Uso de la Yessotoxina y sus derivados para el tratamiento y/o la prevención
de enfermedades metabólicas
5 La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina. Específicamente se refiere al uso de la yessotoxina y sus derivados para la elaboración de un medicamento, preferiblemente para la prevención o el tratamiento de enfermedades metabólicas, más preferiblemente del síndrome metabólico o la diabetes mellitus tipo 2.
1 O ESTADO DE LA TÉCNICA
15 20 Hay dos formas mayoritarias de diabetes. La diabetes tipo 1 se debe primordialmente a la destrucción de los islotes pancreáticos de células B de manera autoinmune, resultando en una deficiencia absoluta de insulina. Las personas con diabetes tipo 1 deben recibir insulina exógena para prevenir el desarrollo de cetoacidosis y poder sobrevivir. La frecuencia de este tipo de diabetes es muy baja en comparación con la diabetes tipo 2 que representa más del 90% de los casos globalmente. La diabetes tipo 2 se caracteriza por la resistencia a la insulina y/o por la secreción anormal de insulina en la que cualquiera de las 2 pueden predominar. Las personas con este tipo de diabetes no dependen de insulina exógena, pero pueden necesitarla para el control de los niveles de glucosa si esto no se consigue a través de la dieta o agentes hipoglucémicos.
25 La epidemia de diabetes que se está produciendo a nivel global principalmente con la diabetes tipo 2, y está teniendo lugar tanto desarrolladas como en vía de desarrollo. se en relaciona naciones
30 Aunque la diabetes tipo 2 es numéricamente más prevalente en la población general, la diabetes tipo 1 es la enfermedad crónica más común en niños. Pero, con el incremento de la diabetes tipo 2 en niños y adolescentes, esto puede revertirse en una o dos décadas siendo el tipo 2 la mayoritaria en muchos grupos étnicos y potencialmente en los grupos Europeices (esto es, descendientes de europeos) .
35 Alrededor de 285 millones de personas en todo el mundo sufren diabetes mellitus tipo 2 y sus comorbilidades asociadas. Se estima que la cantidad de personas
afectadas se incremente en un 6, 5% anual alcanzándose 439 millones de personas
afectadas para el año 2030. Tanto la morbilidad así como la mortalidad por diabetes
son consecuencias de complicaciones microvasculares y macrovasculares. De los
285 millones de personas con diabetes, alrededor de medio millón mueren
5 anualmente a raíz de complicaciones asociadas a esta enfermedad, haciendo a la
diabetes la quinta causa de muerte en países desarrollados. Estas estadísticas
ilustran el fallo terapéutico de los fármacos contra la diabetes que actualmente
están en el mercado para retrasar la progresión de esta enfermedad. También
ilustran la necesidad continua de ampliar la investigación y el desarrollo de
1 O fármacos alternativos con mecanismos de acción nuevos que permitan retrasar la
progresión de la enfermedad y las complicaciones asociadas.
La mayoría de las muertes en personas con diabetes son a causa de aterosclerosis
cardiovascular y cerebrovascular acelerada. La mortalidad atribuible a causas
15 cardiovasculares (eVO) se incrementa en 1 , 5-4, 5 veces mientras que la mortalidad
por causas múltiples se incrementa 1, 5-2, 7 veces. La diabetes ha sido identificada
como un factor de riesgo independiente por evo, aunque en personas con diabetes
frecuentemente coexisten otros factores de riesgo como la obesidad, hipertensión y
la dislipidemia.
20
El mayor riesgo de sufrir un evo se relaciona con la intolerancia a la glucosa (IGT)
y con la diabetes. La IGT se define como hiperglucemia (con valores de glucosa
intermedios entre normales y los correspondientes a la diabetes) luego del consumo
de glucosa. Representa la etapa clave en la historia natural de la diabetes tipo 2 y
25 los individuos que la sufren están en un mayor riesgo que la población general de
desarrollar diabetes. Aproximadamente el 40% de las personas con IGT progresan
hacia la diabetes en los siguientes 5-1 O años. La IGT está relacionada
frecuentemente con el síndrome metabólico (síndrome de resistencia a insulina) .
Tanto la IGT así como la glucosa alterada en ayunas (IFG) son marcadores muy
30 potentes para el desarrollo de diabetes y están asociados con un incremento en el
riesgo de sufrir evo.
El algoritmo para el tratamiento de la diabetes revisado en 2008 por la Asociación Americana de Diabetes y por la Asociación Europea para el Estudio de la Diabetes
35 recomienda la medicación tradicional con metformina, ya sea como mono-terapia o
en combinación con sulfonilurea o insulina, como opciones preferidas en el nivel 1.
Este algoritmo solo sugiere la adición de fármacos alternativos como la pioglitazona
y la incretina como agentes de segunda línea en el nivel 2 (peor validado) . Sin
embargo, estas medicaciones tradicionales han sido incapaces de retrasar el curso
5 progresivo de la diabetes, lo que se evidencia con la necesidad de incrementar la
terapia multifarmacológica a lo largo del tiempo a fin de mantener un control
adecuado de la glucemia (Lo MC, Lansang MC. 201 O. Am J Ther, ISSN: 1536-
3686) . Actualmente existen varias alternativas farmacológicas para el tratamiento
de la hiperglucemia y la diabetes tipo 2. Las sulfonilureas producen la liberación de
1 O insulina en las células beta pancreáticas, las metiglinidas que ayudan al páncreas a
producir insulina, las biguanidas (en esta categoría está incluida la metformina, que
es generalmente el primer tipo de medicación que se utiliza para el tratamiento de
la diabetes mellitus tipo 2) reducen la liberación de glucosa del hígado e
incrementan la captación de glucosa por los tejidos periféricos incluido el músculo
15 esquelético, las tiazolidinedionas también conocidas como glitazonas afectan los
genes que responden a insulina aumentando la producción de los ARNm para las
enzimas dependientes de insulina generando un mejor uso de la glucosa por parte
de las células, los inhibidores de la alfa-glucosidasa que disminuyen la digestión y
absorción del almidón en el intestino delgado, y los análogos de péptidos (análogos
20 y agonistas del péptido similar al glucagón, inhibidores de la dipeptidil peptidasa-4 y
los análogos de la amilina) que actúan a nivel de las incretinas. Debido a que los
medicamentos para el tratamiento de la diabetes tipo 2 tienen una eficacia limitada
y efectos secundarios adversos, el desarrollo de nuevos fármacos para el
tratamiento de la diabetes mellitus con nuevos mecanismos de acción se hace
25 necesaria.
La diabetes tipo 2 se considera actualmente epidémica debido al incremento de la
obesidad y del estilo de vida sedentario. Varios estudios han demostrado
convincentemente que la prevención de la diabetes tipo 2 es posible. El mejor
30 abordaje para prevenir la diabetes no está todavía del todo claro, pero existe
evidencia abrumadora de que el 60% de los nuevos casos de diabetes pueden ser
prevenidos o al menos retrasados a través de modificaciones en el estilo de vida y/o por intervenciones farmacológicas en individuos de alto riesgo.
