Derivados de colismicina.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención está comprendida dentro del campo de la biología, la farmacia y la medicina.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Dentro de la naturaleza las moléculas que presentan en su estructura un grupo 2, 2’-bipiridil son compuestos con un gran número de actividades biológicas descritas (Cristalli et al., 1986) ; (Gomi et al., 1994) ; (Tsuge et al. 1999) . Una de estas moléculas es la colismicina producida por Streptomyces spp. CS40 (FIG. 1A) , que presenta actividad antibiótica frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, antifúngica frente a un amplio espectro de hongos y citotóxica frente a células de leucemia P388 (Gomi et al. 1994) ; (Tsuge et al., 1999) . Adicionalmente la colismicina está descrita como un inhibidor de la unión entre la dexametasona y los receptores de glucocorticoides (Shindo et al., 1994) y en la patente WO/2007/017146 se describe la capacidad de la colismicina para inhibir el estrés oxidativo en células.
El desarrollo de la tecnología de ADN recombinante se está convirtiendo en una poderosa herramienta a la hora de incrementar nuestro conocimiento sobre los genes que participan en la biosíntesis de compuestos bioactivos. Esta tecnología puede hoy en día ser aplicada a la mejora en los niveles de producción de distintos compuestos bioactivos y a la obtención de nuevas moléculas derivadas con mejores propiedades clínicas a través de la combinación de genes de distintas rutas de biosíntesis de moléculas bioactivas y su expresión en microorganismos productores de estos compuestos, en lo que se ha denominado biosíntesis combinatoria.
La tecnología de ADN recombinante ha hecho posible el aislamiento de agrupaciones de genes completas para la biosíntesis de distintos compuestos bioactivos utilizando, entre otras estrategias, la clonación, la selección o el análisis de genotecas de los microorganismos productores de moléculas con interés farmacológico mediante sondas de ADN. Esta estrategia se basa en la existencia de información genética previa sobre la ruta de biosíntesis o rutas relacionadas biosintéticamente, lo que permite utilizar o diseñar sondas genéticas a partir de la secuencia total o parcial de un enzima de biosíntesis.
En la literatura científica no existe apenas información acerca de la maquinaria celular encargada de la biosíntesis de compuestos del tipo 2, 2’- bipiridil. Tan sólo se han realizado estudios sobre la biosíntesis de una molécula de la familia 2-2’-bipiridil, la caerulomicina. La caerulomicina es una molécula con una estructura similar a la de la colismicina (FIG. 1B) producida por Streptomyces caeruleus (Funk y Divekar, 1959) .
A través de experimentos de incorporación de precursores marcados radiactivamente se identificaron algunas de las moléculas intermediarias durante la biosíntesis de caerulomicina, una de estas moléculas es el ácido picolínico (Vining et al., 1988) . Este compuesto ha sido descrito, además, como un metabolito intermediario en la biosíntesis de otras moléculas bioactivas por parte de algunas especies de Streptomyces como es el caso de la nikomicina D (Bruntner y Bormann, 1998) . En todos los casos descritos en la literatura el precursor para la biosíntesis del ácido picolínico ó 3hidroxipicolínico (en el caso de la biosíntesis de virginiamicina) es el aminoácido lisina y las enzimas encargadas de la generación de este compuesto han sido identificadas, siendo la primera de ellas un enzima con actividad lisina 2aminotransferasa (Bruntner y Bormann, . 1998; Namwat et al., 2002) .
La presente invención describe la clonación y secuenciación de la agrupación de genes de biosíntesis de colismicina en el microorganismo productor Streptomyces sp. CS40. La información genética disponible sobre enzimas del tipo lisina-2aminotransferasa, ha sido usada para diseñar oligonucleótidos y construir una sonda genética que ha permitido el aislamiento y clonación de la agrupación de genes de biosíntesis de colismicina. Desde el punto de vista genético, no hay descripciones previas en la literatura relativas al aislamiento y secuenciación de la agrupación de genes de biosíntesis de colismicina u otra molécula de la familia 2, 2’-bipiridil producida por especies de Streptomyces.
La invención proporciona una importante herramienta para la manipulación genética de esta agrupación de genes en el sentido de aumentar la producción de colismicina y/o obtener nuevos derivados de esta molécula o moléculas estructuralmente relacionadas con propiedades mejoradas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se relaciona con el aislamiento e identificación de una agrupación de genes que participan en la biosíntesis de colismicina por Streptomyces spp. CS40, y proporciona una herramienta para la manipulación genética de esta agrupación génica para aumentar la producción de colismicina y obtener nuevos derivados con propiedades mejoradas para su aislamiento y utilización, entre otros, en el sector farmacéutico o químico.
Esta invención describe una secuencia de ADN que contiene 24 genes implicados en la biosíntesis de colismicina y sus precursores, incluyendo aquellos implicados en la regulación del agrupamiento génico. El agrupamiento génico incluye genes que codifican para un sistema híbrido policétido sintasa-péptido sintetasa no ribosomal (PCS-NRPS) encargado de sintetizar la estructura central de la colismicina, genes que codifican enzimas implicados en la biosíntesis del precursor ácido picolínico de la colismicina, genes que codifican enzimas implicados en modificaciones de la molécula tales como deshidrogenasas, aminotransferasas y metiltransferasas. La invención por tanto se refiere a nuevos genes y moléculas de ácidos nucleicos que codifican proteínas/polipéptidos que muestran actividades funcionales implicadas en la biosíntesis de colismicina, y su potencial aplicación en el incremento de los niveles de producción de colismicina en Streptomyces spp. CS40 y en la producción de nuevos derivados de colismicina.
Los procedimientos experimentales aplicados a la presente invención incluyen métodos de biología molecular convencionales. Una descripción detallada de los métodos utilizados y no detallados aquí se puede obtener de Hopwood et al. (1985) ; Sambrook et al. (1989) y Kieser et al., (2000) .
Con el fin de clonar la agrupación de genes de biosíntesis de colismicina, se construyó una genoteca de ADN cromosómico de Streptomyces spp. CS40 en Escherichia coli, utilizando el cósmido pWE15 (ver ejemplo 2) .
Para el aislamiento de la agrupación de genes de biosíntesis de colismicina se utilizó una sonda genética consistente en un fragmento de PCR de 412 bp procedente de la amplificación parcial del gen que codifica para una lisina 2aminotransferasa implicada en la biosíntesis de colismicina. Para su amplificación se utilizó como molde el ADN cromosómico de la cepa CS40 y dos oligonucleótidos: L2ATson1 (SEQ ID NO: 31) y L2ATson2 (SEQ. ID NO: 32) diseñados en base a la secuencia nucleotídica de una lisina 2-aminotransferasa cuya secuencia, de aproximadamente 500 bp, se identificó previamente usando los oligonucleótidos degenerados L2ATFW2 (SEQ. ID NO: 29) y L2ATRV2 (SEQ ID NO: 30) .
La utilización de esta sonda en la hibridación de la genoteca de ADN cromosómico de Streptomyces spp. CS40 permitió aislar un cósmido (cos1C3) que define una región de aproximadamente 41 kb en el cromosoma. La participación del ADN clonado en el cósmido cos1C3 en la biosíntesis de colismicina se determinó utilizando un fragmento BamHI de 3128 bp, que contenía un fragmento interno a un gen que codifica para una NRPS. Este fragmento fue clonado en el plásmido pOJ260 (Bierman et al., 1992) . La construcción resultante se usó para la disrupción génica en Streptomyces spp. CS40 generando un mutante no productor de colismicina (ver ejemplo 4) como prueba de la implicación del ADN clonado en la biosíntesis de colismicina.
No obstante, el análisis de la secuencia del cósmido cos1c3 mostró la necesidad de extender la región hacia la izquierda para buscar otros genes no presentes en el cósmido cos1C3, posiblemente implicados en la biosíntesis de colismicina. Un fragmento amplificado por PCR usando los oligonucleótidos 1c3-5FW (SEQ ID NO: 33) y 1c3-5RV (SEQ ID NO: 42) de 1, 9 kb del extremo del cósmido cos1C3 se usó como sonda para analizar de nuevo la genoteca de Streptomyces spp. CS40 aislándose un nuevo cósmido solapante con el cósmido cos1C3, cos3B11, usado para completar la secuencia de 46672 bp de la región que contiene el agrupamiento génico implicado en la biosíntesis de colismicina (FIG. 2) .
La asignación de funciones en la biosíntesis a los distintos productos génicos se realizó mediante comparación de sus secuencias aminoacídicas con las de otras proteínas presentes en bases de datos (ver ejemplo 3) . Algunos genes codifican enzimas biosintéticos estructurales (incluyendo PCSs, NRPSs, etc.) , activadores transcripcionales, proteínas implicadas en la exportación al exterior de la célula, y proteínas implicadas en el aporte de precursores para la biosíntesis de colismicina. La participación de esta agrupación génica en la biosíntesis de colismicina se demostró mediante inactivaciones de diferentes genes tanto por disrupción como por reemplazamiento génico (ver ejemplos 4, 6 y 8) , generándose en algunos de ellos nuevos derivados de colismicina (ver ejemplos 7 y 8) . La actividad antitumoral de los nuevos compuestos generados por manipulación de la ruta de biosíntesis de colismicina se ha valorado mediante ensayos de citotoxicidad in vitro frente a distintas líneas celulares tumorales (ver ejemplo 9) . La actividad neuroprotectora de los nuevos compuestos se ha valorado en ensayos utilizando el modelo del pez cebra (ver ejemplo 10) . No todos los genes identificados en la región de ADN presentada en esta invención forman parte del agrupamiento génico implicado en la biosíntesis de colismicina. El establecimiento de los límites del agrupamiento génico se realizó mediante disrupción de los genes orf1 y orf27 y reemplazamiento del gen orf25 (ver ejemplo 5) .
La presente invención describe procedimientos para la manipulación de los genes de biosíntesis, encaminados a obtener nuevos derivados de la colismicina por técnicas de disrupción y/o reemplazamiento génico generando mutantes en la biosíntesis de colismicina que acumulen distintos intermediarios. Las nuevas cepas generadas, productoras de análogos de colismicina por manipulación genética son las denominadas Streptomyces spp. CLM-A, Streptomyces spp. CLM-L, Streptomyces spp. CLM-M2 y han sido depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , con números de depósito 7755, 7754 y 7756 respectivamente.
La presente invención proporciona asimismo compuestos análogos de colismicina A y colismicina C obtenidos mediante acilación enzimática catalizada por una lipasa del grupo oxima o hidroxilo, respectivamente.
