Derivados de policétidos dibenzofuránicos prenilados y su aplicación
para el tratamiento de enfermedades infecciosas, parasitarias y tumores.
La presente invención describe una familia de compuestos que son policétidos
5 dibenzofuránicos prenilados de origen natural que poseen actividad
antimicrobiana, particularmente contra bacterias gram positivas, por lo que son
útiles la fabricación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades
infecciosas de origen bacteriano. Asimismo estos compuestos presentan
actividad citotóxica frente a diversas líneas celulares tumorales, así como
1O actividad antiparasitaria.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El progresivo incremento de infecciones bacterianas causado por cepas
15 resistentes a múltiples antibióticos y por estirpes altamente virulentas se ha
convertido en uno de los problemas sanitarios más graves en los pacientes
hospitalizados. La presión selectiva resultante del uso extensivo de antibióticos
durante los últimos 25 años ha llevado al surgimiento de multitud de
resistencias bacterianas y a la diseminación de genes de resistencia entre
20 microorganismos patogénicos. Todo ello ha provocado que nos encontremos
ante el riesgo de sufrir infecciones quot;intratablesquot;. La creciente aparición y
diseminación de resistencias en bacterias Gram-positivas como los géneros
Enterococcus, Staphylococcus y Streptococcus, constituyen claros ejemplos de
ello. La constante y rápida dispersión mundial de estirpes microbianas
25 portadoras de múltiples resistencias y de genes de virulencia ha causado un
gran incremento en la morbilidad y la mortalidad provocadas por infecciones
hospitalarias, tal y como señalaba ya la OMS en 1999 en su quot;Informe sobre las
Enfermedades Infecciosas. Eliminar Obstáculos al Desarrollo Saludablequot; y en
2001 en el documento quot;lnfectíon control programmes to control antímícrobíal
30 resístancequot;.
Actualmente, uno de los ejemplos más dramáticos de esta situación lo
constituye la creciente aparición y diseminación de resistencias a antibióticos y
de factores de virulencia en Staphylococcus aureus y otros miembros del
35 género Staphylococcus. Los estafilococos son microorganismos ubiquistas,
presentes en las vías respiratorias del 30% de los adultos sanos y en la piel de
un 20%. Los pacientes y el personal de hospitales presentan porcentajes algo
más altos. Sin embargo, múltiples grupos de la población presentan riesgo elevado de sufrir infecciones por estafilococos patogénicos. Es normal el desarrollo de infecciones estafilocócicas entre recién nacidos y sus madres, en pacientes transplantados y en personas afectadas de enfermedades tales como gripe, leucemia, diabetes mellitus, patologías broncopulmonares, etc. Aunque dentro de este género bacteriano, la especie S. aureus es la causal del mayor número de patogénesis estafilocócicas, diversas especies de Staphylococcus coagulasa negativos (CoNS) han sido asociadas con un número creciente de infecciones adquiridas en hospitales. El uso cada vez más frecuente de procedimientos invasivos, implicando diferentes materiales protésicos, y el alto número de pacientes inmunodeprimidos han contribuido al incremento dramático de infecciones debidas a CoNS. Por todo lo dicho, el control y tratamiento de las infecciones causadas por Staphylococcus constituye un tema de relevancia clínica extrema. Además, ya en el siglo XXI, la creciente diseminación de cepas resistentes a meticilina, antibiótico que constituía el agente básico contra tales infecciones, ha dificultado enormemente la erradicación de las mismas. Tanto en EE.UU. como en Japón y Europa, hay una frecuencia ascendente de aparición de aislados de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA) , especialmente en las unidades de cuidado intensivo de los hospitales, aunque también es creciente la aparición de infecciones adquiridas en la comunidad.