La diabetes mellitus tipo 2 se caracteriza por la incapacidad del organismo para
utilizar eficientemente los nutrientes circulantes. En condiciones normales, en
respuesta a la elevación de la glucosa en plasma, se secreta insulina en las células
B de los islotes de Langerhans en el páncreas, promoviéndose la captación de
5 energía, el metabolismo, y el almacenamiento. La diabetes tipo 2 está precedida
por el desarrollo de resistencia a insulina en tejidos blanco, pero las causas
moleculares de su iniciación y progresión siguen sin estar establecidas claramente.
La obesidad es el factor de riesgo más importante para el inicio de la resistencia a
insulina, aunque otros factores genéticos y ambientales contribuyen. Los islotes
1 O compensan inicialmente la pérdida de sensibilidad a la insulina expandiendo la
masa de células B y la capacidad secretora de insulina, pero con el tiempo, no
pueden seguir compensando el estrés crónico del incremento en la demanda de
insulina, produciéndose una pérdida de células B con la consecuente reducción de
los niveles de insulina circulantes, a pesar de la continua resistencia a insulina
15 periférica, generándose una hiperglucemia crónica. Sin embargo, las conexiones
moleculares subyacentes en la cascada de obesidad, resistencia a insulina,
compensación por parte de los islotes, fallo eventual de las células B, y finalmente
diabetes permanecen sin establecer.
20 La señalización celular por insulina se produce a través de su unión a receptores
tirosina quinasa específicos que se expresan en células blanco, lo que resulta en un
incremento en la fosforilación de proteínas intracelulares y la activación de
complejas cascadas de segundos mensajeros que regulan el metabolismo de la
glucosa y de los lípidos. Las proteínas sustrato de los receptores de insulina (IRS)
25 son una familia de moléculas que son fosforiladas directamente por el receptor de
insulina, lo que conduce al reclutamiento y activación de proteínas señalizadoras
adicionales. El papel crucial de las proteínas IRS ha sido demostrado a través de
modelos de ratones transgénicos knockout. La ablación de IRS1 resulta en un
retraso en el crecimiento y resistencia a la insulina, pero produce diabetes debido a
30 un aumento en la masa de células B. En contraste, los ratones IRS 2-/-presentan
muchas de las características de la diabetes tipo 2 en humanos: resistencia de los
tejidos periféricos a la insulina con incapacidad de incrementar las células B de
manera compensatoria, lo que resulta en hiperglucemia, diabetes y muerte prematura. Estos resultados demuestran que IRS2 desempeña un papel crucial en
la sensibilidad a la insulina en el hígado y músculo esquelético, así como también
en la proliferación de las células B.
En ratones con mutación dirigida para IRS2, con disminuciones en la expresión de
5 esta proteína del 90% en los islotes de Langerhans y 30-50% en el hipotálamo, sin
cambios en el hígado, tejido adiposo y músculo esquelético, se observan muchos
de los cambios fenotípicos que se observan en ratones IRS2-/-: resistencia a la
leptina, resistencia periférica a la insulina, obesidad, intolerancia a la glucosa, fallos
en las células B e hiperglucemia. La reducción parcial de la IRS2 hipotalámica
1 O afecta a la sencibilidad periférica a la insulina independientemente de los niveles
reducidos de IRS2 en hígado, músculo y tejido adiposo. Varios subtipos de
neuronas hipotalámicas ejercen efectos profundos en el comportamiento
alimenticio. Existe evidencia de interferencia entre la señalización por leptina e
insulina que regula la capacidad neuronal hipotalámica de censar la energía y el
15 apetito. Sin embargo, el mecanismo por el cual la reducción en la expresión de
IRS2 en el cerebro disminuye tanto la sensibilidad central a la leptina como la
sensibilidad periférica a la insulina no está claro.
En su conjunto, esto aporta evidencia sólida acerca del papel central de IRS2 en la
20 regulación hipotalámica de la sensibilidad central y periférica por leptina e insulina
respectivamente, así como también en la propagación de las células B, y sugiere
enérgicamente que el incremento de IRS2 en células Ben pacientes resistentes a la
insulina puede retrasar significativamente la destrucción de los islotes de
Langerhans y la aparición de la diabetes.
25
La insulina disminuye la gliconeogénesis e incrementa la lipogénesis a través de
modificaciones transcripcionales y post-transcripcionales. A nivel transcripcional, el
tratamiento agudo con insulina disminuye el ARNm codificante para las enzimas
gliconeogénicas como la fosfoenol piruvato carboxiquinasa (PCK2 o PEPCK) y la
30 fructosa-1, 6-bis fosfatasa (FBP) que controlan la conversión de piruvato a glucosa
disminuyendo también la glucosa-6-fosfatasa (G6PC) que libera glucosa a la
circulación. Por otra parte la insulina incrementa los niveles de los ARNm
codificantes para enzimas lipogénicas, incluyendo la glucoquinasa (GCK) (que inicia
la conversión de glucosa en ácidos grasos) , la acetil CoA carboxilasa (ACACA) y la
35 ácido graso sintasa (FASN) . La cascada postranscripcional desencadenada por la
5 1 O insulina en el hígado y otros tejidos comienza con la unión de la insulina a su receptor tirosina quinasa con la consecuente activación de éste, produciéndose la fosforilación de varias proteínas acopladoras de la señal, siendo las más prominentes IRS1 (ínsulín receptor sustrate 1) e IRS2. Las tirosinas fosforiladas en IRS1 y 2 forman sitios de unión para moléculas señalizadoras, incluyendo a la subunidad reguladora de 85 kDa de la fosfoinositido 3-quinasa (PI 3-quinasa) . Esto produce PI 3, 4, 5-trifosfato, que activa una proteína quinasa dependiente de 3-fosfoinosítido. Esta última fosforila una serina quinasa designada Akt o proteína quinasa B. La Akt activada fosforila a las enzimas reguladas por insulina, mediando de esta manera en muchos de los efectos post-transcripcionales de la insulina.
15 20 Existen pruebas experimentales que demuestran que en dos modelos de resistencia a insulina en ratones, uno obeso y otro lipodistrófico, existe una reducción del ARNm codificante para IRS2 y la correspondiente proteína, lo que lleva a la resistencia a la insulina que se manifiesta a través de una disminución en la activación de Akt mediada por ésta. Los estudios indican que el descenso de IRS2 representa una respuesta compensatoria a niveles de insulina crónicamente elevados. Una vez iniciada la hiperinsulinemia, se produce una disminución de IRS2 en el hígado, lo que está asociado, directamente o indirectamente, con la resistencia a la represión de las enzimas gluconeogénicas mediada por la insulina.