En el sentido de la presente invención se entiende por acilación enzimática la transformación de un sustrato en un derivado acilado a partir de su reacción con un agente acilante catalizada por lipasa. Lipasas útiles para la acilación pueden encontrarse en Tetrahedron 2004, 60, 501-519; Chem. Soc. Rev. 2004, 33, 201-209; o Adv. Synth. Catal. 2006, 348, 797-812. Más concretamente, en la presente invención se utiliza la lipasa de Burkholderia cepacia (PS-C) , para5 obtener derivados de colismicina A y colismicina C acilados. Estas lipasas se presentan en diferentes formas de inmovilización sobre soportes hidrófobos y mecánicamente resistentes o sobre resinas acrílicas, como puede ser una resina epoxiacrílica activada con grupos deca-octilo. Agentes acilantes útiles para la presente invención son aquellos que pueden actuar como sustratos de la lipasa utilizada dando lugar a la acilación de la colismicina A y colismicina C, y pueden ser ésteres, carbonatos y anhídridos. La reacción puede llevarse a cabo en una gran variedad de disolventes orgánicos. Más concretamente, en la presente invención se utiliza el éter metil tertbutílico (MTBE) . En general la temperatura debe mantener la estructura de la enzima intacta sin que se produzcan fenómenos de desnaturalización. La reacción puede llevarse a cabo entre 5 y 60ºC, preferiblemente entre 10 y 60ºC, más preferiblemente entre 20 y 50ºC.
Asimismo, la presente invención proporciona compuestos caracterizados por la siguiente fórmula (I) :
donde R1, R2, R3 y R4 son, cada uno e independientemente, hidrógeno o un grupo protector. El grupo protector puede consistir en un grupo alquilo, un grupo cicloalquilo, un grupo cicloalquilo heterocíclico, un grupo hidroxialquílico, un grupo alquilo halogenado, un grupo alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo arilo, un grupo arilo heterocíclico, un grupo alquilarilo, un grupo éster, un grupo cetona, un grupo carbonato, un grupo ácido carboxílico, un grupo aldehído, un grupo cetona, un grupo oxima, un grupo nitrilo, un grupo uretano, un grupo sililo, un grupo sulfoxi o una combinación de ellos; exceptuando los compuestos con las siguientes fórmulas:
, también conocido como Colismicina A y como (E) -5- (metiltio) -4-metoxi-[2, 2'-bipiridin6-il]-carbaldehido oxima,
, también conocido como Colismicina B, y como (Z) -5- (metiltio) -4-metoxi-[2, 2'-bipiridin6-il]-carbaldehido oxima, y
, también conocido como Colismicina C y como 5- (metiltio) -4-metoxi-[2, 2'-bipiridin-6-il]
metanol.
En particular, la presente invención proporciona, entre otros, los compuestos de Fórmula II a XVI comprendidos en la Fórmula I: Fórmula II: 6- (hidroximetil) -5- (metiltio) -[2, 2'-bipiridin-4-ol]. Fórmula III: (E) -4-hidroxi-5- (metiltio) -[2, 2'-bipiridin-6-il]-carbaldehido oxima.
Fórmula IV: 4-hidroxi-5- (metiltio) -[2, 2'-bipiridinil-6-il]-carbonitrilo. Fórmula V: ácido 4-hidroxi-5- (metiltio) -[2, 2'-bipiridin-6-il]-carboxílico. Fórmula VI: (E) -6’-metil-5- (metiltio) -4-metoxi-[2, 2'-bipiridin-6-il]-carbaldehido oxima. Fórmula VII: (E) -4’-metil-5- (metiltio) -4-metoxi-[2, 2'-bipiridin-6-il]-carbaldehido oxima. Fórmula VIII: 4’-metil-5- (metiltio) -4-metoxi-[2, 2'-bipiridin-6-il]-metanol.
Fórmula IX: (E) -4-hidroxi-4’-metil-5- (metiltio) -[2, 2'-bipiridin-6-il]-carbaldehido oxima. Fórmula X: 4-hidroxi-4’-metil-5- (metiltio) -[2, 2'-bipiridin-6-il]-carbonitrilo. Fórmula XI: acetato de 5- (metiltio) -4-metoxi-[2, 2'-bipiridin-6-il]-metilo. Fórmula XII: butanoato de 5- (metiltio) -4-metoxi-[2, 2'-bipiridin6-il]-metilo. Fórmula XIII: benzoato de 5- (metiltio) -4-metoxi-[2, 2'-bipiridin-6-il]-metilo.
Fórmula XIV: (E) -5- (metiltio) -4-metoxi-[2, 2'-bipiridin-6-il]-carbaldehido O-acetil oxima. Fórmula XV: (E) -5- (metiltio) -4-metoxi-[2, 2'-bipiridin-6-il]-carbaldehido O-cloroacetil oxima. Fórmula XVI: (E) -5- (metiltio) -4-metoxi-[2, 2'-bipiridin-6-il]-carbaldehido O-butanoil oxima.
Estos compuestos son derivados o análogos de colismicina A con un grupo metilo en posiciones 4’ o 6’ (compuestos de fórmula VI y VII, respectivamente) , colismicina A desmetilada en 4 (compuesto de fórmula III) , colismicina A desmetilada en 4 y con un grupo metilo en 4’ (compuesto de fórmula IX) , colismicina C desmetilada en 4 (compuesto de fórmula II) , colismicina C metilada en 4’ (compuesto de fórmula VIII) , o bien compuestos análogos con la unidad 2, 2’-bipiridil característica y un grupo funcional nitrilo o ácido carboxílico en posición 6 (compuestos de fórmula IV, V y X) . Asimismo, los compuestos de fórmula XI, XII y XIII son ésteres derivados de colismicina C y los compuestos de fórmula XIV, XV y XVI son ésteres de oxima derivados de colismicina A.
La presente invención describe asimismo el uso de los nuevos compuestos como antibióticos, antitumorales o neuroprotectores.
Los compuestos de la invención son inhibidores del crecimiento de tumores y son por tanto útiles en el tratamiento del cáncer. Así mismo los compuestos de la invención son inhibidores de la lisis o la apoptosis neuronal inducida por estrés oxidativo y por tanto útiles en el tratamiento de aquellas enfermedades neurodegenerativas causadas por agentes oxidantes, tanto exógenos como endógenos, al paciente.
De esta forma, son objeto de la presente invención las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de Fórmula (I) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufacturación de un medicamento.
Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de Fórmula (I) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo para inhibir el crecimiento de un tumor o la lisis o apoptosis neuronal causada por estrés oxidativo.
Tal como es usado aquí, “inhibir” significa disminuir, hacer más lento, o detener. Por tanto, un compuesto de esta invención puede disminuir, hacer más lento, o detener el crecimiento de una célula tumoral o bien disminuir hacer más lenta, o detener la lisis o la apoptosis neuronal en condiciones de estrés oxidativo.
Tal como es usado aquí, “crecimiento” significa aumento en tamaño, o proliferación, o ambos. Por tanto, un compuesto de esta invención puede inhibir el aumento de tamaño de una célula tumoral y/o puede impedir que la célula tumoral se divida y aumente el número de células tumorales. Una “célula tumoral” es una célula que constituye un neoplasma (crecimiento nuevo) , el cual puede ser canceroso (maligno) o no canceroso (benigno) . Una célula tumoral cancerosa puede invadir los tejidos normales a su alrededor y los vasos sanguíneos/linfáticos y formar metástasis en tejidos alejados del tumor original. Por el contrario, una célula tumoral no cancerosa puede crecer y comprimir los tejidos normales adyacentes pero no puede invadir tejidos normales y vasos sanguíneos/linfáticos, y tampoco puede formar metástasis en tejidos alejados del tumor original.
Tal como es usado aquí, enfermedad neurodegenerativa significa aquel tipo de enfermedad cuyos síntomas son el resultado de la muerte por lisis o apoptosis de neuronas. El estrés oxidativo en el contexto de enfermedad neurodegenerativa se refiere a aquella situación anómala en la que el citoplasma de las neuronas presenta un aumento de la cantidad de especies reactivas de oxígeno (H2O2, HO2, O2– y OH-) . Estas especies reactivas de oxígeno pueden ser generadas por el propio metabolismo de la neurona enferma, por otros órganos del individuo o ser exógenas al individuo.
Tal como es usado aquí, un compuesto neuroprotector frente al estrés oxidativo es aquel compuesto capaz de detener, minimizar o ralentizar la lisis o la apoptosis neuronal causada por agentes oxidantes.
Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de Fórmula (I) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo para tratar el cáncer o enfermedades neurodegenerativas causadas o agravadas por la lisis o apoptosis neuronal inducida por estrés oxidativo.
Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de Fórmula (I) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufacturación de un medicamento con actividad antitumoral o neuroprotectora frente a estrés oxidativo.
Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de Fórmula (I) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufacturación de un medicamento para el tratamiento del cáncer o de ciertas enfermedades neurodegenerativas.
Es también objeto de la presente invención un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con cáncer o con una enfermedad neurodegenerativa, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Tal como es usado aquí, un “sujeto” puede incluir animales domesticados (por ejemplo, gatos, perros, etc.) , ganado (por
ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.) , animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, cobayas, etc.) y pájaros. De manera preferente, el sujeto es un mamífero tal como un primate y, con mayor preferencia, un ser humano.
En general, una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un compuesto es aquella cantidad necesaria para conseguir el resultado deseado. Por ejemplo, la cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención trata el cáncer mediante la inhibición del crecimiento de las células que constituyen el tumor, con lo que previene la invasión de tejidos normales y vasos sanguíneos/linfáticos por parte de las células tumorales y, por tanto, previene metástasis, o bien cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención es aquella capaz de ralentizar o inhibir la apoptosis neuronal en condiciones de estrés oxidativo. La expresión “composición farmacéutica aceptable” se refiere a un material adecuado biológicamente, es decir, que el material puede ser administrado al sujeto sin causarle efectos biológicos sustancialmente dañinos.
Las dosis o cantidades de los compuestos de la invención deben ser suficientemente grandes para producir el efecto deseado. Sin embargo, la dosis no debe ser tan alta que cause efectos secundarios adversos, por ejemplo reacciones cruzadas indeseadas, reacciones anafilácticas, y similares. Generalmente, la dosis variará con la edad, condición, sexo y el grado de la enfermedad del sujeto, y puede ser determinada por cualquier experto en la materia. La dosis puede ser ajustada por cada médico, en base a la condición clínica del sujeto implicado. La dosis, régimen de dosificación y ruta de la administración pueden variarse.
Los compuestos de la invención pueden ser útiles para la investigación en bioquímica o biología celular.
Cualquiera de los compuestos de la invención puede ser utilizado terapéuticamente formando parte de una composición farmacéutica aceptable. Las composiciones farmacéuticas aceptables pueden consistir en soluciones estériles en agua, soluciones salinas, o soluciones tamponadas a pH fisiológico. Cualquiera de los compuestos de la invención puede ser preparado en forma de composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir diversos agentes transportadores, espesantes, diluentes, tamponantes, conservantes, tensoactivos, y otros, además del compuesto de la invención. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir también ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos, antiinflamatorios, anestésicos, etc.
