos de confrontación directa de distintas cepas de Trichoderma y aislados de VertiÓ/lium dahliae.
Los ensayos de confrontación directa consistieron en inocular una porción de micelio de los distintos aislados de V. dahliae a ensayar en un extremo de cajas de Petri conteniendo medio de cultivo nutritivo POA (puré de patatas 2%, glucosa 2%, agar 2%) . Las cajas se incubaron a 22 2C
durante 4 días para permitir el crecimiento del patógeno y posteriormente se inocularon, en el extremo opuesto de las cajas, 20 fll de esporas de las distintas cepas de Trichoderma a una concentración de 105 esporas/mI. Las cajas continuaron incubándose a 22 2C durante 18 días. Como control se inocularon cajas con medio nutritivo POA con los distintos aislados de V. dahliae en las que no se inoculó Trichoderma.
Al cabo del tiempo, los hongos entraron en contacto y podían darse dos situaciones distintas: que ambos parasen su crecimiento en la zona de contacto o que uno de ellos provocase una lisis del micelio del otro y
acabase creciendo por encima de éste. De hecho, el efecto antagonista se comprobó viendo el sobrecrecimiento de Trichoderma y la posible muerte del patógeno al microscopio y por siembra en medio selectivo para el patógeno (crecimiento en presencia de tóxicos en el que Trichoderma no podía crecer pero al que el patógeno era resistente) .
En la figura 1 se aprecian los resultados de los enfrentamientos de la cepa T. atroviride IMI 206040 (Fig. 1 B) , o de la combinación de cepas T. atroviride IMI 206040 Y T. harzianum CECT 2413 (Fig. 1C) , con diferentes aislados de Verticiflium. Así, se observó que la cepa T. atroviride IMI 206040 Y la combinación de cepas T. atroviride IMI 206040 Y T. harzianum CECT 2413 sobrecrecían al patógeno, reduciendo el área ocupada por el mismo.
Para analizar cuantitativamente los resultados obtenidos se midió el área de crecimiento de las distintas cepas de Verticillium en los diferentes ensayos de enfrentamiento con Trichoderma. Los resultados obtenidos se representan en la figura 2 A-I a diferentes tiempos de incubación (3, 6, Y 15 días) . Se observó que en la mayoría de los casos las cepas de Trichoderma empleadas sobrecrecían al patógeno, aunque en algunos casos las cepas sólo consiguieron parar su crecimiento (véase el caso de T. harzianum CECT 2413 contra V. dahliae 1A-3 y 1A-4) . La cepa más eficiente fue T. atroviride IMI 206040, capaz de reducir el crecimiento del patógeno en el 100% de los casos, y sólo contra la cepa de Verticilfium 2A-17 una combinación de T. atroviride IMI 206040 con T. viride CECT 2423 mejoró la capacidad antagonista de IMI de manera individual (Fig. 2) .
Por tanto, el análisis de estos resultados mostró un efecto inhibidor del
crecimiento, tanto de aislados de Verticillium defoliantes como no defoliantes, fundamentalmente en el caso de Trichoderma atroviride IMI
206040, sola o en combinación con T. viride CECT 2423 y T. harzianum CECT 2413, y con una clara tendencia que se hizo patente tras 15 días de incubación, anulando por completo el crecimiento del patógeno Verticillium.
En la figura 3 se aprecian los resultados de los enfrentamientos de las cepas T. atroviride IMI 206040, T. atroviride RCU1 , T. harzianum CECT 2413, T. harzianum RCU2, T. harzianum PF1 , o una combinación de estas cinco cepas (formulación) , con los aislados de Verticillium 1 A-2, representante del patotipo defoliante, o 2A-12, aislado más sensible a cepas del género Trichoderma representante del patotipo no defoliante. Como se puede observar, la composición de estas cinco cepas de Trichoderma (formulación) fue más eficaz frente a los dos aislados de Verticillium dahliae ensayados que la mayoría de las cepas que la componen por separado, salvo en el caso de Trichoderma atroviride IMI 206040 Y de su cepa derivada, RCU 1, que presentan una capacidad similar.
1.2. Ensayos de capacidad de crecimienlo de distintos aislados de Verticillium dahliae en presencia de metabolitos excretados por
Trichoderma.
Se realizaron ensayos de capacidad de crecimiento del patógeno en presencia de metabolilos excretados por Trichoderma mediante el cultivo de las cepas de Trichoderma sobre un disco de celofán permeable a metabolitos extracelulares (hidrolasas, antibióticos, etc.) colocado a su vez sobre el medio de cultivo PDA de una caja de Petri, a 22 'C. A los cuatro días de crecimiento, se retiró el celofán y con él el micelio desarrollado y un trozo de micelio del patógeno se colocó en el centro de las cajas. Para analizar cuantitativamente los resultados obtenidos en este ensayo con celofanes, a los diez días se midió el área de crecimiento de los distintos aislados de V. dahliae y se comparó el diámetro de crecimiento del patógeno en cajas control con el crecimiento en cajas donde Trichoderma había crecido sobre un celofán y que previamente
había sido retirado antes de inocular el patógeno.
En la figura 4 se representan los resultados de inhibición de crecimiento obtenidos para aislados del patógeno cultivados en medios conteniendo metabolitos de las cepas T. harzianum CECT 2413, T. viride CECT 2423,
T. atroviride IMI 206040, o metabolitos secretados por combinaciones de estas cepas. Como puede observarse en esta figura todos los aislados de Verticil/ium ensayados presentaron una alta sensibilidad a los metabolitos producidos por estas tres cepas de Trichoderma, siendo inhibido su crecimiento en alrededor de un 90%. Aunque las diferencias entre cepas no fueron muy elevadas, parece que la combinación T. harzianum CECT 2413/T. atroviride IMI 206040 posee un ligero incremento en la capacidad de inhibir el crecimiento de todos los aislados del patógeno en general.
En la figura 5 se representan los resultados obtenidos con los metabolitos de las cepas Trichoderma atroviride IMI 206040, Trichoderma atroviride CECT 20755 o RCU1 , Trichoderma harzianum CECT 20756 o RCU2, Trichoderma harzianum PF1 o Trichoderma harzianum CECT 2413, o con los metabolitos secretados por una combinación de estas cinco cepas (formulación) , sobre el crecimiento de un aislado del patógeno sensible a cepas de Trichoderma (2A-12, patotipo no defoliante) o de un aislado más resistente (IA-2, patotipo defoliante) , a diferentes tiempos de incubación (días) . En este sentido, en ensayos para determinar la capacidad de inhibir el crecimiento de V. dahliae que tienen los metabolitos excretados por estas cepas de Trichoderma, se observaron resultados similares a los anteriores aunque diferentes según la cepa del patógeno. La formulación (combinación de estas cinco cepas) fue tan eficaz como las cepas que la componían conlra el aislado más sensible del patógeno (2A-12, patolipo no defoliante) pero fue intermedia contra el aislado más resistente (1 A-2, patotipo defoliante) . Esto último puede deberse a un efecto de dilución de los metabolitos que intervienen en esta interacción debido a que en la formulación las cepas iban en una proporción 1J5 cada una.
En resumen, estos resultados determinan la capacidad específica de las cepas de Trichoderma propuestas en la presente invención de controlar e impedir in vilro el desarrollo del patógeno Verticiflium dahliae.