25 Por tanto, existe la necesidad de encontrar un tratamiento efectivo que actúe sobre este tipo de enfermedades metabólicas, más particularmente enfermedades relacionadas con la expresión del sustrato de los receptores de insulina (IRS1 y 2) , entre otros.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
30 La presente invención se refiere a la utilización de una ficotoxina marina, yessotoxina o sus derivados, con propiedades farmacológicas y bioactivas. Tiene una estructura consiste en un esqueleto éter poli-cíclico en forma de escalera, una cadena lateral insaturada de nueve carbonos y dos grupos sulfato.
35 La yessotoxina presenta descritos numerosos análogos, aunque la estructura de algunos de ellos todavía se desconoce. Habitualmente el peso molecular de las
yessotoxinas se encuentra entre 955 y 1551 unidades de masa. En la actualidad se
han identificado 36 derivados naturales de la yesotoxina. Algunas de las
yessotoxinas son producidas directamente por dinoflagelados, mientras que otras
son producidas durante el metabolismo en el marisco. Estructuralmente está
5 relacionada con las ciguatoxinas y las brevetoxinas. Se aisló por primera vez a
partir de vieiras contaminadas, Pectínopecten yessoensís, en Japón.
Posteriormente se descubrió dicha toxina en cultivos de los dinoflagelados
Protoceratíum retículatum, Língulodíníum polyedrum y Gonyaulax spínífera. Hasta el
momento se han descrito más de 30 análogos del compuesto (1) que se han
1O obtenido a partir de marisco contraminado o de cultivos de dinoflagelados. Estos
últimos son considerados los productores de la toxina.
Por otro lado, esta molécula puede ser sometida a modificaciones que den lugar a
diversos derivados que pueden presentar una funcionalidad similar. Todos estos
15 compuestos, tanto los análogos como los derivados, presentan una estructura
química común (1) con la yessotoxina.
En la presente invención se demuestra cómo esta toxina induce la expresión del
sustrato de los receptores de insulina (IRS1 y 2) . Estos sustratos regulan la
20 respuesta de las células a la insulina. Esto hace que las células puedan responder
de mejor manera a la señalización por insulina. A su vez la toxina induce la
expresión de los genes que codifican para enzimas glicolíticas inhibiendo la
expresión de genes gliconeogénicos. También se observa un aumento en la
expresión de genes involucrados en la síntesis de ácidos grasos. Todos estos
25 efectos se observan en la respuesta a insulina. Otro aspecto importante en el
control de la glucemia es el transporte de glucosa desde la sangre hacia los tejidos,
y la yessotoxina induce un aumento en la expresión de los transportadores
encargados de esta actividad. Otro efecto de la toxina es el incremento del receptor
de lipoproteínas de baja densidad encargado del transporte del colesterol hacia el
30 hígado, lo que hace que sea potencialmente útil como fármaco para el tratamiento
de la hipercolesterolemia.
Por tanto, un primer aspecto de la presente invención ser refiere al uso de un
compuesto de fórmula (1) para la fabricación de un medicamento para la prevención
35 y/o el tratamiento de enfermedades metabólicas:
G
x-o Y-O
5 (1) donde: X e Y se seleccionan independientemente entre H o -S03H, m puede ser O ó 1, n y n' se seleccionan independientemente entre O y 5, Z se selecciona entre H, un monosacárido u oligosacárido, ::::::::representa un enlace sencillo o doble, G es un grupo que se selecciona de entre los grupos de fórmula (11) a (IV) : R4
10 (11) (111)
15 (IV) donde: R1 y R2 se seleccionan independientemente entre -OH o alquilo C1-C5 ; R3 , R4 y R5 se seleccionan independientemente entre H, alquilo C1-C10 , C1-C10 , -OH, -COOH, =0; alquenilo
5 1O R6 y R1 se seleccionan independientemente entre alquilo C1-C10 o alquenilo C1-C1º o amida, preferiblemente R6 se selecciona de entre alquilo C1-C4, alquenilo C1-C4 o amida y R1 es un alquilo C1-C4 ::::::::representa un enlace sencillo o doble. El término "alquilo" se refiere, en la presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, sustituidas o no sustituidas, que tienen de 1 a 1 O átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 5, y más preferiblemente de 1 a 4, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, ciano, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio.
15 20 El término "alquenilo" se refiere en la presente invención a un radical alquilo, descrito anteriormente, y que tiene uno o más enlaces insaturados, concretamente tiene al menos un enlace doble, aunque también puede tener al menos un enlace triple, por ejemplo, vinilo, 1-propenilo, alilo, isoprenilo, 2-butenilo, 1 , 3-butadienilo etc. Los radicales alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio.
25 El término "amida" se refiere en la presente invención, a un radical de fórmula RCONR'R" siendo R, R' y R" radicales alquilo, alquenilo, como los definidos anteriormente, o átomos de hidrógeno.
En una realización preferida X e Y son -S03H. En otra realización preferida X es H e Y es-S03H. En otra realización preferida X es -S03H e Y es H.
30 En una realización preferida m es 1. En otra realización preferida m es O. En otra realización preferida n es 1, 2 ó 3 y n' es O. En otra realización preferida n es Oy n' es 1, 2 ó 3. En otra realización preferida R1 es metilo y R2 es -OH.
En otra realización preferida, G es el grupo de fórmula (11) . En una realización aún más preferida R3 se selecciona entre H, alquilo C1-C4, alquenilo C1-C4 o -COOH. En una realización aún más preferida R4 se selecciona entre H, -OH ú =0. En otra realización Rs se selecciona entre H, alquilo C1-C4, alquenilo C1-C4 o -OH.
En otra realización preferida el compuesto es de formula (V) , donde X e Y son -S03H, Z es H, n' es Oy m es 1 del compuesto de fórmula (1) :
G
(V)
y donde: n se selecciona entre 1, 2 ó 3, y G se ha definido anteriormente. Más preferiblemente G es el grupo de fórmula (11) , más preferiblemente R1es metilo y R2 es -OH. En una realización más preferida R3
es un grupo =CH2. En otra realización más preferida R4 es H. En otra realización preferida R5 es un etileno.
Cualquiera de los compuestos descritos anteriormente de fórmula general (1) o (V) pueden estar en forma de sal. Más preferiblemente la sal es de un alcalino o 20 alcalinotérreo. Y aún más preferiblemente la sal es de sodio.
Los compuestos de la presente invención representados por la fórmula (1) o (V) pueden incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples (por
ejemplo, Z, E) , incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la
presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros
individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente
invención, es decir, el término isómero también se refiere a cualquier mezcla de
5 isómeros, como diastereómeros, racémicos, etc., incluso a sus isómeros
ópticamente activos o las mezclas en distintas proporciones de los mismos. Los
enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden
separarse mediante técnicas convencionales.