Los compuestos de la invención pueden ser administrados al sujeto de varias maneras distintas, dependiendo de si se desea que el tratamiento sea local o sistémico, y dependiendo del área a ser tratada. Así por ejemplo, un compuesto de la presente invención puede ser administrado en forma de solución oftálmica, de aplicación en la superficie del ojo. Además un compuesto puede ser administrado a un sujeto por vía vaginal, rectal, intranasal, oral, por inhalación, o por vía parenteral, ya sea por ruta intradermal, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intrarrectal, intraarterial, intralinfática, intravenosa, intratecal e intratraqueal. La administración parenteral, si se emplea, se realiza generalmente mediante inyección. Los inyectables pueden ser preparados de diversas formas, tales como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para ser disueltas o puestas en suspensión antes de la inyección, o como emulsiones. Otras formas de administración parenteral emplean sistemas de liberación lenta o sostenida, de tal forma que se consigue mantener una dosis constante (ver, por ejemplo, patente US 3, 710, 795) . Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas o no acuosas, suspensiones, y emulsiones, que además pueden contener tampones y aditivos diluentes y otros. Ejemplos de solventes no acuosos son: propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como etiloleato. Ejemplos de solventes acuosos son: agua, soluciones alcohólico-acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo soluciones salinas y tamponadas. Ejemplos de vehículos parenterales son: solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, etc. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, gases inertes, etc. Las formulaciones para administración tópica pueden incluir cremas, lociones, geles, gotas, supositorios, sprays, líquidos y polvos. También pueden ser necesarios o deseables ciertos transportadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, oleosas, o en polvo, espesantes, etc. Las composiciones para administración oral pueden incluir polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, o tabletas. Puede ser deseable la inclusión de agentes espesantes, saborizantes, diluentes, emulsionantes, dispersantes, etc.
A los efectos de la presente invención y su descripción, el término “derivado” o “análogo” de colismicina debe interpretarse como un compuesto cubierto por la Fórmula general (I) que no necesariamente debe derivar de la colismicina sino que puede ser sintetizado de novo.
La presente invención se describe en detalle a continuación con una serie de ejemplos sin que en ningún caso sean ejemplos que limiten su utilización a los que se mencionan.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.
A. Estructura de la colismicina A producida por Streptomyces spp CS40.
B. Estructura de la caerulomicina producida por Streptomyces caeruleus.
Figura 2. Diagrama en el que se muestra una representación esquemática del mapa de restricción, utilizando el enzima de restricción BamHI (posiciones numeradas en el esquema) , de la agrupación génica para la biosíntesis de colismicina en Streptomyces spp. CS40 contenida en la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ IN NO: 1. La escala se muestra en kilobases (kb) . cos1C3 y cos3B11 representan los cósmidos en los cuales se ha aislado la secuencia de nucleótidos descrita como SEQ IN NO: 1. Los genes presentes en la agrupación génica se representan por números bajo las flechas. Los genes que se han inactivado dentro del agrupamiento génico se muestran como flechas grises y el resto como flechas negras. Los genes no implicados en la biosíntesis de colismicina se muestran como flechas blancas.
Figura 3. Análisis por cromatografía líquida (UPLC) y cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas (HPLC/MS) . La FIG. 3A muestra la producción de colismicina A (pico a 3.259 min) en la cepa silvestre Streptomyces spp. CS40 analizado por UPLC. En las ordenadas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las abscisas como unidades arbitrarias (AU) . La FIG. 3B muestra el espectro de absorción de colismicina A. En las abscisas se representa la longitud de onda en nanómetros (nm) y en las ordenadas como unidades arbitrarias. La FIG. 3C muestra colismicina A purificada producida en la cepa silvestre Streptomyces spp. CS40 y analizada por HPLC/MS. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . La FIG. 3D muestra el espectro de masas de la colismicina A marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades) .
Figura 4. El análisis por UPLC de la cepa silvestre Streptomyces spp. CS40 productora de colismicina A se muestra en la FIG. 4A. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . En la FIG. 4B se muestra el análisis por UPLC del mutante CLM-L obtenido por reemplazamiento génico, no productor de colismicina A. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . En la FIG. 4C se muestra el análisis por UPLC del mutante CLM-12, obtenido por disrupción génica, no productor de colismicina A. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) .
Figura 5. El análisis por UPLC de la cepa mutante CLM-22D productora de colismicina A se muestra en la FIG. 5A. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . En la FIG. 5B se muestra el análisis por UPLC de la cepa mutante CLM-24, productora de colismicina A. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) .
Figura 6. Esquema de los pasos iniciales en la ruta de biosíntesis de colismicina A. El aminoácido lisina, en una reacción catalizada por el producto génico de los genes orf19 y orf20, se transforma en ácido picolínico. Posteriormente el resto de genes implicados en la biosíntesis continuaran modificando este compuesto hasta producir colismicina A.
Figura 7. La FIG. 7A muestra un esquema de la organización genética del mutante CLM-L (cepa depositada como CECT 7754) que presenta interrumpido el gen orf19 que codifica para una lisina 2-aminotransferasa. En la FIG. 7B. se muestra el análisis por cromatografía líquida (UPLC) del extracto de la cepa mutante no productora de colismicina A. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . La FIG. 7C muestra el análisis por cromatografía líquida de muy alta resolución (UPLC) del extracto de la cepa mutante no productora de colismicina A suplementada con ácido picolínico, compuesto capaz de rescatar la producción de colismicina A. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) .
Figura 8. Análisis de la producción de colismicina C y del compuesto de fórmula II por la cepa mutante CLM-A (depositada como CECT 7755) . En la FIG. 8A se muestra el esquema de la organización genética del mutante CLM-A, que presenta interrumpido el gen orf11, que codifica para una aminotransferasa. La FIG. 8B muestra el análisis por UPLC del extracto del mutante CLM-A, el pico a 2.86 min corresponde al compuesto de fórmula II y el pico a 2.987 a la Colismicina C. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . La FIG. 8C muestra el espectro de absorción del compuesto de fórmula II. En las abscisas se representa la longitud de onda en nanómetro (nm) y en las ordenadas como unidades arbitrarias. La FIG 8D muestra el espectro de absorción de Colismicina C. En las abscisas se representa la longitud de onda en nanómetro (nm) y en las ordenadas como unidades arbitrarias. La FIG. 8E muestra el perfil de MS correspondiente al compuesto de fórmula II marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades) . La FIG. 8F muestra el perfil de MS correspondiente a la Colismicina C marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades) .
Figura 9. Análisis de la producción de colismicinas modificadas, compuestos de fórmula III y de fórmula IV por la cepa mutante CLM-M2 (depositada como CECT 7756) . En la FIG. 9A se muestra el esquema de la organización genético del mutante CLM-M2, que presenta interrumpido el gen orf9, que codifica para una metiltransferasa. La FIG. 9B muestra el análisis por UPLC del extracto del mutante CLM-M2, señalando los compuestos de fórmula III y de fórmula IV. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . La FIG. 9C muestra el espectro de absorción del compuesto de fórmula III. En las abscisas se representa la longitud de onda en nanómetro (nm) y en las ordenadas como unidades arbitrarias. La FIG 9D muestra el espectro de absorción del compuesto de fórmula IV. En las abscisas se representa la longitud de onda en nanómetro (nm) y en las ordenadas como unidades arbitrarias. La FIG. 9E muestra el perfil de MS del compuesto de fórmula III marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades) . La FIG. 9F muestra el perfil de MS del compuesto de fórmula IV marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades) .
Figura 10. Análisis de la producción de colismicina modificada, compuesto de fórmula V por la cepa mutante CLM-G. En la FIG. 10A se muestra el esquema de la organización genético del mutante CLM-G, que presenta interrumpidos los genes orf13 y orf14, que codifican para proteínas similares GriD (YP_001825756) y GriC (YP_001825755) . La FIG. 10B muestra el análisis por HPCL/MS del extracto de la cepa silvestre Streptomyces spp. CS40. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . La FIG. 10C muestra el análisis por HPCL/MS del extracto de la cepa mutante CLM-G. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . La FIG. 10D muestra el espectro de absorción del compuesto de fórmula V. En las abscisas se representa la longitud de onda en nanómetro (nm) y en las ordenadas como unidades arbitrarias. La FIG. 10E muestra el perfil de MS del compuesto de fórmula V marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades) .
Figura 11. Análisis de la producción de colismicinas modificadas, compuestos de fórmula VI y de fórmula VII, producidos por la cepa mutante CLM-L (depositada como CECT 7754) suplementada con ácido 6-metil picolínico y ácido 4-metilpiridina-2-carboxílico respectivamente. En la FIG. 11A se muestra el análisis por UPLC del extracto del mutante CLM-L suplementado con ácido 6-metil picolínico, señalando el compuesto de fórmula VI. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . La FIG. 11B muestra el espectro de absorción del compuesto de fórmula VI. En las abscisas se representa la longitud de onda en nanómetro (nm) y en las ordenadas como unidades arbitrarias. La FIG. 11C muestra el perfil de MS del compuesto de fórmula VI marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades) . En la FIG. 11D se muestra el análisis por UPLC del extracto del mutante CLM-L suplementado con ácido 4-metilpiridina-2-carboxílico, señalando el compuesto de fórmula VII. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . La FIG. 11E muestra el espectro de absorción del compuesto VII. En las abscisas se representa la longitud de onda en nanómetro (nm) y en las ordenadas como unidades arbitrarias. La FIG. 11F muestra el perfil de MS del compuesto de fórmula VII marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades) .
Figura 12. Análisis de la producción de colismicina modificada, compuesto de fórmula VIII, producido por la cepa mutante CLM-A (depositada como CECT 7755) suplementada con ácido 4-metilpiridina-2-carboxílico. En la FIG. 12A se muestra el análisis por UPLC del extracto del mutante CLM-A suplementado con ácido 4-metilpiridina-2-carboxílico, señalando el compuesto de fórmula VIII. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . La FIG. 12B muestra el espectro de absorción del compuesto de fórmula VIII. En las abscisas se representa la longitud de onda en nanómetro (nm) y en las ordenadas como unidades arbitrarias. La FIG. 12C muestra el perfil de MS del compuesto de fórmula VIII marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades) .
Figura 13. Análisis de la producción de colismicinas modificadas, compuestos de fórmula IX y X, producidos por la cepa mutante CLM-M2 (depositada como CECT 7756) suplementada con ácido 4-metilpiridina-2-carboxílico. En la FIG. 13A se muestra el análisis por UPLC del extracto del mutante CLM-M2 suplementado con ácido 4-metilpiridina-2-carboxílico señalando los compuestos de fórmula IX y de fórmula X. En las abscisas se representa el tiempo en minutos (min.) y en las ordenadas como unidades arbitrarias (AU) . La FIG. 13B muestra el espectro de absorción del compuesto de fórmula IX. En las abscisas se representa la longitud de onda en nanómetro (nm) y en las ordenadas como unidades arbitrarias. La FIG. 13C muestra el espectro de absorción del compuesto de fórmula X. En las abscisas se representa la longitud de onda en nanómetro (nm) y en las ordenadas como unidades arbitrarias. La FIG. 13D muestra el perfil de MS del compuesto de fórmula IX marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades) . La FIG. 13E muestra el perfil de MS del compuesto de fórmula X marcándose en cada pico el valor de masas (sin unidades) .