Los MRSA son, frecuentemente, resistentes a los antibióticos ~-lactámicos, tales como penicilinas, cefalosporinas y carbapenemos. La resistencia a aminoglicósidos y macrólidos es también habitual. Pocos antibióticos son todavía efectivos contra MRSA. En concreto, la mupirocina y los antibióticos glicopéptidos, principalmente vancomicina, constituyen el tratamiento alternativo normalmente utilizado. Sin embargo, el reciente aislamiento en EEUU de tres cepas de S. aureus con alta resistencia a vancomicina (HVRSA) adquirida de Enterococcus, de múltiples cepas de S. aureus resistentes a niveles intermedios (IVRSA) de vancomicina en distintos países, así como la creciente aparición y diseminación de estafilococos resistentes a mupirocina (MuRSA) hacen que estemos ante una situación de riesgo mundial para la salud pública. Ante tal compromiso, nuevos antibióticos como la linezolida o la daptomicina se están ensayando en clínica, pero poco tiempo tras su introducción van apareciendo resistencias a los mismos. Asimismo, en estas bacterias es cada vez más habitual la dispersión de genes de virulencia, como p.ej. genes codificando toxinas, y de genes de resistencia debido a que muchos de estos genes están codificados en elementos genéticos móviles, como plásmidos conjugados, islas de patogenicidad, fagos, etc.
El éxito de los productos naturales frente a los sintéticos radica en que han sido seleccionados durante la evolución para interaccionar con moléculas biológicas, considerándose como fuentes de estructuras privilegiadas. Por tanto el estudio de especies vegetales de interés por su uso etnobotánico constituye un valioso punto de partida en la búsqueda de productos susceptibles de convertirse en fármacos. En este sentido, la medicina tradicional argentina emplea muchas especies medicinales para contrarrestar diversas enfermedades. Achyrocline satureioides (Lam.) D. C, conocida vulgarmente como quot;marcelaquot; y miembro de la familia Asteraceae, es un ejemplo representativo dentro de las especies ampliamente utilizadas.
En las dos últimas décadas, A.satureioides ha sido objeto de una intensa investigación científica utilizando tanto modelos in vitro como modelos animales in vivo, proporcionando evidencia experimental que los extractos de esta especie presentan un amplio espectro de propiedades farmacológicas y terapéuticas. Entre las propiedades registradas hasta el momento se pueden mencionar: hepatoprotectora, actividad asociada a las propiedades antioxidantes de esta especie, como así también actividad colerética, miorrelajante, analgésica y sedativa, antihiperglicémica, fotoprotectora, antiinflamatoria e inmunomoduladora. Existen datos de actividad insecticida sobre Triatoma infestans y actividad antiparasitaria frente a la forma infectante de Tr y panosoma cruzí. Diversos trabajos demuestran actividad antiherpética y frente a HIV-1, actividad citotóxica frente a células de carcinoma hepático humano, como así también actividad antibacteriana frente a cepas Gram-positivo y Gram-negativo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe un grupo de compuestos que son policétidos dibenzofuránicos prenilados de origen natural. Estos compuestos presentan actividad antimicrobiana con alta especificidad frente a bacterias gram positivas, incluida la cepa multirresistente Staphylococcus aureus. Asimismo estos compuestos presentan actividad citotóxica frente a diversas líneas celulares provenientes de leucemia y cáncer de mama (HL-60; MCF7, SKBR3 y HEL, entre otras) , así como actividad antiparasitaria frente a Tr y panosoma cruzí, agente etiológico de la enfermedad de Chagas.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (1) :
donde R1, Rs, R6 y R7 se seleccionan independientemente entre hidrógeno, O, OH,
halógeno, alquilo C1-C5, alquenilo C1-C6, arilo, O-alquilo C1-C12, OC (O) R, N (R') (Rquot;) ; donde R se selecciona entre alquilo C1-C5, O-alquilo C1-C12, arilo o heteroarilo y R' y Rquot; se seleccionan independientemente entre H o alquilo C1-C6, R2y R3 pueden ser grupos independientes o estar unidos formando un ciclo;
cuando R2 y R3 son independientes se seleccionan entre hidrógeno, OH o alquilo C1-C6; cuando R2 y R3 están unidos formando un ciclo se seleccionan entre O ó C (Rs) (Rg) , siendo Rs y Rg independientemente H ó alquilo C1-C6; R4 se seleccionan entre H, alquilo C1-C6 o alquenilo C1-C6;
--------representa un enlace que puede ser sencillo o doble;
o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o estereoisómero del mismo.