1 O El término "análogo" tal y como aquí se utiliza, se refiere a una sustancia química
similar a otra sustancia química en estructura y/o función. Por ejemplo, pueden
considerarse análogos de la yessotoxina (YTX) , aunque sin limitarse, la 45-hidroxi-
YTX, la 45, 46, 47-Trinor-YTX, la 45, 46, 47-Trinorhomo-YTX, la Homo-YTX, la
450H-Homo-YTX, la Carboxi-YTX, la Carboxihomo-YTX, la 450H-Carboxi-YTX, la
15 Noroxo-YTX (41-keto-YTX) , la Noroxohomo-YTX (41-ketohomo-YTX) , la 40-epi-41-
Keto-YTX, la 41-Keto-YTX-1 , 3-enona, la 41 a-Homo-YTX, la 41 a-Homo-YTXamida,
la 44, 45-diOH-YTX, la 44, 45-diOH-41 a-Homo-YTX, la 45-0H-dinor-YTX, la 44-
0xotrinor-YTX y la 41 a-Homo-44-oxotrinor-YTX .
20 En la presente invención se entiende por "derivado", aquel compuesto que se
produce a partir de otro mediante modificaciones del mismo, y que presenta una
funcionalidad similar. Estas modificaciones se pueden realizar por ejemplo, aunque
sin limitarse, mediante métodos químicos, físicos, microbiológicos o farmacológicos.
Pueden considerarse derivados de la yessotoxina aunque sin limitarse, los
25 siguientes:
Desulfoderivados: 1-Desulfo-YTX, 1-desulfocarboxilhomo-YTX y 4-
Desulfocarboxihomo-YTX
Los derivados 9-metilo: 9-metil-41-keto-YTX-1 , 3-enona, 9-metil-41 a-homo-YTX, 9-
metil-41 a-homo-YTXamida y 44, 45-diOH-9-metil-41 ª-homo YTX.
30 Los derivados sin anillo A: Nor-ring-A-YTX, nor-ring-A-41-keto-YTX, nor-ring-A-40-
epi-41-keto-YTX y nor-ring-A-41-keto-YTX-1 , 3-enona.
Los 32-glicosilderivados: glicosiyessotoxina A (GYTX-A) , Protoceratina 111,
Yessotoxina 32-0-[13-L -arabinofu ranosyl- (5'---1") -13-L -arabinofu ranosido, Protoceratin 11, Tri-glicosilyessotoxina y Protoceratin IV.
Por tanto, en una realización preferida de la presente invención el compuesto de fórmula (1) se selecciona de la lista que comprende: yessotoxina (YTX) , 45-hidroxi YTX, 45, 46, 47-trinor-YTX, 45, 46, 47-trinorhormo-YTX, Homo-YTX, 450H-homo YTX, Carboxi-YTX, Carboxihomo-YTX, 450H-carboxi-YTX, noroxo-YTX, 5 noroxohomo-YTX, 40-epi-41-keto-YTX, 41-keto-YTX-1 , 3-enona, 41 a-homo-YTX, 41 a-homo-YTXamida, 44, 55-doOH-41 a-homo-YTX, 45-0H-dinor-YTX, 44-oxotrinor-YTX, 41 a-homo-44-oxotrinor-YTX, 1-desulfo-YTX, 1-desulfocarboxihomo YTX, 4-desulfocarboxihomo-YTX, 9-metil-41-ceto-YTX-1 , 3-enona, 9-metil-41 a hamo-YTX, 9-metil-41 a-homo-YTXamida, 44, 55-diOH-9-metil-41 a-homo-YTX, Nor-
O ring-A-YTX, nor-ring-A-41-keto-YTX, nor-ring-A-40-epi-41-keto-YTX, nor-ring-A-41-keto-YTX-1 , 3-enona, glicosiyessotoxina A (GYTX-A) , Protoceratina 111, Yessotoxina 32-0-[13-L-arabinofuranosyl- (5'---1 ") -13-L-arabinofuranosido, Protoceratin 11, Tri-glicosilyessotoxina y Protoceratin IV.
En una realización más preferida el compuesto de fórmula (1) es yessotoxina que se representa por la siguiente formula:
Na03 SO
o CH3
Los compuestos de la presente invención se demuestra que inducen un aumento en la expresión de IRS1 y 2 que son los responsables de modular la señal en respuesta a la unión de la insulina a su receptor de membrana, activando cascadas de señalización que en última instancia regulan el metabolismo de la glucosa y ácidos grasos. También inducen un aumento en la expresión de las enzimas glicolíticas hexoquinasa y fructosa-2, 6-bifosfatasa 4 (HK1, HK2, PFKFB4) , con 25 disminución de las enzimas gluconeogénicas fosfoenolpiruvato carboxyikinasa 2 y glucose 6 fosfatasa (PCK2, G6PC3) . Esta alteración en el metabolismo de la glucosa es el que se observa en células en cultivo tratadas con insulina e in vivo cuando hay un aumento en la concentración sanguínea de insulina que induce un aumento en la degradación intracelular de glucosa con inhibición de la gliconeogénesis. Otro efecto de la insulina sobre el metabolismo celular es la alteración del metabolismo lipídico, de modo que se produce un aumento en la síntesis de ácidos grasos. Los compuestos de la presente invención inducen un aumento en la expresión de acetii-CoA carboxilasa aACACA) y la ácido graso sintasa (FASN) .
La primera de estas enzimas cataliza la reacción limitante en la síntesis de ácidos grasos de cadena larga, mientras que la segunda es un complejo multi enzimático que desempeña un papel clave en la síntesis de ácidos grasos. Otro aspecto importante en la regulación del metabolismo de la glucosa in vivo, es el transporte de esta molécula hacia el interior celular desde el torrente sanguíneo.
En el síndrome metabólico, se produce hiperglucemia como consecuencia de la resistencia a la acción de la insulina. Con el tiempo, esta condición puede llevar a la diabetes mellitus tipo 2. Una de las causas de la hiperglucemia es la disminución de los transportadores de glucosa en las membranas celulares, esto hace que la glucosa pase hacia el interior celular más lentamente y aumente su concentración en sangre, necesitándose más insulina para alcanzar la misma tasa de transporte. Los compuestos de la invención inducen un aumento en la expresión de los genes que codifican para 3 transportadores de glucosa (SLC2A 13, SLC2A14, SLC2A3) .
Además están sobre-expresados genes corriente abajo de IRS1 y 2 en las células tratadas con yessotoxina cuando se comparan con células control (ver ejemplos) .