Figura 14. Capacidad neuroprotectora de la colismicina A y de los compuestos de fórmula VI y VII. En todos los casos de la FIG 14 la presencia de células apoptóticas se muestra por los puntos teñidos intensamente en el cerebro de embriones de pez cebra. En la FIG 14A se muestra el cerebro de embriones de pez cebra sin tratar. En la FIG 14B se muestra el cerebro de embriones de pez cebra tratados con ácido retinoico 10 μM. En la FIG 14C se muestra el cerebro de embriones de pez cebra tratados con ácido retinoico 10 μM y con colismicina A 1 μM. En la FIG 14D se muestra el cerebro de embriones de pez cebra tratados con ácido retinoico 10 μM y el compuesto de fórmula VI 1 μM. En la FIG 14E se muestra el cerebro de embriones de pez cebra tratados con ácido retinoico 10 μM y el compuesto de fórmula VII 1 μM. En la FIG 14F se muestra el cerebro de embriones de pez cebra tratados con ácido retinoico 10 μM y ácido lipoico 1 μM. En la FIG 14G se muestra una representación gráfica de la capacidad neuroprotectora de la colismicina A y los compuestos de fórmula II, XI, VI y VII respectivamente. El eje de ordenadas muestra el porcentaje de apoptosis en el cerebro de los embriones de pez cebra. Se consideró el 0% de apoptosis como el nivel de apoptosis basal de los cerebros de embriones no tratados (EW) y el 100% de apoptosis como el nivel de apoptosis presente en los cerebros de embriones tratados con ácido retinoico 10 μM (AR) . Los ensayos de neuroprotección se realizaron tratando los embriones de pez cebra con ácido retinoico en presencia de los distintos compuestos a ensayar. Como control de neuroprotección se usó ácido lipoico (AR+LP) . Los compuestos ensayados como neuroprotectores fueron la colismicina A (AR+Col.A) , el compuesto de fórmula II (AR + II) , la colismicina C (AR+Col.C) , el compuesto de fórmula VI (AR + VI) y el compuesto de fórmula VII (AR + VII) . Como puede comprobarse en la gráfica, el compuesto de fórmula VII presenta una actividad neuroprotectora mejorada respecto a la colismicina A y a la colismicina C.
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención hace referencia a un procedimiento de aislamiento y purificación de un fragmento de ADN, que contiene la agrupación de genes de la ruta de biosíntesis de colismicina de la bacteria Streptomyces spp. CS40, que se incluye en un fragmento de 46672 bp del genoma de Streptomyces spp. CS40. El proceso comprende las siguientes etapas: (a) obtención de una genoteca de ADN genómico de un microorganismo productor de colismicina; (b) transfección de clones de dicha genoteca en células hospedadoras; (c) diseño de oligonucleótidos para el aislamiento de la agrupación de genes de biosíntesis de colismicina; (d) construcción de una sonda que comprende una secuencia nucleotídica de una agrupación de genes de biosíntesis de colismicina; (e) utilización de sondas heterólogas para el aislamiento de la agrupación de genes de biosíntesis de colismicina; (f) hibridación de dichas sonda con una genoteca de ADN genómico obtenida de dicho microorganismo y (g) aislamiento de dicha agrupación génica a partir de los clones con hibridación positiva.
El segundo aspecto de la presente invención hace referencia a una molécula de ácido nucleico que consiste en una secuencia de nucleótidos descrita como SEQ ID NO: 1; o una secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO: 1; o una secuencia de nucleótidos degenerada respecto a SEQ ID NO: 1; o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones restrictivas con SEQ ID No. 1, con la hebra complementaria de SEQ ID NO: 1, o con una sonda de hibridación derivada de SEQ ID NO: 1 o de su hebra complementaria; o una secuencia de nucleótidos que posee al menos un 80 % de identidad de secuencia con SED ID NO:1; o una secuencia de nucleótidos que posee al menos 65 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO:1 y que preferiblemente codifica o es complementaria a una secuencia que codifica al menos un enzima biosintético de colismicina o una parte de él. En una realización preferida de la invención la molécula de ácido nucleico se caracteriza porque tiene al menos 15 nucleótidos de longitud. En otra realización preferida de la invención la molécula de ácido nucleico codifica uno o más polipéptidos, o que incluye uno o más elementos genéticos, que poseen una actividad funcional en la síntesis de un antibiótico 2, 2’-bipiridílico o un precursor de un 2, 2’-bipiridilo. En otra realización preferida de la invención dicho antibiótico 2, 2’-bipiridílico es colismicina o un precursor de colismicina. En otra realización preferida de la invención la molécula de ácido nucleico codifica uno o más polipéptidos, o incluye uno o más genes y/o una o más secuencias reguladoras, y/o uno o más elementos genéticos codificadores o no codificadores, que tienen actividad funcional en la síntesis de un 2, 2’-bipiridilo o un precursor de un 2, 2’-bipiridilo. En otra realización preferida de la invención la molécula de ácido nucleico se caracterizada porque dicho antibiótico 2, 2’-bipiridílico o precursor de un 2, 2’-bipiridilo es colismicina o un precursor de colismicina. En otra realización preferida de la invención la molécula de ácido nucleico se caracteriza por incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos de las descritas en SEQ ID NOs: 2 a 28, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria o degenerada con respecto a una secuencia de nucleótidos que codifica una o más secuencias de aminoácidos que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 28. En otra realización preferida de la invención la molécula de ácido nucleico codifica una o más secuencias aminoacídicas que poseen al menos un 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 28.
El tercer aspecto de la presente invención hace referencia a un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico arriba descrita. En una realización preferida de la invención el polipéptido incluye: una o más secuencias aminoacídicas completas, o partes de las mismas, descritas en SEQ ID NOs: 2 a 28; o una o más secuencias aminoacídicas completas, o partes de las mismas, que poseen al menos un 60% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 28. En otra realización preferida de la invención el polipéptido está caracterizado porque las secuencias aminoacídicas arriba mencionadas poseen al menos un 85% de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOs: 2 a 28. En otra realización preferida de la invención el polipéptido posee una actividad funcional en la síntesis de un antibiótico 2, 2’-bipiridílico.
El cuarto aspecto de la presente invención hace referencia a una molécula de ADN recombinante, que incluye el fragmento de ADN arriba mencionado, o una parte con similares características, clonada en un vector que se replica en Streptomyces o en E. coli. En una realización preferida de la invención el ADN recombinante es el cósmido cos1c3 o el cósmido cos3b11.
El quinto aspecto de la presente invención hace referencia a una célula hospedadora o un organismo transgénico no humano que contiene una molécula de ácido nucleico arriba mencionada.
Así, los genes codificados por el fragmento de ADN arriba citado, y las células hospedadoras u organismos transgénicos que comprenden dicho fragmento de ADN, pueden usarse en la producción de metabolitos 2, 2’-bipiridílicos, particularmente en la producción de colismicina, derivados de colismicina o precursores de colismicina; para incrementar la producción de metabolitos 2, 2’-bipiridílicos; para incrementar la producción de colismicina, derivados de colismicina o precursores de colismicina; en la inactivación de genes implicados en la biosíntesis de colismicina; en técnicas de amplificación por PCR encaminadas al aislamiento y/o utilización de genes implicados en la biosíntesis de colismicina.
El sexto aspecto de la presente invención hace referencia a un proceso para incrementar la producción de 2, 2’-bipiridilos en un hospedador bacteriano, que comprende la transferencia del fragmento de ADN arriba mencionado a un hospedador de Streptomyces, cultivo de la cepa recombinante obtenida, y aislamiento del 2, 2’-bipiridilo producido. En una realización preferida de la invención el hospedador es del género Streptomyces es Streptomyces spp. CS40. En otra realización preferida de la invención el hospedador Streptomyces spp. CS40 es un mutante derivado de Streptomyces spp. CS40. En otra realización preferida de la invención el compuesto 2, 2’-bipiridílico es colismicina, un derivado de colismicina o un precursor de colismicina.
El séptimo aspecto de la presente invención hace referencia a un proceso para generar derivados de colismicina o precursores de colismicina por inactivación de genes codificados por el fragmento de ADN arriba mencionado. En una realización preferida de la invención el proceso se focaliza en la utilización de intermediarios de colismicina o derivados de colismicina como compuestos de partida en la síntesis química de productos 2, 2’-bipiridílicos.
El octavo aspecto de la presente invención hace referencia a un proceso para generar derivados o análogos de colismicina A y colismicina C mediante acilación enzimática catalizada por una lipasa.
El noveno aspecto de la presente invención hace referencia a la cepa mutante Streptomyces spp. CLM-A depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de identificación 7755 y a los productos acumulados por la misma.
El décimo aspecto de la presente invención hace referencia a la cepa mutante Streptomyces spp. CLM-M depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con el número de identificación 7756 y a los productos acumulados por la misma.
El undécimo aspecto de la presente invención hace referencia a un compuesto de Fórmula (I) , exceptuando a los compuestos de fórmula:
donde R1, R2, R3 y R4 son, cada uno e independientemente, hidrógeno o un grupo protector. El grupo protector puede consistir en un grupo alquilo, un grupo cicloalquilo, un grupo cicloalquilo heterocíclico, un grupo hidroxialquílico, un grupo alquilo halogenado, un grupo alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo arilo, un grupo arilo heterocíclico, un grupo alquilarilo, un grupo éster, un grupo cetona, un grupo carbonato, un grupo ácido carboxílico, un grupo aldehído, un grupo cetona, un grupo oxima, un grupo nitrilo, un grupo uretano, un grupo sililo, un grupo sulfoxi o una combinación de ellos. En una realización preferida de la presente invención el compuesto de Fórmula (I) se selecciona entre los compuestos de Fórmula II a X. El duodécimo aspecto de la presente invención hace referencia al uso de los compuestos de Fórmula I para la elaboración de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del cáncer, al tratamiento enfermedades neurodegenerativas, o su uso como neuroprotector, o al tratamiento enfermedades infecciosas, o a su uso como antibiótico. Además, este aspecto también hace referencia a los compuestos de Fórmula I para ser usados en el tratamiento del cáncer, en el tratamiento enfermedades neurodegenerativas, o como neuroprotector, o en el tratamiento enfermedades infecciosas, o como antibiótico. El décimo tercer aspecto de la presente invención hace referencia a una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los compuestos de Fórmula I y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. El último aspecto de la presente invención hace referencia a un método para el tratamiento del cáncer, para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas o para el tratamiento de enfermedades infecciosas que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula I o de una composición farmacéutica que comprenda al menos un compuesto de Fórmula I.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Aislamiento de la cepa productora de colismicina Streptomyces spp. CS40
La cepa Streptomyces spp. CS40 fue aislada a partir de unas hormigas cortadoras de hojas de especie Acromyrmex octospinosus recolectadas en el departamento Lambayeque en Perú. La secuenciación y análisis de su 16SrDNA mostró su ubicación dentro del género Streptomyces sin niveles de identidad concluyentes a nivel de especie. La cepa Streptomyces spp. CS40 se encuentra depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número de depósito 7757.
Ejemplo 2. Clonación de la agrupación génica implicada en la biosíntesis de colismicina.
2.1. Microorganismos, plásmidos y condiciones de cultivo.
Los microorganismos y plásmidos utilizados se describen en la Tabla 1. Streptomyces spp. CS40 y los mutantes generados a partir de él se cultivaron para su esporulación en medio A (Fernández et al., J. Bacteriol., 180, 4929-4937, 1998) ; para la producción de antibiótico se cultivó en medio líquido R5A (Fernández et al., J. Bacteriol., 180, 4929-4937, 1998) ; utilizando un inoculo previamente cultivado en medio líquido TSB (Tr y ptone Soya Broth, Merck) . La conjugación intergenérica desde Escherichia coli ET12567 (pUB307) a Streptomyces spp. CS40 se realizó según Sambrook et al., Molecular cloning: a laborator y manual. Cold Spring Harbour, NY: Cold Spring Harbour Laborator y press (1989) . Las cepas de E. coli se cultivaron y transformaron como se describe por Sambrook et al., (1989) . Los medios de cultivo fueron suplementados con los antibióticos apropiados a cada marcador de resistencia en las concentraciones siguientes: 100 µg/ml ampicilina, 20 µg/ml tobramicina, 25 µg/ml apramicina, 50 µg/ml tiostreptona, 25 µg/ml kanamicina 10 µg/ml tetraciclina, 25 µg/ml cloramfenicol y 50 µg/ml ácido nalidíxico.