El término quot;alquiloquot; se refiere, en la presente invención, a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 12 átomos de 25 carbono, preferiblemente de 1 a 6, y que se unen al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo etc. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como alquilo, arilo, halógeno (denominándose haloalquilo) , hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, ciano, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y tioalquilo.
El término quot;ariloquot; se refiere, en la presente invención, a anillos aromáticos sencillos o múltiples, que tienen de entre 5 a 18 eslabones en los que se ha eliminado un protón del anillo. Los grupos arilo son por ejemplo, pero sin limitarse a, fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo, fluorenilo o antracilo. Preferiblemente el grupo arilo tiene de 5 a 7 átomos de carbono y más preferiblemente el grupo arilo es un fenilo. Los radicales arilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como alquilo, halógeno, hidroxilo o ácido carboxílico.
El término quot;heteroariloquot; se refiere a un arilo que contiene al menos un átomo distinto de carbono, tales como S, N ó O, formando parte del anillo aromático.
El término quot;alqueniloquot; se refiere a radicales de cadenas hidrocarbonadas de 1 a 12 átomos de carbono, preferiblemente de 1 a 6, que contienen uno o más enlaces carbono-carbono dobles, por ejemplo, vinilo, 1-propenilo, alilo, isoprenilo, 2-butenilo, 1 , 3-butadienilo etc. Los radicales alquenilos pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halo, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio.
Por quot;halógenoquot; se entiende en la presente invención a un átomo de bromo, cloro, yodo o flúor.
Preferiblemente, R1, Rs yR7 son OH.
Preferiblemente, R2 y R3 están unidos formando un ciclo. Más preferiblemente, R2 es un grupo O y R3 es un grupo C (Rs) (Rg) , siendo Rs y Rg independientemente H o metilo, y más preferiblemente R4 es hidrógeno.
Preferiblemente, R6 es un alquenilo C1-C4. Más preferiblemente, R6 es -CH2-CH (OH) -C (CH3) =CH2
Preferiblemente, R2 y R3 son OH.
Preferiblemente, R4 es un alquenilo C1-C4. Más preferiblemente, R4 es -
C (CH3) =CH2
Preferiblemente, R6 es un alquenilo C1-C4. Más preferiblemente, R6 es -CH2-CH=C (CH3) 2
Preferiblemente, el compuesto de fórmula (1) se selecciona entre: 1O • 2-metil-1-[6, 7 , 9-trihidroxi-8- (2-hidroxi-3-metil-but-3-enil) -3, 3-dimetil-1 0- (2-metil-butirii) -3H-4, 11-dioxa-benzo[a]fluoren-5-il]-butan-1-ona.
• 2-metil-1-[1 , 3, 7, 9-tetrahidroxi-4- (2-hidroxi-3-metil-but-3-enil) -8- (3-metil-but -2-en i 1) -6- (2-meti1-butiri 1) -dibenzofu ran-2-i 1]-butan-1 -ona.
Los términos quot;sal farmacéuticamente aceptablequot;, quot;solvatoquot; o quot;estereoisómeroquot; se refiere a cualquier sal farmacéutica, solvato, estereoisómero o cualquier otro compuesto que, siendo administrado a un receptor, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto descripto en el presente documento. Sin embargo se observará que las sales farmacéuticamente inaceptables están también en el ámbito de la invención ya que estas últimas pueden ser útiles en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales, estereoisómeros y derivados pueden ser llevadas a cabo por medio de métodos conocidos en la materia.
Por ejemplo, las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos provistos en el presente documento se sintetizan por medio de métodos químicos convencionales a partir de un compuesto de origen que contenga un residuo básico o ácido. Estas sales se preparan generalmente, haciendo reaccionar el ácido libre o la forma base de los compuestos con una cantidad
estequiométrica de base o ácido adecuado en agua o un disolvente orgánico o mezcla de ambos. Los medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo en general son de preferencia. Ejemplos de sales de adición de ácido incluyen sales de adición de ácidos minerales tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromohidrato, iodohidrato, sulfato, nitrato, fosfato y sales 35 de ácidos orgánicos como por ejemplo acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato. Ejemplos de sales de adición de base incluyen sales inorgánicas, como por ejemplo de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y sales de litio, y sales orgánicas de base, como por ejemplo etilendiamina, etanolamina, N, N-dialquilenetanolamina, trietanolamina, glucamina y sales de aminoácidos básicos.