Se entiende por "enfermedades metabólicas" o errores congénitos del metabolismo (ECM) , a un grupo numeroso de enfermedades, generalmente hereditarias, producidas por el bloqueo de alguna vía metabólica en el organismo. El efecto de estas alteraciones varía según la vía afectada y la severidad del bloqueo. Tanto los efectos tóxicos de las sustancias acumuladas, como la deficiencia de los productos, son los principales responsables de las manifestaciones clínicas. Preferiblemente son patologías relacionadas con la resistencia a la insulina, intolerancia a la
glucosa, hiper-insulinemia, aumento de triglicéridos en las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) , disminución del colesterol tipo HDL e hipertensión arterial.
5 1O La presencia de estas alteraciones metabólicas hacen que el sujeto que las padece tenga un alto riesgo de desarrollar diabetes, más preferiblemente diabetes mellitus tipo 2, en donde las alteraciones metabólicas arriba descritas se hacen crónicas, con el consecuente riesgo de padecer las complicaciones asociadas a esta enfermedad, como daño en vasos sanguíneos pequeños y grandes (microangiopatía, macroangiopatía) , daño en nervios periféricos (polineuropatía) , hipertensión arterial, daño de la retina (retinopatía diabética) , daño renal, daño hepáticos (esteatosis hepática) , cardiopatía, daños en la piel (dermopatía diabética) y coma diabético.
15 Además, la insulina incrementa la actividad del receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR) en la superficie celular a través de un aumento en la transcripción del gen que codifica para esta proteína.
20 Por tanto, las enfermedades metabólicas se pueden seleccionar de la lista que comprende el síndrome metabólico, la hiperglucemia, la diabetes, más preferiblemente la diabetes mellitus tipo 2, la hipercolesterolemia, que se puede manifestar por altas concentraciones en sangre de LDL-colesterol, entre otras.
25 30 Los compuestos de la invención son capaces de inducir un aumento en la expresión del gen que codifica para el receptor de proteínas de baja densidad (LDLR) encargado de transportar el colesterol en sangre hacia el interior celular a través de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) por endocitosis. Debido a que está demostrado que casi toda la actividad del LDLR que puede ser identificada in vivo en animales y humanos se observa en el hígado, en la presente invención se han utilizado cultivos de hepatocitos de rata para demostrar que los compuestos de la invención, y en particular la yessotoxina, inducen un aumento en el ARNm que codifica para el LDLR también en este tipo celular.
35 Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica (de aquí en adelante, composición farmacéutica de la invención) que comprende un compuesto de estructura química (1) . En una realización preferida, la composición farmacéutica
comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización
preferida la composición farmacéutica comprende además otro principio activo. En
una realización más preferida de este aspecto de la invención la composición
farmacéutica comprende un compuesto de estructura química (1) y además, un
5 vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente con otro principio activo.
La composición de la presente invención puede formularse para su administración a
un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una
variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin
1O limitarse, en soluciones acuosas o no acuosas, en emulsiones o en suspensiones.
Ejemplos de soluciones no acuosas son, por ejemplo, pero sin limitarse,
propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, o
ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Ejemplos de soluciones
acuosas, son por ejemplo, pero sin limitarse, agua, soluciones alcohólicas en agua,
15 o medios salinos. Las soluciones acuosas pueden estar tamponadas o no, y
pueden tener componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes
adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo,
pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, o similares,
o nutrientes, incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas o minerales. Alternativamente,
20 las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las
composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes,
incluyendo pero sin limitarse a: aglutinantes, tales como celulosa microcristalina,
goma tragacanto, o gelatina; excipientes, tales como almidón o lactosa; agentes
dispersantes, tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes, tales como
25 estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes
edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes, tales como
menta o salicilato de metilo. Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden
administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una
variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse, a parenteral, intraperitoneal,
30 intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraarticular,
intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracardiaca, intramuscular,
intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, mediante
parches transdérmicos, vía rectal, vía vaginal o uretral, mediante la administración
de un supositorio, percutánea, aerosol nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica
35 interna, bomba de infusión o vía catéter.
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de
una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia, del
mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad
terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la composición farmacéutica
5 de la invención que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá
determinada, entre otras causas, por las características propias de dicha
composición farmacéutica y el efecto terapéutico a conseguir.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus
1 O variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes
o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de
la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de
la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de
ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
15
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
FIG. 1. muestra el incremento en la expresión de los genes que codifican para el
sustrato receptor de insulina 1 y 2 (IRS1 y 2) después del tratamiento con
20 yessotoxina. Cultivos de células SF295, SF539 o SNB75 fueron tratados con
yessotoxina 250 nM durante 6 y 24 hs. En el caso de la línea celular más sensible a
la toxina (SF295) se incluyó un tratamiento con yessotoxina 30nM durante 24 hs.
Después de incubar en presencia de la toxina durante los tiempos arriba
mencionados, se determinó la variación en la expresión de los ARNm codificantes
25 para IRS1 y 2 por tecnología de microarrays. (A) En el caso de la línea SF295 se
observa que no hay variación en la expresión de IRS1 mientras que hay un
aumento en la expresión de IRS2 tanto a las 6 como a las 24 hs, siendo éste último
tiempo de incubación el que produce el mayor incremento en la expresión. En las
células incubadas con yessotoxina 30 nM durante 24 hs se observan un incremento
30 en la expresión de IRS2 del mismo orden que el observado para la incubación con
yessotoxina 250 nM durante 24 hs. (B) En el caso de la línea SF539 nuevamente se
observa que no hay variación en la expresión de IRS1 y hay un aumento en la
expresión de IRS2 al igual que en el caso anterior. También se observa un mayor
incremento de este mensajero luego de 24 hs de incubación en presencia de
35 yessotoxina. (C) En el caso de SNB75 se observa un incremento de IRS1 después
de 24 hs de incubación en presencia de yessotoxina sin observarse cambios a las 6
hs. Hay un incremento de IRS2 en las células incubadas con yessotoxina durante 6
y 24 hs siendo el último de mayor magnitud. Los cultivos se analizaron por
duplicado para cada condición y las diferencias significativas que se muestran en
5 las figuras tienen una *p<0, 01.