Tabla 1. Cepas bacterianas y plásmidos usados en este estudio.
Cepa, plásmido Propiedades Fuente o referencia
E. coli DH10B Huésped general de clonación Invitrogen
E. coli XLI Blue MR Huésped para la construcción de la genoteca Stratagene
E. coli ET12567 Cepa para la conjugación intergenérica Kieser et al., Practical
(pUB307) Streptomyces Genetics. The
John Innes Foundation.
Norwich, 2000
Streptomyces spp. Productor de colismicina A Aislado en nuestro laboratorio
CS40
pWE15 Cósmido para la construcción Stratagene
de la genoteca
pOJ260 Plásmido para la disrupción génica Bierman et al., Gene 116, 43
49, 1992
pEM4T Plásmido para la expresión de genes en Menéndez et al., Appl.
Streptomyces Environ. Microbiol. 72, 167
177, 2006
pCR-BLUNT Plásmido para la clonación de productos de PCR Invitrogen
pU09090 Plásmido fuente del gen de resistencia a Prado et al., Mol Gen Genet.
apramicina 201, 216-225, 1999
pBluescript SK+ Vector de clonación en E. coli Stratagene
pHZ1358 Plásmido para el reemplazamiento génico Sun et al.,
Appl. Microbiol. Biotechnol 82,
303-310, 2009
pGemT Plásmido para la clonación de productos de PCR Promega
2.2. Análisis de la producción de colismicina A.
La producción de colismicina A se realizó de forma rutinaria en 1, 5 mL de medio R5A sólido (Fernández et al., J. Bacteriol., 180, 4929-4937, 1998) en placas de 25 pocillos. Para su inóculo se utilizaron esporas de Streptomyces spp. CS40 y los cultivos se mantuvieron durante 7 días a 30ºC, extrayéndose tras ese tiempo con 1 ml de acetato de etilo. La producción de colismicina A se realizó también en cultivos líquidos de 5 a 7 días crecidos en un agitador orbital a 30 °C y 250 rpm. Para ello se utilizaron matraces Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 50 ml de medio R5A líquido (Fernández et al., J Bacteriol, 180: 4929-4937, 1998) . Para su inoculo se utilizó un volumen del 2% de un preinóculo de Streptomyces spp. CS40 realizado en medio TSB (50 ml en matraces de 250 ml) que se recogió después de dos días de incubación en un agitador orbital a 30°C y 250 rpm. La colismicina A presente en los cultivos líquidos se extrajo con volúmenes variables de acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo se evaporaron utilizando una centrifuga acoplada a vacio (Speed-Vac) y una vez evaporadas las muestras se resuspendieron en metanol para su análisis.
La identificación y análisis cuantitativo de colismicina A se llevó a cabo mediante cromatografía en fase reversa en un equipo Acquity UPLC utilizando una columna BEH C18 (2, 1 x 100 mm Waters) y utilizando acetonitrilo y 0, 1% TFA en agua como solventes. Las muestras fueron eluídas con acetronitrilo al 10% durante 1 min seguido por un gradiente lineal de acetonitrilo desde el 10% al 80% durante 7 min. El flujo utilizado fue de 0, 5 ml/min y la temperatura de la columna de 35ºC. Para el análisis de masas acoplado a HPLC (HPLC/MS) se uso un sistema cromatográfico Alliance acoplado a un espectrómetro de masas ZQ4000 y a una columna Symmetr y C18 (2.1 x 150 mm, Waters) . Los solventes utilizados fueron los mismos que los descritos anteriormente y la elución se realizó manteniendo inicialmente un 10% de acetonitrilo durante 4 min, seguido de un gradiente lineal desde el 10% al 88% de acetonitrilo durante 26 min, utilizando para ello un flujo de 0, 25 ml/min. El análisis de masas se realizó por ionización electrospray en modo positivo, con un voltaje de capilar de 3 kV y un voltaje de cono de 20 V. La detección de los picos y la caracterización de su espectro de absorción se realizó en ambos casos con un sistema de fotodiodos en línea y utilizando el software Empower de Waters, extrayéndose cromatogramas bidimensionales a una longitud de onda de 332 nm.
Para la caracterización estructural de los derivados de colismicina A mencionados en esta invención se realizaron cultivos de las cepas de Streptomyces spp. CS40 correspondientes. Tras centrifugación para eliminar las células, los caldos resultantes se sometieron a extracción en fase sólida en cartuchos de extracción con relleno C18 (Sep-Pak Vac, Waters) . Los compuestos buscados se purificaron a partir de los extractos resultantes utilizando HPLC preparativa en fase reversa. Todas las purificaciones se hicieron en condiciones isocráticas con mezclas de acetonitrilo o metanol y 0.05% TFA en agua, en proporciones optimizadas para cada compuesto. Las columnas empleadas fueron una XTerra PrepRP18 (19 x 300 mm, Waters) y una Symmetr y C18 (7, 8 x 300 mm, Waters) . Las soluciones con los picos purificados se evaporaron parcialmente en rotavapor para reducir su contenido en solvente orgánico y posteriormente se cargaron en un cartucho de extracción en fase sólida (Sep-Pak C18, Waters) . Los compuestos retenidos se lavaron sucesivamente con agua, 0.1% amoníaco en agua y de nuevo agua, para eliminar totalmente el TFA. Finalmente se eluyeron con metanol, se secaron en vacio y por último se liofilizaron. La identificación y análisis cuantitativo de colismicina A se llevó a cabo mediante cromatografía en fase reversa en un equipo Acquity UPLC utilizando una columna BEH C18 (2.1 x 100 mm, Waters) y utilizando acetonitrilo y 0.05% TFA como solventes. Las muestras fueron eluídas con acetronitrilo al 10% durante 1 min seguido por un gradiente lineal de acetonitrilo desde el 10% al 80% durante 7 min. El flujo utilizado fue de 0, 5 ml/min y la temperatura de la columna de 30ºC. Para el análisis de masas acoplado a HPLC (HPLC/MS) se uso un sistema cromatográfico Alliance acoplado a un espectrómetro de masas ZQ4000 y a una columna Symmetr y C18 (2.1 x 150 mm, Waters) . Los solventes utilizados fueron los mismos que los descritos anteriormente y la elución se realizó con un gradiente isocrático inicial de acetonitrilo al 10% mantenido durante 4 min y seguido por un gradiente lineal de acetonitrilo desde el 10% al 88% durante 26 min, utilizando para ello un flujo de 0, 25 ml/min. El análisis de masas se realizó por ionización electrospray en modo positivo, con un voltaje de capilar de 3 kV y un voltaje de cono de 20 V. La detección de los picos y la caracterización de su espectro de absorción se realizaron en ambos casos con un sistema de fotodiodos en línea y utilizando el software Empower de Waters, extrayéndose cromatogramas bidimensionales a una longitud de onda de 360 nm.
La colismicina A analizada en UPLC presenta una retención de 3.30 min y un espectro de absorción con máximos a 250 y 332 nm. La colismicina A analizada en HPLC/MS presenta una retención de 15.13 min y muestra un ión molecular con una masa de 276 m/z [M+H]+. (FIG. 3)
Para la caracterización estructural de los derivados de colismicina mencionados en esta invención se realizaron cultivos de las cepas de Streptomyces spp. CS40 correspondientes y los extractos fueron disueltos en 5 ml de una mezcla de DMSO y metanol a partes iguales. Posteriormente se centrifugaron y se eliminó la capa superior correspondiente a la fracción lipídica. El primer paso de purificación se realizó por cromatografía en una columna XTerra PrepRP18 (19 x 300 mm, Waters) usando como solventes acetonitrilo y ácido trifluoroacético (TFA) al 0, 05% disuelto en agua. Se utilizó un gradiente lineal desde el 30% al 100% de acetonitrilo durante 7 min seguido por 3 min de acetonitrilo al 100%. El flujo utilizado fue de 15 ml/min. Los picos de interés fueron recolectados sobre tampón fosfato 0, 1 M, pH 7, 0. Las soluciones obtenidas fueron parcialmente evaporadas en un rotavapor para reducir la concentración de acetonitrilo y posteriormente se aplicaron a un cartucho de extracción en fase sólida (Sep-Pak C18, Waters) , se lavaron posteriormente con agua para eliminar las sales y se eluyeron con metanol. Las purificaciones posteriores se realizaron en condiciones isocráticas, optimizadas para cada pico, utilizando una columna Symmetr y C18 (7, 8 x 300 mm, Waters) y mezclas de acetonitrilo y TFA al 0, 05% disuelto en agua, usando un flujo de 7 ml/min. Tal como se mencionó anteriormente, los picos se recogieron siempre sobre tampón fosfato 0, 1 M, pH 7, 0, se desalaron utilizando extracción en fase sólida y finalmente se liofilizaron.
2.3. Manipulación de ADN.
La preparación de plásmidos, ADN total, digestiones con enzimas de restricción, ligaciones de ADN, etc., se llevó a cabo siguiendo métodos estandarizados previamente descritos (Sambrook et al., Molecular cloning: a laborator y manual. Cold Spring Harbour, NY: Cold Spring Harbour Laborator y press, 1989; Kieser et al., Practical Streptomyces Genetics. The John Innes Foundation. Norwich, 2000) . Los fragmentos de ADN fueron aislados de geles de agarosa utilizando el kit de extracción QUIAquick Gel Extraction Kit de QIAGEN (Hilden, Germany) y marcados usando el kit de detección y marcaje DIG DNA Labelling and Detection Kit de Roche Diagnostics (Manheim, Germany) utilizado para el análisis por Southern de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La secuenciación fue realizada sobre ADN de doble cadena utilizando el método de descrito por Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5463-5467 (1977) y el kit de secuenciación Cy5 Autocycle Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) . La electroforesis de las muestras fue realizada en un secuenciador automático Alf-express (Pharmacia Biotech) . Las secuencias obtenidas se analizaron usando el paquete informático de programas del GCG, del Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin (Devereux et al., Nucleic Acids Res. 12, 387-395, 1984) y el programa BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990) . El análisis de las regiones transmembrana de posibles proteínas transmembranales se realizó utilizando el programa TMHMM v.
2.0 (Krogh et al., J. Mol. Biol. 305, 567-580, 2001) . El análisis de PCS y NRPS se realizó utilizando los programas ASMPKS (Tae et al., BMC Bioinformatics. 8, 327-335, 2007) y NRPSpredictor (Rausch et al., Nucleic Acids Res. 33, 5799-5808, 2005) .
2.4. Amplificación de fragmentos de ADN por PCR y clonación de un fragmento de ADN que codifica parte de una lisina 2-aminotransferasa del genoma de Streptomyces spp. CS40.