Los compuestos de la invención pueden presentarse en forma cristalina como compuestos libres o solvatos y se entiende que ambas formas están comprendidas dentro del ámbito de aplicación de la presente invención. Los métodos de solvatación son de conocimiento general en la materia. Los solvatos adecuados son aquellos farmacéuticamente aceptables. En una representación particular, un solvato es un hidrato.
Los compuestos de la presente invención, representados por la fórmula (1) , descrita anteriormente pueden incluir enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales en cada C, o isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples (por ejemplo, Z, E) . Los isómeros individuales, enantiómeros o diastereómeros y mezclas de los mismos se incluyen dentro del ámbito de aplicación de la presente invención.
La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de fórmula (1) o sales farmacéuticamente aceptables, derivados, profármacos, solvatos o estereoisómero de los mismos junto con un transportador farmacéuticamente aceptable, adyuvante o vehículo para la administración a un paciente. Preferiblemente, dicha composición también comprende otro principio activo con un efecto sinérgico o complementario.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas por cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, vía oral, tópica, rectal o parenteral (incluyendo vía subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular e intravenosa) .
Las formas farmacéuticas adecuadas para la administración oral incluyen cualquier composición sólida (tabletas, pastillas, cápsulas, formas granuladas, etc.) o líquida (soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, etc.) y pueden contener excipientes convencionales conocidos en la materia, tales como agentes de unión, por ejemplo jarabe, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, o polivinilpirrolidona; agentes de relleno, por ejemplo, lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato cálcico, sorbitol o glicina, lubricantes para la preparación de comprimidos, por ejemplo estearato de magnesio, desgregantes como almidón, polivinilpirrolidona, glicolato sódico de almidón o celulosa microcristalina, o agentes humectantes farmacéuticamente aceptables, tal como laurilsulfato de sodio.
Las composiciones sólidas orales se pueden preparar por métodos convencionales de mezclado, llenado o preparación de comprimidos. Las operaciones repetidas de mezclando se pueden utilizar para distribuir de forma uniforme el principio activo utilizando grandes cantidades de agentes de relleno. Estas operaciones son convencionales en el arte de esta invención. Los comprimidos se pueden preparar, por ejemplo a través de granulación húmeda o seca y pueden ser opcionalmente recubiertos por métodos bien conocidos en la práctica farmacéutica normal, particularmente con un recubrimiento entérico.
Las composiciones farmacéuticas también pueden ser adaptadas para la administración parenteral, tal como soluciones estériles, suspensiones o productos liofilizados en forma farmacéutica adecuada. Excipientes adecuados, tales como los agentes a granel, neutralizantes o surfactantes pueden ser mencionados.
Los compuestos o composiciones descriptas en la presente invención pueden ser administrados por cualquier método adecuado, como infusión intravenosa, preparaciones orales y administración intraperitoneal o intravenosa. Sin embargo, la vía de administración preferida dependerá de la condición del paciente. En particular, la administración oral es preferida debido a la comodidad para el paciente y el carácter crónico de las enfermedades que deben ser tratadas.
Para su aplicación terapéutica, los compuestos de fórmula (1) deberán preferentemente encontrarse en forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, por ejemplo los compuestos de fórmula (1) tienen un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los excipientes admitidos y no incluyendo material considerado tóxico a los niveles de dosis normales. Los niveles de pureza de un compuesto de fórmula (1) o sus derivados, preferiblemente excede al 50%, más aún al 70%, e incluso al 90%. En una representación preferente, que supere el 95%.
La cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de fórmula (1) para ser administrado en general, dependerá, entre otros factores, de la persona que se va a tratar, de la severidad de la enfermedad, de la forma de administración elegida, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben ser consideradas como guías para el especialista en la materia y este último debe ajustar la dosis de acuerdo a las variables mencionadas anteriormente. Sin embargo, un compuesto de fórmula (1) se puede administrar una o más veces al día, por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4 veces al día en una cantidad típica total diaria comprendida entre 1 y 200 mg/kg de peso corporal/día , preferiblemente 1-1 O mg/kg de masa corporal/día. De la misma forma un compuesto de fórmula (11) se puede administrar una o más veces al día, por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4 veces al día en una cantidad típica total diaria comprendida entre 1 y 200 mg/kg de peso corporal/día, preferiblemente 1-1 O m g/ kg de masa corporal/día.
Los compuestos descritos en esta invención, sus sales farmacéuticamente aceptables, estereoisómeros y/o solvatos, así como las composiciones farmacéuticas que los contienen se pueden utilizar junto con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, ser provistos en forma de una composición separada para su administración simultánea o no, con la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (1) o un estereoisomero farmacéuticamente aceptable, solvato o sal del mismo.
Otro aspecto de la invención es el uso de un compuesto de fórmula (1) para la fabricación de un medicamento.
Otro aspecto de la invención es el uso de un compuesto de fórmula (1) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una infección de origen bacteriano. Preferiblemente, si la bacteria causante de la infección es gram positiva. Preferiblemente, si la bacteria se selecciona entre los géneros Staphylococcus, Enterococcus y Streptococcus. Aún más preferiblemente, la bacteria se selecciona entre Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalís. También caen dentro del alcance de la invención las bacterias de estos géneros que han desarrollado resistencia a ciertos antibióticos tales como, pero sin limitarse a, vancomicina y meticilina.
Otro aspecto de la invención es el uso de un compuesto de fórmula (1) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer. Preferiblemente, el cáncer es leucemia o cáncer de mama.
Un último objeto de la invención está formado por compuestos de fórmula (1) o sales farmacéuticamente aceptables, derivados, solvatos o estereoisómeros de los mismos para su uso como medicamento en pacientes con enfermedades parasitarias y enfermedades micóticas, preferiblemente enfermedades causadas por el parásito Tr y panosoma cruzí.
A lo largo de la presente descripción, el término quot;tratamientoquot; se refiere a eliminar, reducir o disminuir la causa o efectos de una enfermedad. Para los propósitos de esta invención, tratamiento incluye, aunque sin quedar limitados a los mismos, aliviar, disminuir o eliminar uno o más síntomas de la enfermedad; reducir del grado de enfermedad, estabilizar (es decir, no empeorar) el estado de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresión de la enfermedad, aliviar o mejorar el estado de la enfermedad y remitir (ya sea total
o parcial) .
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra quot;comprendequot; y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Muestra los patrones de sensibilidad del compuesto C2 de esta invención frente a diferentes cepas clínicas de gram-positivas y múltiples cepas de S. aureus que se diferencian en sus perfiles de resistencia antibiótica (tabla bajo la gráfica) .
Fig. 2. Muestra los niveles de crecimiento de las cepas estándar de S. aureus y
E. faecalís y de S. aureus resistente a la meticilina, y parcialmente resistente a la vancomicina (IVRSA, de sus siglas en inglés) ; frente a una representación logarítmica de las diferentes concentraciones del compuesto C2.
Fig. 3. Muestra los niveles de crecimiento frente a una representación logarítmica de las diferentes concentraciones de ampicilina (control) .
Fig. 4. Muestra los niveles de crecimiento frente a una representación logarítmica de las diferentes concentraciones de kanamicina (control) .
EJEMPLOS
Obtención de los compuestos de fórmula (1)
A partir de hojas y tallos de Achyroclíne satureíoídes (Lam.) OC se aislaron metabolitos con la estructura general (1) . La estructura de los metabolitos ha sido numerada según metodología comúnmente utilizada en la caracterización de productos naturales, usando nombres comunes propuestos en bibliografía (Giovanni Appendino et al. quot;Arzanol, an Anti-inflammator y and Anti-HIV-1 Phloroglucinol a-Pyrone from Helíchr y sum ítalícum ssp. Mícrophyllumquot;, J. Nat. Prod. 2007, 70, 608-612 -John R. Carney et al. quot;Achyrofuran, a New Antihyperglycemic Dibenzofuran from the South American Medicinal Plant Achyroclíne satureíoídesquot;, J. Nat. Prod. 2002, 65, 203-205) .