FIG. 2 muestra el incremento en la expresión de los genes que codifican para
hexoquinasa 1 y 2 (HK1 y 2) y para la fructosa-2, 6-bifosfatasa 3 y 4 (PFKFB3 y 4)
después del tratamiento con yessotoxina. Cultivos de células SF295, SF539 o
1 O SNB75 fueron tratados con yessotoxina 250 nM durante 6 y 24 hs. En el caso de la
línea celular más sensible a la toxina (SF295) se incluyó un tratamiento con
yessotoxina 30nM durante 24 hs. Después de incubar en presencia de la toxina
durante los tiempos arriba mencionados, se determinó la variación en la expresión
de los ARNm codificantes para HK1 y 2 y para PFKFB3 y 4 por tecnología de
15 microarrays. (A) En la línea SF295 se observa un incremento de HK1 después de
24 hs de exposición a yessotoxina sin observarse variaciones después de 6 hs. Hay
un incremento de HK2 después de 6 y 24 hs de incubación con yessotoxina, siendo
el incremento mayor a las 24 hs. El mensajero para PFKFB3 está aumentado
levemente en cultivos tratados con yessotoxina durante 24 hs, mientras que
20 PFKFB4 está aumentado después de 6 y 24 hs en presencia de la toxina. El mayor
incremento se observa a las 24 hs de incubación. En células tratadas con
yessotoxina 30 nM durante 24 hs hay un aumento en la expresión de HK1, HK2 y
PFKBF4 del mismo orden que el observado en células tratadas con yessotoxina
250 nM durante el mismo período de tiempo. (B) En el caso de SF539 se observa
25 un incremento de HK1 después de 24 hs de incubación con yessotoxina sin
observarse variaciones a las 6 hs. Hay un incremento de HK2 a las 6 y 24 hs de
incubación con yessotoxina, siendo el incremento mayor a las 24 hs. Se observa en
este caso un aumento de PFKFB3 y 4 tanto a las 6 como a las 24 hs de incubación
en presencia de yessotoxina. El incremento a las 24 hs es de mayor magnitud. (C)
30 En el caso de SNB75 hay un aumento de HK1 después de 24 hs de incubación con
yessotoxina y un aumento de HK después de 6 y 24 hs en presencia de la toxina.
PFKFB3 y 4 están incrementadas en los cultivos tratados con yessotoxina durante 6
y 24 hs. El mayor incremento se observa para PFKBF4 a las 24 hs de incubación con yessotoxina. Los cultivos se analizaron por duplicado para cada condición y las
diferencias significativas que se muestran en las figuras tienen una *p<0, 01 o
**p<0, 05.
FIG. 3 muestra el incremento en la expresión de los genes que codifican para la
5 ácido graso sintasa (FASN) y para la acetil CoA carboxilasa alfa (ACACA) después
del tratamiento con yessotoxina. Cultivos de células SF295, SF539 o SNB75 fueron
tratados con yessotoxina 250 nM durante 6 y 24 hs. En el caso de la línea celular
más sensible a la toxina (SF295) se incluyó un tratamiento con yessotoxina 30nM
durante 24 hs. Después de incubar en presencia de la toxina durante los tiempos
1O arriba mencionados, se determinó la variación en la expresión de los ARNm
codificantes para FASN y ACACA por tecnología de microarrays. (A) En el caso de
la línea SF295 se observa un incremento de FASN luego de 24 hs de incubación en
presencia de yessotoxina sin variaciones a las 6 hs. La misma variación en el perfil
de expresión se observa para ACACA. En las células tratadas con yessotoxina
15 30nM durante 24 hs se observa un aumento de FASN y ACACA del mismo orden
que el observado en las células tratadas con yessotoxina 250nM durante el mismo
período de tiempo. (B) En el caso de la línea SF539 se observa un incremento de
FASN después de 24 hs de incubación con yessotoxina sin variación a las 6 hs. Se
observa un incremento del ARNm para ACACA tanto a las 6 como a las 24 hs de
20 incubación con yessotoxina. (C) En el caso de la línea SNB75 se observan
incrementos de FASN y ACACA a las 24 hs de incubación con yessotoxina sin
observarse variaciones a las 6 hs. Los cultivos se analizaron por duplicado para
cada condición y las diferencias significativas que se muestran en las figuras tienen
una *p<0, 01.
25
FIG. 4 muestra la disminución en la expresión de los genes que codifican para
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa 2 (PCK2) y para la glucosa-6-fosfatasa 3 (G6PC3)
después del tratamiento con yessotoxina. Cultivos de células SF295, SF539 o
SNB75 fueron tratados con yessotoxina 250 nM durante 6 y 24 hs. En el caso de la
30 línea celular más sensible a la toxina (SF295) se incluyó un tratamiento con
yessotoxina 30nM durante 24 hs. Después de incubar en presencia de la toxina
durante los tiempos arriba mencionados, se determinó la variación en la expresión
de los ARNm codificantes para PCK2 y G6PC3 por tecnología de microarrays. (A)
En el caso de la línea SF295 se observa una disminución de PCK2 luego de 6 hs
35 de incubación con yessotoxina. No se observan variaciones significativas para
G6PC3. (B) En el caso de la línea SF539 se observa una disminución en la
expresión de PCK2 y G6PC3 después de 6 hs de incubación en presencia de
yessotoxina. (C) En el caso de la línea SNB75 se observa una disminución en la
expresión de PCK2 y G6PC3 cuando las células fueron incubadas con yessotoxina
5 durante 6 hs. Los cultivos se analizaron por duplicado para cada condición y las
diferencias significativas que se muestran en las figuras tienen una *p<0, 01;
**p<0, 05.
FIG. 5 muestra el aumento en la expresión de los genes que codifican para los
1 O transportadores de glucosa 13, 14 y 3 (SLC2A 13, 14 y 3) después del tratamiento
con yessotoxina. Cultivos de células SF295, SF539 o SNB75 fueron tratados con
yessotoxina 250 nM durante 6 y 24 hs. En el caso de la línea celular más sensible a
la toxina (SF295) se incluyó un tratamiento con yessotoxina 30nM durante 24 hs.
Después de incubar en presencia de la toxina durante los tiempos arriba
15 mencionados, se determinó la variación en la expresión de los ARNm codificantes
para SLC2A 13, 14 y 3 por tecnología de microarrays. (A) En el caso de la línea
SF295 se observa un incremento en la expresión de los tres transportadores de
glucosa en las células tratadas con yessotoxina durante 6 y 24 hs, siendo el
incremento mayor en las células tratadas durante 24 hs en los tres casos. En las
20 células tratadas con yessotoxina 30nM durante 24 hs se observa un aumento en los
tres transportadores del mismo orden que el que se observa en las células tratadas
con yessotoxina 250nM durante el mismo período de tiempo. (B) En el caso de la
línea SF539 se observa un aumento en la expresión de los tres transportadores en
las células tratadas con yessotoxina durante 24 hs. Luego de 6 hs de incubación
25 con yesstoxina se observa un aumento para los trasportadores SLC2A14 y 3 sin
observarse cambios significativos para SLC2A 13. Las variaciones observadas son
de mayor magnitud en los cultivos tratados durante 24 hs con la toxina. (C) En el
caso de la línea SNB75 se observa un aumento significativo en la expresión de los
tres transportadores luego de incubar las células con yessotoxina durante 24 hs
30 mientras que luego de 6 hs de incubación el aumento es significativo para SLC2A 14
y 3, sin cambios significativos en SLC2A 13. Los cultivos se analizaron por duplicado
para cada condición y las diferencias significativas que se muestran en las figuras tienen una *p<0.01; **p<0.05.