La estrategia empleada para la clonación de la agrupación de genes de biosíntesis de colismicina fue la utilización de la homología genética con algunas proteínas codificadas por genes previamente caracterizados y para los cuales debería existir un homólogo en la ruta de biosíntesis de colismicina.
La información disponible sobre la biosíntesis de ácido picolínico (Bruntner y Bormann, 1998; Namwat et al., 2002) , un intermediario en la ruta de biosíntesis de caerulomicina (Vining et al., 1988) y posiblemente también en la de colismicina fue usada para diseñar los oligonucleótidos degenerados L2ATFW2 (SEQ ID NO: 29) y L2ATRV2 (SEQ ID NO: 30) y tratar de amplificar una secuencia perteneciente a un gen homólogo a lisina 2-aminotransferasas.
Para la obtención del ADN total de Streptomyces spp. CS40 el microorganismo se cultivó en medio líquido TSB y el ADN total se aisló como ha sido descrito por Kieser et al., (2000) . El ADN total de Streptomyces spp. CS40 fue utilizado como molde para la reacción en cadena de la polimerasa utilizando los oligonucleótidos L2ATFW2 (SEQ ID NO: 29) y L2ATRV2 (SEQ ID NO: 30) . Se asumió que, como consecuencia de la amplificación se obtendría un fragmento de ADN de aproximadamente 0.6 kb que contendría la parte interna del gen que codifica para una lisina 2-aminotransferasa. La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo en un volumen total de 50 μl y la mezcla de reacción contenía 0, 1 μg de ADN total de Streptomyces spp. CS40, 2.5% de dimetilsulfóxido (DMSO) , 200 pmoles de cada cebador, dNTPs (concentración final 200 μM) , 1xPCR del enzima Taq DNA polimerasa (Invitrogen) . La reacción en cadena se realizó en un termociclador GeneAmp® PCR System9700 de Applied Biosystems con el siguiente programa: 1 ciclo de desnaturalización a 98ºC (5 min) , 30 ciclos de desnaturalización/ anillamiento/ síntesis a 94ºC (1 min) / 55ºC (1 min) / 72ºC (1 min) y 1 ciclo de extensión final a 72ºC (10 min) . El fragmento de ADN obtenido con este procedimiento fue clonado en el vector de E. coli pGemT usando el procedimiento recomendado por el fabricante y fue sometido a secuenciación utilizando técnicas estandarizadas. El análisis de la secuencia del fragmento amplificado por PCR reveló que contenía parte de una proteína que presentaba claras similitudes a nivel de aminoácidos con varias lisina 2aminotransferasas previamente caracterizadas: NikC de Streptomyces tendae, número de acceso CAA75797 (Bruntner y Bormann, 1998) y VisA de Streptomyces virginiae, número de acceso BAB83671 (Namwat et al., 2002) .
A partir de esta secuencia homóloga a lisina 2-amino transferasas amplificada fueron diseñados dos oligonucleótidos para construir una sonda genética. Los oligonucleótidos sintéticos L2ATson1 (SEQ ID NO: 31) y L2ATson2 (SEQ ID NO: 32) fueron utilizados como cebadores para la amplificación de la sonda genética por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y usando como ADN molde el ADN cromosómico de Streptomyces spp. CS40. La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo en un volumen total de 50 μl y la mezcla de reacción contenía 0, 1 μg de ADN total de Streptomyces spp. CS40, 2.5% de dimetilsulfóxido (DMSO) , 200 pmoles de cada cebador, dNTPs (concentración final 200 μM) , 1xPCR del enzima pfx DNA polimerasa (Invitrogen) . La reacción en cadena se realizó en un termociclador GeneAmp® PCR System9700 de Applied Biosystems con el siguiente programa: 1 ciclo de desnaturalización a 98ºC (5 min) , 30 ciclos de desnaturalización/ anillamiento/ síntesis a 94ºC (1 min) / 60ºC (1 min) / 68ºC (1 min) y 1 ciclo de extensión final a 68ºC (10 min) . El fragmento de ADN obtenido con este procedimiento fue clonado en el vector de Escherichia coli pCR-Blunt y fue sometido a secuenciación utilizando técnicas estandarizadas.
Una vez confirmado que el fragmento amplificado formaba parte de la región codificadora de la lisina 2aminotransferasa este fragmento se utilizó como sonda genética para el análisis de una genoteca de ADN cromosómico de Streptomyces spp. CS40.
2.5. Construcción y análisis de la genoteca de ADN cromosómico de Streptomyces spp. CS40.
La genoteca de ADN cromosómico de Streptomyces spp. CS40 fue construida en el cósmido pWE15 que es capaz de replicarse en E. coli. El ADN genómico de Streptomyces spp. CS40 fue aislado como se ha descrito anteriormente, fue digerido parcialmente con Sau3AI y los fragmentos obtenidos, de un tamaño aproximado de 35-40 kb, fueron desfosforilados por tratamiento con fosfatasa alcalina (Roche Diagnostics, Mannheim) . El cósmido pWE15, utilizado como vector, fue linearizado con BamHI. Los fragmentos de ADN y el vector fueron ligados y empaquetados in vitro usando un kit comercial de empaquetamiento Gigapack III Gold packaging Extract kit siguiendo las instrucciones de la casa comercial (Stratagene) . Las partículas de ADN recombinante fueron utilizadas para infectar células de E.coli XLI Blue MR y los transductantes fueron seleccionados en placas con medio LA (Luria-Bertani agar) conteniendo como antibiótico de selección ampicilina. Aproximadamente 1000 colonias transductantes fueron cultivadas en placas de microtitulación conteniendo medio LB (Luria-Bertani broth) y el antibiótico de selección. Después de su incubación a 37ºC durante 24 h, fueron mantenidas en presencia de glicerol al 25% a -70ºC para su preservación.
Con objeto de clonar la agrupación de genes de biosíntesis de colismicina se llevó a cabo el análisis de la genoteca de Streptomyces spp. CS40 mediante hibridación in situ de colonias con la sonda mencionada anteriormente. Los transductantes fueron transferidos de las placas de microtitulación a placas de medio LA conteniendo como antibiótico de selección ampicilina y tras una noche de crecimiento a 37ºC las colonias fueron transferidas a filtros de nylon para su hibridación in situ siguiendo los protocolos descritos por Sambrook et al., (1989) . Los filtros fueron analizados con las sondas marcadas utilizando el kit comercial DIG DNA labeling and detection kit de Roche. De este modo (y como se detalló anteriormente) se aisló el cósmido cos1C3.
Ejemplo 3. Obtención y análisis de la secuencia nucleotídica del agrupamiento génico responsable de la biosíntesis de colismicina y deducción de las funciones de los genes.
El cósmido cos1C3 y el fragmento EcoRV/HindIII de 7, 7 kb procedente del cósmido cos3B11 subclonado en los mismos sitios en el vector pBluescriptSK+ fueron secuenciados en su totalidad. La secuenciación fue realizada sobre ADN de doble cadena utilizando el método de descrito por Sanger et al., (1977) y utilizando el kit de secuenciación Cy5 Autocycle Sequencing Kit (Pharmacia Biotech) . La electroforesis de las muestras fue realizada en un secuenciador automático Alf-express (Pharmacia Biotech) y los datos obtenidos se analizaron usando el paquete informático de programas del GCG, del Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin (Devereux et al., 1984) y el programa BLAST (Altschul et al., 1990) . El análisis de las regiones transmembrana de posibles proteínas transmembranales se realizó utilizando el programa TMHMM v. 2.0 (Krogh et al., J. Mol. Biol. 305, 567-580, 2001) .El análisis de PCS y NRPS se realizó utilizando los programas ASMPKS (Tae et al., 2007) y NRPSpredictor (Rausch et al., 2005) .
El análisis informático de la secuencia de ADN de 46668 bp (SEQ ID NO: 1) mostró la presencia de 27 pautas de lectura abierta (ORFs) (FIG. 2 y Tabla 2) con un alto contenido en G+C característico del ADN de Streptomyces. Además se muestra un contenido especialmente alto en G+C alto en la tercera posición de los codones característico de genes de Streptomyces. Las funciones de los genes fueron deducidas por comparación de las secuencias aminoacídicas, traducidas conceptualmente a partir de la secuencia nucleotídica, con secuencias conocidas disponibles en bases de datos. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2 referidos a los datos de secuencia que se incluyen en la solicitud. 23 de las 27 ORFS encontradas, que ocupan una región de 37, 5 kb, están probablemente implicadas en la biosíntesis de colismicina. Esta región esta flanqueada por 4 ORFs probablemente no implicadas en la biosíntesis de colismicina (en blanco en la FIG. 2) . De estas ORFs, orf1, mostró gran similitud con una posible helicasa de S. viridochromogenes DSM 40736 (ZP_05534927) y una posible kinasa de S. scabiei 87.22, (YP_003487313) .
De las 23 ORFs que se proponen implicadas en la biosíntesis de colismicina A, 16 ORFs están implicadas en la biosíntesis de la parte estructural de la colismicina, 5 de ellas (orf3-7) están implicadas en el transporte de colismicina, 2 ORFs (orf2 y orf8) están probablemente implicadas en procesos de regulación.
Tabla 2. Genes identificados en la región del cromosoma de Streptomyces spp. CS40 implicada en la biosíntesis de colismicina.
Gen Posición Aminoácidos Función deducida Notas
orf1 549-2237 compl. 563 Desconocida SeqID.NO:2
orf2 2857-3414 186 Regulador transcripcional homólogo a TetR SeqID.NO:3
orf3 3514-5247 compl. 578 Transportador SeqID.NO:4
orf4 5256-7016 compl. 587 Transportador SeqID.NO:5
orf5 7225-8193 323 Transportador SeqID.NO:6
orf6 8322-9305 328 Transportador SeqID.NO:7
orf7 9314-10099 262 Transportador SeqID.NO:8
orf8 10363-10869 169 Regulador transcripcional homólogo a LuxR SeqID.NO:9
orf9 11042-12070 compl. 343 Metil transferasa SeqID.NO:10
orf10 12105-13703 compl. 533 Deshidrogenasa SeqID.NO:11
orf11 13861-15495 compl. 545 Aminotransferasa SeqID.NO:12
orf12 15620-16606 329 Metiltransferasa SeqID.NO:13
orf13 16688-18076 compl. 463 Proteína similar a GriD (YP_001825756) Ar y lcarboxilato reductasa componente SeqID.NO:14
orf14 18078-19109 compl. 344 Proteína similar a GriC (YP_001825755) Arilcarboxilato reductasa componente SeqID.NO:15
orf15 19405-20613 403 Monoxigenasa SeqID.NO:16
orf16 20680-21921 compl. 414 Amidohidrolasa SeqID.NO:17
orf17 21926-23614 compl. 563 Enzima formadora de adenilato SeqID.NO:18
orf18 23611-23871 compl. 87 Proteína de unión a fosfopanteteína SeqID.NO:19
orf19 24108-25484 459 Lisina 2-aminotransferasa SeqID.NO:20
orf20 25481-26662 394 Sarcosina oxidasa monomérica SeqID.NO:21
orf21 26548-34206 2553 Proteína híbrida PCS/NRPS SeqID.NO:22
orf22 34203-37478 1092 NRPS SeqID.NO:23
orf23 37475-38659 395 Deshidrogenasa SeqID.NO:24
orf24 38652-39380 243 Tioesterasa SeqID.NO:25
orf25 39442-40665 compl. 408 Desconocida SeqID.NO:26
orf26 41103-41708 202 Desconocida SeqID.NO:27
orf27 42017-46105 1363 Desconocida SeqID.NO:28
Ejemplo 4. Inactivación de la agrupación de genes de biosíntesis de colismicina mediante disrupción génica.