Ejemplo 1 Compuesto C1
Cl
Aceite viscoso de color amarillento. 1H-NMR (lgt;, CDCb) : 15, 9 (1H; s; OH-9) ; 14, 45 (1H; s; OH-3) ; 10, 07 (1H; s; OH-1) ; 6, 70 (1H; d; J=.9, 8 Hz; H-1quot;') ; 5, 65 (1H; d; J= 9, 8 Hz; H-2quot;') ; 4, 98 (1H; s; H-
4a') · 4 80 (1 H· s· H-4b') · 4 44 (1 H· sa· H-2') · 3 95 (1 H· sext· J = 6 5 Hz· H-2quot;quot;) ·
' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' 3, 85 (1H; sext; J= 6, 7 Hz; H-2quot;) ; 3, 15 (2H; dd; J= 14, 2 Hz; H-1') ; 1, 92 (2H; m;
H-3bquot; H-3bquot;quot;) · 1 89 (3H· s· H-5') · 1 59 (3H· s· H-4quot;') · 1 58 (3H· s· H-5quot;') · 1 quot;47
' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' (2H· m· H-3aquot; H-3aquot;quot;) · 1 25 (3H· m· H-5quot;) · 1 23 (3H· m· H-5quot;quot;) · O97 (3H· m· H-
, ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' 4quot;quot;) ; 0, 96 (3H; m; H-4quot;) . 13C-NMR (lgt;, CDCI3) : 212, 1 (s, C-1 quot;) ; 212, 6 (s, C-1 quot;quot;) ; 10 163, 3 (s, C-3) ; 159, 4 (s, C-1) ; 155, 8 (s, C-5a) ; 156, 1 (s, C-9) ; 154, 2 (s, C-7) ; 152, 3 (s, C-4a) ; 147, 2 (s, C-3') ; 127, 1 (d, C-2'quot;) ; 115, 5 (d, C-1 'quot;) ; 110, 6 (t, C-4') ; 106, 7 (s, C-9a) ; 106, 5 (s, C-2, C-8) ; 103, 3 (s, C-9b) ; 102, 3 (s, C-4) ; 100, 4 (s, C-6) ; 79, 2 (s, C-3quot;') ; 75, 4 (d, C-2') ; 46, 4 (d, C-2quot;quot;) ; 46, 2 (d, C-2quot;) ; 29, 9 (t, C-1 ') ; 27 8 (e C-4quot;' C-5quot;') · 26 9 (t C-3quot;quot;) · 26 7 (t C-3quot;) · 18 1 (e C-5') · 16 6 (e C-5quot;) ·
' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' 15 16, 6 (e, C-5quot;quot;) ; 11, 9 (e, C-4quot;) ; 11, 9 (e, C-4quot;quot;) . HREIMS: 550, 2607 (calcd para C32H3sÜs [M]+, 550, 2567) . IR Vmax: 2964, 2932, 2879, 1772, 1724, 1620, 1459, 1409, 1373, 1176, 1105, 1038, 950 cm-1. UV (EtOH) Amax (log E) : 341 (2, 53) ;
239 (2, 55) ; 203 (2, 65) nm. [a]0 = -2, 3 (e 0, 008; CHCI3) .