FIG. 6 (A) muestra el aumento en la expresión del gen que codifica para el receptor
de lipoproteínas de baja densidad (LDLR) después del tratamiento con yessotoxina
en cultivos de células SF295, SF539 o SNB75 tratados con yessotoxina 250 nM
durante 6 y 24 hs. En el caso de la línea celular más sensible a la toxina (SF295) se
5 incluyó un tratamiento con yessotoxina 30nM durante 24 hs. Después de incubar en
presencia de la toxina durante los tiempos arriba mencionados, se determinó la
variación en la expresión del ARNm codificante para el LDLR por tecnología de
microarrays. En las 3 líneas celulares estudiadas se observa un incremento de la
expresión de LDLR después de 24 hs de tratamiento con yessotoxina. También se
1O observa un aumento en la expresión de LDLR en las líneas SF295 y SNB75 a las 6
hs de tratamiento con la toxina de menor magnitud que le observado a las 24 hs.
(B) En cultivos de hepatocitos primarios de rata tratados con yessotoxina 1 Oy 30nM
durante 6 hs se puede observar que hay un aumento en la expresión de LDLR
después de 6 hs de tratamiento con la toxina.
15
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de
patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos
20 se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como
limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos
más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
METODOLOGÍA GENERAL: Para la realización de los experimentos de la presente
25 invención se utilizan cultivos celulares derivados de glioma humano. Las líneas
utilizadas son SF295, SF539 y SNB75. Todas las células se cultivaron en medio
RPMI 1640 con 10% suero fetal bovino, penicilina 50 Ul/ml y estreptomicina 1, 2 11M
en atmósfera húmeda con 5% de C02. Una vez que las células alcanzaron la
confluencia, se cambió el medio y 12 hs más tarde se agregó yessotoxina 250nM a
30 los tres cultivos. Por otra parte se trataron cultivos de SF295 en las mismas
condiciones de cultivo que las anteriores con yessotoxina 30 nM. Las células se
incubaron en estas condiciones durante 6 y 24 hs para yessotoxina 250nM y
durante 24 hs para yesstoxina 30nM. Luego de los respectivos períodos de
incubación las células se lavaron con PBS y se extrajo ARN total utilizando el kit
35 comercial RNeassy Mini Kit (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. La
concentración del ARN extraído se determinó espectrofotométricamente utilizando
un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) . La integridad y pureza del ARN se
determinó utilizando un bioanalizador (Bioanalyzer 21 00-Applied Biosystems) junto
con el kit comercial RNA 6000 nano reagents (Applied Biosystems) siguiendo las
5 instrucciones del fabricante. Posteriormente se sintetizó el ARN marcado
fluorescentemente para analizar expresión diferencial utilizando los kits comerciales
Low RNA Input Linear Amp Kit (Agilent Technologies) y Quick-Amp Labeling Kit
(Agilent Technologies) . El RNA fluorescente se hibridó en microarrays para
detección de expresión diferencial de ARN en genoma humano (Whole Human
1O Genome (4x44) Oligo Microarray Kit, Agilent Technologies) . Luego de lavar los
microarrays se determinó la fluorescencia con un scanner G2505 (Agilent
Technologies) . Los resultados se normalizaron y posteriormente se analizaron a fin
de determinar expresión diferencial entre cultivos control y tratados con yessotoxina
utilizando el software MeV, parte de TM4 (Microarray Software Suite) .
15
Evidencia experimental soporta la noción de la utilización de células neuronales
como un modelo útil para predecir si un compuesto afecta las rutas metabólicas
reguladas por la insulina. Se ha observado que la disminución en la degradación de
glucosa en el cerebro en pacientes con la enfermedad de Alzheimer, es
20 consecuencia de una disminución en la transducción de señales inducida por la
insulina. También estudios del volumen del hipocampo han revelado una relación
entre la resistencia a insulina y el rendimiento cognitivo.
Por otro lado, la presente invención también demuestra que la yessotoxina, aunque
25 se ha descrito como una toxina, ejerce el efecto arriba mencionado
independientemente de la toxicidad que ejerza en cada cultivo en particular. Los
cultivos de células SNB75, que no presentan disminución de viabilidad cuando se
tratan con yessotoxina hasta 1000 nM hasta las 48 hs, responden, en lo que
respecta a la expresión de los genes arriba mencionados, igual que las demás
30 líneas analizadas que presentan distintas sensibilidades a la citotoxicidad de la
yessotoxina (SF295 IC50, 48H = 30nM, SF539 IC50, 48H = 250nM) .
EJEMPLO 1. EFECTO DE LA YESSOTOXINA SOBRE LA EXPRESIÓN DE LOS
GENES QUE CODIFICAN PARA LOS SUSTRATOS DE LOS RECEPTORES DE
35 INSULINA 1 Y 2 (IRS1 Y 2) EN CÉLULAS SF295, SF539 Y SNB75.
Los resultados obtenidos a partir de los experimentos descriptos en metodología
general más arriba muestran que la yessotoxina induce un aumento en la expresión
de IRS2 en las 3 líneas celulares analizadas, siendo el aumento mayor después de
24 hs de incubación en presencia de yessotoxina que a las 6 hs. En células SNB75
5 la yessotoxina induce a su vez un aumento en la expresión de IRS1 cuando las
células son incubadas en presencia de este compuesto durante 6 y 24 hs, mientras
que no hay diferencias significativas entre los niveles de expresión de este ARNm a
las 6 y 24 hs.
1O EJEMPLO 2. EFECTO DE LA YESSOTOXINA SOBRE LA EXPRESIÓN DE LOS
GENES QUE CODIFICAN PARA HEXOQUINASA 1 Y 2 (HK1 Y 2) Y PARA
FRUCTOSA-2, 6-BIFOSFATASA 3 Y 4 EN CÉLULAS SF295, SF539 Y SNB75.
Los resultados obtenidos a partir de los experimentos descriptos en metodología
15 general más arriba muestran que la yessotoxina induce un aumento en la expresión
de HK1 y 2 en las 3 líneas celulares analizadas. La HK2 aumenta en cultivos
tratados durante 6 o 24 hs con yessotoxina en los 3 tipos celulares, siendo el último
tiempo de incubación el que produce el mayor aumento cuando se compara con
cultivos control. La HK1 aumenta en cultivos tratados durante 24 hs con
20 yessotoxina en los 3 tipos celulares sin observarse cambios en cultivos tratados con
yessotoxina durante 6 hs. En SF295 la yessotoxina induce un aumento de PFKBF3
y 4 a las 24 hs mientras que a las 6 hs hay un aumento de PFKBK4, sin observarse
variaciones significativas en PFKBF3. En SF539 y SNB75 la yessotoxina induce un
aumento de PFKBF3 y 4. Este aumento en la expresión se observa a los dos
25 tiempos estudiados, siendo la expresión mayor para PFKBF4 a las 24 hs, sin
observarse variaciones para PFKBF3 entre las 6 y 24 hs de incubación.