Con objeto de demostrar la implicación de la agrupación de genes clonados en la biosíntesis de colismicina se llevó a 5 cabo la inactivación del gen orf21.
Para la inactivación de la orf21 se aisló un fragmento BamHI del cósmido cos1C3. Este fragmento de 3128 bp es interno a orf21 (sitios BamHI 13 y 14, FIG. 2) y fue clonado en el plásmido pOJ260 digerido con BamHI. La construcción resultante, pOJB12 fue introducida en Streptomyces spp. CS40 mediante conjugación intergenérica desde E. coli ET12567 (pUB307) para generar la cepa mutante CLM-12 que fue seleccionada por su resistencia a apramicina.
La mutación en el gen orf21 fue comprobada mediante análisis por Southern. El mutante se demostró no productor de colismicina A mediante análisis por UPLC de muestras de cultivos de Streptomyces spp. CS40 y CLM-12 extraídas con acetato de etilo (FIG. 4) , confirmando de este modo la implicación de la agrupación de genes en la biosíntesis de colismicina.
Ejemplo 5. Establecimiento de los límites de la agrupación de genes de biosíntesis de colismicina mediante reemplazamiento génico.
Para establecer los límites del agrupamiento génico implicado en la biosíntesis de colismicina se realizaron dos mutantes por disrupción génica y un mutante por reemplazamiento génico en los genes orf1 (mutante CLM-H) y orf27 (mutante CLM-24) y orf25 (mutante CLM-22D) respectivamente En el caso de los mutantes CLM-H y CLM-24 las ORFs se interrumpen por introducción de un gen de resistencia a apramicina y en el caso del mutante CLM-22D la ORF se sustituye por el gen de resistencia a apramicina.
Para la obtención del mutante en la orf1 se amplificó una región de 910 pb correspondiente a un fragmento interno a la orf1 con los oligonucleótidos HelDisr1 (SEQ ID NO: 34) y HelDisr2 (SEQ ID NO: 35) . Dicho fragmento se clonó en el vector pCR-Blunt para generar el plásmido pCRBH y se sometió a secuenciación utilizando técnicas estandarizadas. Posteriormente este fragmento se obtuvo del plásmido pCRBH digiriendo el mismo con EcoRI y se clonó en el mismo sitio de restricción del vector pOJ260, generando así el plásmido pOJBH que se usó para la disrupción génica en Streptomyces spp. CS40.
En ningún caso fuimos capaces de obtener mutantes que llevaran interrumpida la orf1 sugiriendo que este gen es esencial para la viabilidad celular. Este dato descarta la participación de la orf1 en la biosíntesis de colismicina, puesto que los distintos mutantes (CLM-L, CLM-12) que presentan afectada la biosíntesis de colismicina son perfectamente viables, excluyendo así este gen del cluster de biosíntesis de colismicina.
Para la obtención del mutante CLM-24 se obtuvo un fragmento ClaI-BamHI de 2271 bp, procedente del cósmido cos1C3 que corresponde a un fragmento interno a la orf27. Dicho fragmento se hizo romo y se clonó en el vector pOJ260 en el sitio EcoRV generando así el plásmido pOJB23P que se usó para la disrupción génica en Streptomyces spp. CS40 generando el mutante CLM-24.
Para la obtención del mutante CLM-22D se empleó la técnica de reemplazamiento génico. Se amplificó mediante PCR un fragmento de 1526 bp que se encuentra flanqueando corriente arriba al gen orf25. Para ello se usaron los oligonucleótidos ORF22del1 (SEQ ID NO: 36) y ORF22del2 (SEQ ID NO: 37) a los que se les introdujeron las dianas de restricción EcoRI y HindIII respectivamente, dicho fragmento se clonó en el vector pCR-Blunt y fue sometido a secuenciación utilizando técnicas estandarizadas. Posteriormente dicho fragmento se clonó en el vector pUO9090 en los sitios de restricción EcoRI y HindIII generando el plásmido pUO909022A. Adicionalmente se amplificó mediante PCR un segundo fragmento de 1496 bp que se encuentra flanqueando corriente abajo al gen orf25. Para ello se usaron los oligonucleótidos ORF22del3 (SEQ ID NO: 38) y ORF22del4 (SEQ ID NO: 39) a los que se les introdujo la diana EcoRV , este fragmento se clonó en el vector pCR-Blunt y fue sometido a secuenciación utilizando técnicas estandarizadas. Posteriormente dicho fragmento se clonó en el vector pUO909022A usando el sitio de restricción EcoRV para generar el vector pUO909022AB.
Para el reemplazamiento génico el casette de reemplazamiento se obtuvo del vector pUO909022AB digerido con SpeI y se clonó en el vector pHZ1358. La construcción resultante, pHZ22AB, fue usada para el reemplazamiento génico en Streptomyces spp. CS40 generando el mutante CLM-22D.
La integración del gen de resistencia a apramicina en el caso de los mutantes generados por disrupción así como el reemplazamiento en el cromosoma de la copia silvestre del gen por la mutada fue confirmado en los transconjugantes mediante análisis por Southern.
Cada uno de los mutantes fue analizado para conocer la producción de colismicina A, en paralelo con la cepa parental Streptomyces spp. CS40 mediante UPLC. Los mutantes CLM-22D y CLM-24, se mostraron como productores de colismicina A (FIG. 5) , indicando que los genes mutados no participan en la biosíntesis de colismicina y confirmando de este modo los límites del agrupamiento génico implicado en la biosíntesis de colismicina.
Ejemplo 6. Generación de un mutante en los pasos iniciales de la biosíntesis de colismicina.
El primero de los pasos propuestos para la biosíntesis de colismicina (FIG 6) consiste en la formación de ácido picolínico a partir de lisina y el primer gen implicado en este proceso sería una lisina 2-aminotransferasa codificada por la orf19. Para confirmar este dato se inactivó el gen orf19.
Para la inactivación de la orf19 se empleó la técnica de reemplazamiento génico. Se amplificó mediante PCR un fragmento de 1589 bp que se encuentra flanqueando corriente arriba al gen orf19. Para ello se usaron los oligonucleótidos ORF16del1 (SEQ ID NO: 40) y ORF16del2 (SEQ ID NO: 41) a los que se les introdujeron las dianas de restricción EcoRI y HindIII respectivamente, dicho fragmento se clonó en el vector pCR-Blunt y fue sometido a secuenciación utilizando técnicas estandarizadas. Posteriormente dicho fragmento se clonó en el vector pUO9090 en los sitios de restricción EcoRI y HindIII generando el plásmido pUO909016A. Adicionalmente se amplificó mediante PCR un segundo fragmento de 1559 bp que se encuentra flanqueando corriente abajo al gen orf19. Para ello se usaron los oligonucleótidos ORF16del3 (SEQ ID NO: 43) y ORF16del4 (SEQ ID NO: 44) a los que se les introdujeron las dianas de restricción BamHI y EcoRV respectivamente, este fragmento se clonó en el vector pCR-Blunt y fue sometido a secuenciación utilizando técnicas estandarizadas. Posteriormente dicho fragmento se clonó en el vector pUO909016A usando los sitios de restricción EcoRV y BamHI para generar el vector pUO909016AB.
Para el reemplazamiento génico el casette de reemplazamiento se obtuvo del vector pUO909016AB digerido con SpeI y se clonó en el vector pHZ1358. La construcción resultante, pHZ16AB, fue introducida en Streptomyces spp. CS40 mediante conjugación intergenérica desde E. coli ET12567 (pUB307) para generar la cepa mutante CLM-L. La cepa CLM-L se encuentra depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número de depósito 7754.
El mutante se demostró no productor de colismicina mediante análisis por UPLC de muestras de cultivos de Streptomyces spp. CS40 y CLM-L extraídas con acetato de etilo (FIG. 7B) , confirmando de este modo la implicación de este gen en la biosíntesis de colismicina.
Con el fin de corroborar la participación del gen orf19 en los pasos iniciales de biosíntesis se analizó por UPLC la producción de colismicina A por parte del mutante CLM-L en presencia de ácido picolínico (concentración final 1 mM) , un posible metabolito intermediario, en el medio de cultivo. Las muestras extraídas con acetato de etilo mostraron que el mutante CLM-L en presencia de ácido picolínico recupera la capacidad para producir colismicina A (FIG 7C) . Este dato confirma la participación de orf19 en los pasos iniciales de biosíntesis y la existencia de ácido picolínico como metabolito intermediario en la ruta.
Ejemplo 7. Generación de mutantes productores de nuevos derivados de colismicina mediante reemplazamiento génico.
Para generar mutantes de Streptomyces spp. CS40 capaces de producir colismicinas químicamente modificadas se seleccionaron de manera individual los genes orf11 y orf9 y de manera conjunta orf13 y orf14 (FIG. 2) , todos ellos posiblemente implicados en pasos finales de la biosíntesis de colismicina. Para ello se construyeron los plásmidos plásmidos pHZ6AB, pHZ8AB y pHZ101AB.
En primer lugar se amplificó mediante PCR, usando los oligonucleótidos sintéticos orf8del3 (SEQ ID NO: 45) y orf8del4 (SEQ ID NO: 46) un fragmento de 1499 bp correspondiente a la región corriente abajo del gen orf11, que se clonó en el vector pCR-Blunt para dar el plásmido pCRB8B que fue sometido a secuenciación utilizando técnicas estandarizadas. Este fragmento se extrajo del plásmido pCRB8B usando los sitios EcoRI existentes en el polilinker del vector pCRB-Blunt, se hizo romo y subclonó en el plásmido pU09090 para dar el plásmido pUO8B.
Posteriormente se amplificó por PCR usando los oligonucleótidos sintéticos orf8del1 (SEQ ID NO: 47) orf8del2 (SEQ ID NO: 48) que incluían sitios de restricción EcoRI y HindIII respectivamente para facilitar la subclonación, un fragmento de 1516 bp correspondiente a la región corriente arriba del gen orf11, que se clonó en el vector pCR-Blunt para dar el plásmido pCRB8A que fue sometido a secuenciación utilizando técnicas de secuenciación estandarizadas. Este fragmento se extrajo del plásmido pCRB8A usando los sitios de restricción EcoRI y HindIII y se subclonó en los mismos sitios del plásmido pUO8B para generar el plásmido PUO8AB.
El casette de reemplazamiento se extrajo del plásmido pUO8AB usando los sitios de restricción SpeI y se clonó en el vector pHZ1358 para generar el plásmido pHZ8AB que se introdujo en Streptomyces spp. CS40 por conjugación intergenérica desde E. coli ET12567 (pUB307) para generar la cepa mutante CLM-A. La cepa CLM-A se encuentra depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número de depósito 7755.