Ejemplo 2
Compuesto C2
C2
Aceite viscoso de color amarillento. 1H-NMR (5, CDCb) : 15, 63 (1 H; sa; OH-7) ; 13, 98 (1 H; s; OH-3) ; 9, 82 (2H; bs; OH-1, OH-9) ; 5, 30 (1 H; m; H-2') ; 5, 09 (1 H; s; H-4a'quot;) ; 4, 96 (1 H; s; H-4b'quot;) ; 4, 53
(1H· m· H-2'quot;) · 4 02 (1 H· sext· J = 6 5· H-2quot;quot;) · 3 82 (1 H· sext· J = 6 5· H-2quot;) · 3 44
' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' (2H; d; J = 6, 3; H-1 ') ; 3, 25 (1 H; dd; J = 15, 2; H-1 a'quot;) ; 3, 04 (1 H; dd; J = 15, 2; H-
b'quot;) · 1 90-1 87 (2H· m· H-3bquot; H-3bquot;quot;) · 1 88 (3H· s· 5'quot;) · 1 83 (3H· s· H-5') · 1 70
' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' (3H· s· H-4') · 1 54 (1 H· m· H-3aquot;) · 1 48 (1 H· m· H-3aquot;quot;) · 1 26 (3H· d· J = 6 2· H-
, ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' 5quot;) · 1 23 (3H· d· J = 6 8· H-5quot;quot;) · O95 (3H· m· H-4quot;quot;) · O93 (3H· m· H-4quot;) 13C-
, ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' . 10 NMR (5, CDCb) : 213, 4 (s, C-1 quot;quot;) ; 207, 1 (s, C-1 quot;) ; 163, 9 (s, C-3) ; 157, 6 (s, C-7) ; 155, 5 (s, C-9) ; 158, 2 (s, C-5a) ; 154, 6 (s, C-1 ) ; 154, 2 (s, C-4a) ; 145, 8 (s, C-3'quot;) ; 132, 1 (s, C-3') ; 122, 2 (d, C-2') ; 111, 7 (s, C-2) ; 111, 7 (t, C-4'quot;) ; 107, 4 (s, C-8) ; 105, 2 (s, C-9b) ; 104, 7 (s, C-9a) ; 102, 3 (s, C-6) ; 101, 3 (s, C-4) ; 78, 1 (d, C-2'quot;) ; 46, 3 (d, C-2quot;quot;) ; 45, 4 (d, C-2quot;) ; 30, 3 (t, C-1quot;') ; 27, 1 (t, C-3quot;quot;) ; 26, 4 (t, C-3quot;) ; 25, 8 15 (e, C-4') ; 21, 8 (t, C-1 ') ; 18, 2 (e, C-5'quot;) ; 17, 9 (e, C-5') ; 17, 0 (e, C-5quot;) ; 16, 3 (e, C-5quot;quot;) ; 11, 8 (e, C-4quot;, C-4quot;quot;) . EIMS m/z (%) : 552 (M+, 17) ; 534 (11 ) ; 479 (31 ) ; 425
(1 00) ; 389 (11 ) . HREIMS: 552, 2740 (calcd para C32H4ºÜs [M]+, 552, 2723) . IR Vmax: 3296, 2968, 2929, 2877, 1727, 1617, 1451, 1373, 1236, 1192, 1086, 1 20
1041, 905, 849 cm-. UV (EtOH) Amax (log t) : 341 (2, 69) ; 243 (2, 67) nm. [a]0 20 = +31 , 4 (e 0, 116; CHCI3) .
Ensayos biológicos
Ensayo de actividad antimicrobiana Para la determinación del MIC50, el crecimiento microbiano en microplacas de 96 pocillos fue monitorizado en presencia de entre 6 y 1 O concentraciones diferentes (rango entre 1 y 128 micromolar) de los compuestos ensayados; junto con los antibióticos comerciales ampicilina y kanamicina como controles. Para ello, cultivos frescos de bacterias (o levaduras) fueron diluidos a densidades ópticas a 620 nanómetros de 1 o-5 por mililitro (equivalentes a 105
unidades formadoras de colonias por mililitro) ; momento en el que son cultivados de nuevo en presencia de los compuestos ensayados, o los antibióticos control. Las lecturas de crecimiento fueron tomadas después de 24 horas. Entonces, los valores de crecimiento (expresados en densidad óptica a 620 nanómetros) son representados gráficamente frente al logaritmo en base 1 O de las concentraciones de los compuestos ensayados. Los puntos de la gráfica así obtenidos, son ajustados a la curva sigmoidea inversa para obtener el valor MIC50 definitivo. Estos ensayos se llevaron a cabo con dos bacterias gram-negativas (Escheríchía colí y Pseudomonas aerugínosa) , dos gram-positivas (S. aureus and Enterococcus faecalís) , y la levadura Saccharomyces cerevísíae como modelo eucariota (no bacteriano) . La cepa de E. coli empleada porta un plásmido que le confiere resistencia a la ampicilina. La tabla 1 muestra los valores MIC50 de los compuestos mencionados en esta invención.