EJEMPLO 3. EFECTO DE LA YESSOTOXINA SOBRE LA EXPRESIÓN DE LOS
GENES QUE CODIFICAN PARA LA ÁCIDO GRASO SINTASA (FASN) Y ACETIL
30 CoA CARBOXILASA (ACACA) EN CÉLULAS SF295, SF539 Y SNB75.
Los resultados obtenidos a partir de los experimentos descriptos en metodología
general más arriba muestran que la yessotoxina induce un aumento en la expresión
de FASN y ACACA en los tres tipos celulares después de 24 hs de incubación sin
35 observarse variaciones significativas después de 6 horas de incubación para SF295
y SNB75. La yessotoxina induce un aumento de ACACA después de 6 hs de
incubación en SF539.
EJEMPLO 4. EFECTO DE LA YESSOTOXINA SOBRE LA EXPRESIÓN DE LOS
5 GENES QUE CODIFICAN PARA LA FOSFOENOL PIRUVATO CARBOXIQUINASA
2 (PCK2) Y GLUCOSA-6-FOSFATASA 3 (G6PC3) EN CÉLULAS SF295, SF539 Y
SNB75.
Los resultados obtenidos a partir de los experimentos descriptos en metodología
1 O general más arriba muestran que la yessotoxina induce una disminución en la
expresión de PCK2 en los tres tipos celulares utilizados después de 6 hs de
incubación. La yessotoxina induce una disminución en la expresión de G6PC3 en
SF539 y SNB75 después de 6 hs de incubación, sin observarse variaciones
significativas en SF295 para este mismo tiempo de incubación.
15
EJEMPLO 5. EFECTO DE LA YESSOTOXINA SOBRE LA EXPRESIÓN DE LOS
GENES QUE CODIFICAN PARA LOS TRANSPORTADORES DE GLUCOSA 13, 14
Y 3 (SLC2A 13, SLC2A14 Y SLC2A3) EN CÉLULAS SF295, SF539 Y SNB75.
20 Los resultados obtenidos a partir de los experimentos descriptos en metodología
general más arriba muestran que la yessotoxina induce un aumento en la expresión
de los tres transportadores de glucosa después de 6 y 24 hs de incubación en la
línea celular SF295. El aumento es de mayor magnitud después de 24 hs de
incubación en presencia de yessotoxina siendo SLC2A 14 y 3 los más inducidos con
25 respecto a los cultivos control. En SF539 y SNB75 los transportadores SLC2A 14 y 3
están sobreexpresados en cultivos tratados con yessotoxina durante 6 y 24 hs,
siendo el aumento en la expresión mayor a las 24 hs. En estos tipos celulares el
transportador SLC2A 13 está sobreexpresado después de 24 hs de incubación en
presencia de yessotoxina, sin observarse variaciones a las 6 hs.
30
EJEMPLO 6. EFECTO DE LA YESSOTOXINA SOBRE LA EXPRESIÓN DEL GEN
QUE CODIFICA PARA EL RECEPTOR DE PROTEÍNAS DE BAJA DENSIDAD
(LDLR) EN CÉLULAS SF295, SF539 Y SNB75 Y EN HEPATOCITOS PRIMARIOS DE RATA.
Los resultados obtenidos a partir de los experimentos descritos en la metodología
general más arriba muestran que la yessotoxina induce un aumento en la expresión
de LDLR en las líneas celulares SF295, SF539 y SNB75 después de 24 hs de
tratamiento, mientras que después de 6 hs de tratamiento existe un aumento en la
5 expresión del LDLR en SF295 y SNB75 de menor magnitud que el observado a las
24 hs. Debido a que in vivo en animales y humanos la mayoría de la actividad del
LDLR se concentra en el hígado, se evaluó el efecto de la yessotoxina en cultivos
de hepatocitos primarios de rata. Los hepatocitos se aislaron por el método de
Seglen (Seglen PO. 1976, Methods Cell Biol 13: 29-83) . Una vez aislados, se
1O determinó la viabilidad de los hepatocitos por exclusión de azul de tripano y se
cultivaron preparaciones con una viabilidad mayor al 90%. Las células se
sembraron en medio de "attachment" [199:E-MEM 1:4 (Sigma) , BSA 1 g/1, insulina
(Sigma) 5 mg/1, HC03Na 26, 2 mM, estreptomicina (Sigma) 100 ¡.tg/ml, penicilina
(Calbiochem) 100 Ul/ml, dexametasona (Sigma) 1, 2 11M y suero fetal bovino (Gibco)
15 1O %] en el que permanecieron durante 3 hs, después de lo cual el medio fue
reemplazado por medio de "post-attachmenf' [199:E-MEM 1 :4 (Sigma) , BSA 1 g/1,
insulina (Sigma) 5 mg/1, HC03 Na 26, 2 mM, estreptomicina (Sigma) 100 ¡.tg/ml,
penicilina (Calbiochem) 100 Ul/ml, hidroxicortisona (Sigma) 0, 6 mM y suero fetal
bovino (Gibco) 1 O %] en donde permanecieron por 12 hs más. Veinticuatro horas
20 después de sembrados los hepatocitos, se cambió el medio y se agregó
yessotoxina 1 O y 30nM, incubándose durante 6 hs. Después de esta incubación de
purificó ARN total de acuerdo a como se describe en la metodología general. Se
realizó transcripción reversa para 4¡.tg de ARN de cada muestra utilizando una
MMul RT (Fermentas) siguiendo las instrucciones del fabricante y el ADNc
25 codificante para el LDLR fue cuantificado por PCR en tiempo real utilizando el kit de
amplificación FastStart Universal SYBR Green Master (Roche) en un termociclador
StepOne (Applied Biosystems) . Se utilizó el método de ~~CT para cuantificación
relativa usando como estándar interno para normalizar la ciclofilina. Los cebadores
para amplificar el LDLR fueron: P-sentido-5'GAGGATGATGTGGCATGAACA3'
30 (SEQ ID NO: 1) y P-antisentido-5'GCGTCCTTCCTGCCTAAGG3' (SEQ ID NO: 2) .
Los cebadores para amplificar la ciclofilina fueron: P-sentido-
5'TGCTGGACCAAACACAAATG3' (SEQ ID NO: 3) y P-antisentido-
5'ATGCCCGCAAGTCAAAGAAA3' (SEQ ID NO: 4) . Los resultados obtenidos para
la cuantificación del LDLR en cultivos de hepatocitos primarios de rata tratados con
35 yessotoxina muestran que la toxina, a las 2 concentraciones utilizadas, induce un aumento en la expresión del LDLR cuando se compara con la expresión de cultivos control.