Tabla 1: MIC de compuestos de la invención ensayados (~M)
Compuesto E. colí P. aerugínosa S. aureus E. faecalís S. cerevísíae
Compuesto C1 gt;gt;100 gt;gt;100 9±1 48 ± 18 gt;100
C2 gt;gt;100 gt;gt;100 lt;lt;1 lt;lt;1 gt;100
Ampicilina gt;gt;100 89 ±55 lt;lt;1 lt;lt;1 NO
Controles Kanamicina lt;lt;1 114 ± 20 lt;lt;1 23 ± 4 NO Se estudió la sensibilidad de diferentes cepas clínicas de bacterias gram-positivas frente a los compuestos de esta invención. Los ensayos se realizaron como los mencionados para el MIC5º, pero sólo tres concentraciones fueron 30 incluidas. En este caso, el crecimiento relativo fue calculado para cada concentración en comparación con cultivos controles, sin compuestos añadidos. La figura 1 muestra los patrones de sensibilidad de diferentes cepas clínicas Gram-positivas; y múltiples cepas de S. aureus, que se diferencian en sus perfiles de resistencia antibiótica, frente al compuesto C2 descripto en esta invención. En la tabla 2 se detalla el perfil de resistencia antibiótica de cada cepa ensayada.
Para los ensayos de inhibición del crecimiento (MIC50) del compuesto C2 de esta invención frente a una cepa de S. aureus resistente a la meticilina, y parcialmente resistente a la vancomicina (IVRSA, de sus siglas en inglés) ; el 10 inhibidor fue añadido en un rango de 24 diferentes concentraciones que van desde 1 O nanomolar hasta 100 micromolar. Los antibióticos comerciales ampicilina y kanamicina fueron usados como control en el mismo rango de concentraciones. En el ensayo se incluyeron cepas estándar de S. aureus y E. faecalís. La figura 2 muestra los niveles de crecimiento frente a una 15 representación logarítmica de las diferentes concentraciones del compuesto 2. La figura 3 muestra los niveles de crecimiento frente a una representación logarítmica de las diferentes concentraciones de ampicilina (control) . La figura 4 muestra los niveles de crecimiento frente a una representación logarítmica de las diferentes concentraciones de kanamicina (control) .
Ensayo de viabilidad celular por MTT.
Distintas líneas celulares cancerígenas (HL60, MCF7, SK-Br3, HEL y otras) fueron cultivadas en medio RPMI y DMEM conteniendo 10% de suero fetal bovino. Para el análisis de MTT (bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-ilo) -2, 5-5 difeniltetrazol) (Sigma-Aidrich, St. Louis, MO) , las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una concentración de 1 0000 células/pocillo. Luego de 24 h de incubación a 37 oc y 5 % de C02, se añadió el disolvente (DMSO, a concentración final no tóxica O, 1 %) o el rango predeterminado de concentraciones del compuesto a ensayar. Luego de 48 h de incubación, se añadió una solución de MTT a cada pocillo (concentración final 0, 5 mg/ml) , y las placas fueron adicionalmente incubadas 3 h a 37 oc. Posteriormente, se procedió a la extracción del medio y a la solubilización de los cristales de formazán por adición de SDS-HCI (20% SOS; HCI 0.02M) a cada pocillo. La absorbancia de cada pocillo fue registrada por medio un lector de microplacas a 570 nm. Para el cálculo de IC50 (Concentración lnhibitoria 50) se realizó un análisis de regresión no-linear utilizando el programa GraphPad v5.
Así a modo de ejemplo, la tabla 3 muestra datos de citotoxicidad ejercida por el compuesto C2.
Tabla 3: IC50 del compuesto C2 descripto en la presente invención (~M)
Compuesto Líneas Celulares
HL60 MCF7 SKBr3 HEL C2 1, 4 gt;30 2, 5 1, 1