Para la generación de la cepa mutante CLM-M2 se amplificó mediante PCR un fragmento de 1504 bp perteneciente a la región corriente arriba del gen orf9. Para ello se utilizaron los oligonucleótidos orf6del1 (SEQ ID NO: 49) y orf6del2b (SEQ ID NO: 50) que llevaban los sitios de restricción EcoRI y HindIII respectivamente. Este fragmento se clonó en el vector pCR-Blunt generando así el plásmido pCRB6A que se secuenció usando técnicas estandarizadas. Posteriormente se obtuvo el fragmento digiriendo el plásmido pCRB6A con EcoRI y HindIII y se clonó en los mismos sitios del vector pUO9090 generando el vector pUO6A.
Después se amplificó mediante PCR un fragmento de 1504 bp perteneciente a la región corriente abajo del gen orf9. Para ello se utilizaron los oligonucleótidos orf6del3 (SEQ ID NO: 51) y orf6del4 (SEQ ID NO: 52) . Este fragmento se clonó en el vector pCR-Blunt generando así el plásmido pCRB6B que se secuenció usando técnicas estandarizadas. Posteriormente se obtuvo el fragmento digiriendo el plásmido pCRB6A con EcoRI, se hizo romo y se clonó en el sitio EcoRV del plásmido pUO6A generando así el plásmido pUO6AB.
El casette de reemplazamiento se extrajo del plásmido pUO6AB usando los sitios de restricción SpeI y se clonó en el vector pHZ1358 para generar el plásmido pHZ6AB que se introdujo en Streptomyces spp. CS40 por conjugación intergenérica desde E.coli ET12567 (pUB307) para generar la cepa mutante CLM-M2. La cepa CLM-M2 se encuentra depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número de depósito 7756.
Para la generación del doble mutante en los genes orf13 y orf14 se amplificó mediante PCR un fragmento de 1496 bp perteneciente a la región corriente arriba del gen orf14. Para ello se utilizaron los oligonucleótidos orf101del1 (SEQ ID NO: 53) y orf101del2 (SEQ ID NO: 54) que llevaban los sitios de restricción EcoRI y HindIII respectivamente (secuencia subrayada) . Este fragmento se clonó en el vector pCR-Blunt generando así el plásmido pCRB101A que se secuenció usando técnicas estandarizadas. Posteriormente se obtuvo el fragmento digiriendo el plásmido pCRB101A con EcoRI y HindIII y se clonó en los mismos sitios del vector pUO9090 generando el vector pUO101A.
Después se amplificó mediante PCR un fragmento de 1522 bp perteneciente a la región corriente abajo del gen orf13. Para ello se utilizaron los oligonucleótidos orf101del3 (SEQ ID NO: 55) y orf101del4 (SEQ ID NO: 56) que llevaban el sitio de restricción EcoRV (secuencia subrayada) . Este fragmento se clonó en el vector pCR-Blunt generando así el plásmido pCRB101B que se secuenció usando técnicas estandarizadas. Posteriormente se obtuvo el fragmento digiriendo el plásmido pCRB101B con EcoRV y se clonó en el mismo sitio del plásmido pUO101A generando así el plásmido pUO101AB.
El casette de reemplazamiento se extrajo del plásmido pUO101AB usando los sitios de restricción SpeI y se clonó en el vector pHZ1358 para generar el plásmido pHZ101AB que se introdujo en Streptomyces spp. CS40 por conjugación intergenérica desde E. coli ET12567 (pUB307) para generar la cepa mutante CLM-G. La cepa CLM-G se encuentra depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con número de depósito CECT7861.
En todos los casos los transconjugantes en los que había ocurrido un acontecimiento de doble sobrecruzamiento fueron seleccionados por su resistencia a apramicina y su sensibilidad a tioestreptona. El reemplazamiento en el cromosoma fue confirmado en los transconjugantes mediante análisis por Southern.
El análisis de cultivos de la cepa CLM-A por UPLC mostró dos picos con absorbancia característica de colismicina A pero con movilidades de 2, 86 min y 2, 99 min que corresponden a compuestos de fórmula II y a colismicina C (FIG. 8) . El análisis posterior por HPLC/MS determinó que el compuesto de fórmula II presenta una movilidad de 13, 42 min y un ión de 249 m/z [M+H]+. La colismicina C presenta una movilidad de 13, 56 min y un ión de 263 m/z [M+H]+.
El análisis de cultivos de la cepa CLM-M2 por UPLC mostró dos picos con absorbancia característica de colismicina A pero con movilidades de 3, 05 min y 4, 1 min correspondientes a los compuestos de fórmula III y de fórmula IV (FIG. 9) . El análisis posterior por HPLC/MS determinó que el compuesto de fórmula III presenta una movilidad de 15, 16 min y un ión de 262 m/z [M+H]+. El compuesto de fórmula IV presenta una movilidad de 19, 12 min y un ión de 244 m/z [M+H]+.
El análisis de cultivos de la cepa CLM-G por HPLC/MS mostró un pico con absorbancia característica de colismicina A ausente en la cepa silvestre (FIG 10A y B) correspondiente al compuesto de fórmula V y que presenta una movilidad de 6, 15 min (FIG 10C) y un ión de 263 m/z [M+H]+.
Ejemplo 8. Generación de nuevos derivados de colismicina mediante la adición de distintos precursores a la cepas mutantes CLM-L, CLM-A y CLM-M2.
Con el fin de generar nuevas moléculas derivadas de colismicina se suplementaron los medios de cultivo en los que se inocularon los mutantes CLM-L, CLM-A y CLM-M2 con dos análogos estructurales del ácido picolínico esperando que dichos compuestos fueran incorporados a la ruta de biosíntesis de colismicina.
Para ello se añadieron ácido 6-metil picolínico y ácido 4-metilpiridina-2-carboxílico a concentración final 0, 7 mM al medio R5A en el que se inocularon los mutantes CLM-L, CLM-A y CLM-M2. Tras 6 días de crecimiento a 30ºC se extrajeron los nuevos compuestos generados con acetato de etilo.
El análisis del cultivo de la cepa CLM-L al que se le añadió ácido 6-metil picolínico, por UPLC mostró un pico con absorbancia característica de colismicina pero con movilidad 3, 06 min que corresponde con el compuesto de fórmula VI. El análisis posterior por HPLC/MS determinó que el compuesto VI presenta un ión de 290 m/z [M+H]+ (FIG. 11A, B y C) .
El análisis del cultivo de la cepa CLM-L al que se le añadió ácido 4-metilpiridina-2-carboxílico, por UPLC mostró un pico con absorbancia característica de colismicina pero con movilidad 3, 14 min que corresponde con el compuesto de fórmula VII. El análisis posterior por HPLC/MS determinó que el compuesto de fórmula VII presenta un ión de 290 m/z [M+H]+ (FIG 11D, E y F) .
El análisis del cultivo por UPLC de la cepa CLM-A al que se le añadió ácido 4-metilpiridina-2-carboxílico, mostró un pico con absorbancia característica de colismicina pero con movilidad 3, 14 min que corresponde con el compuesto de fórmula VIII (FIG. 12) . El análisis posterior por HPLC/MS determinó que el compuesto de fórmula VIII presenta un ión de 277 m/z [M+H]+.
El análisis del cultivo de la cepa CLM-M2 al que se le añadió ácido 4-metilpiridina-2-carboxílico, por UPLC mostró dos picos con absorbancia característica de colismicina pero con movilidades 3, 16 min y 3, 51 min que corresponde con el compuesto de fórmula IX y fórmula X. El análisis posterior por HPLC/MS determinó que los compuestos de fórmula IX y fórmula X presentan un ión de 276 m/z [M+H]+ y 258 m/z [M+H]+ respectivamente (FIG. 13) .
Ejemplo 9. Generación de nuevos derivados de colismicina mediante acilación enzimática catalizada por una lipasa.
Las acilaciones enzimáticas de colismicina A y colismicina C catalizadas por PS-C se llevaron a cabo incubando a 45 ºC y 250 rpm una suspensión de 20 mg de lipasa en una disolución de 5 mg de colismicina A o colismicina C en 2 ml de éter metil tertbutílico y 1 ml del agente acilante correspondiente. La conversión de la biotransformación fue monitoreada mediante HPLC, empleando un equipo cromatográfico Agilent Technologies 1200 Series, usando como solventes acetonitrilo y agua (sin TFA) y una columna de fase reversa (Zorbax Eclipse XDB-C18, RR, 1.8 m, 4.6 x 50 mm, Agilent) . Las muestras fueron eluídas empleando un método de tres gradientes lineales, el primero del 10% al 60% de acetonitrilo a lo largo de 5.7 minutos, a continuación otro gradiente del 60% al 100% de acetonitrilo durante 0.4 minutos, a continuación 0.55 minutos en isocrático a 100% de acetonitrilo y un gradiente final del 100% al 10% de acetonitrilo durante 0.35 minutos, a un flujo de 2 ml/min. La longitud de onda a la que se obtuvieron los cromatogramas fue de 332 nm. En este método la colismicina A y la colismicina C presentan una movilidad de 2.29 y 1.90 min respectivamente. Cuando la conversión alcanzó un valor próximo al 90%, el enzima se filtró a vacío en placa filtrante y se lavó con abundante éter metil tertbutílico y metanol. Para el caso de la Colismicina C, el filtrado se concentró a vacío y el residuo resultante, previamente disuelto en 1 ml de metanol, fue cromatografiado en una columna XBridge Prep C18 (30x150 mm, Waters) , utilizando como fase móvil mezclas de acetonitrilo y agua a un flujo de 20 ml/min. Los picos de interés se diluyeron cuatro veces con agua y posteriormente se concentraron mediante extracción en fase sólida. Para el caso de la Colismicina A, el filtrado se concentró a vacío y el residuo resultante se purificó mediante cromatografía de columna empleando mezclas de hexano:acetato de etilo. Por último, los compuestos obtenidos fueron liofilizados para su conservación. Los nuevos derivados acilados se identificaron inicialmente mediante análisis por HPLC, comparando el espectro de absorción y el tiempo de retención. A continuación, se caracterizaron mediante el análisis de MS y RMN de acuerdo con los ejemplos anteriores.
- Para el caso particular de emplear colismicina C y acetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de 6 horas y se alcanzó una conversión de 95%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto con tiempo de retención de
4.51 minutos el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y agua (50:50) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado, el análisis posterior por RMN confirmó la estructura del compuesto de acuerdo a la fórmula XI.
- Para el caso particular de emplear colismicina C y butanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de 10 horas y se alcanzó una conversión de 95%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto con tiempo de retención de 5.56 minutos el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y agua (55:45) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado, el análisis posterior por RMN confirmó la estructura del compuesto de acuerdo a la fórmula
XII.
- Para el caso particular de emplear colismicina C y benzoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de 14 horas y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto con tiempo de retención de 6.22 minutos el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y agua (60:40) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado, el análisis posterior por RMN confirmó la estructura del compuesto de acuerdo a la fórmula
XIII.
- Para el caso particular de emplear colismicina A y acetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de 5 horas y se alcanzó una conversión de 95%. Por HPLC se identificó un nuevo pico con absorbancia característica de colismicina y con movilidad de 2.72 minutos que corresponde con el compuesto de fórmula XIV. El análisis posterior por HPLC/MS determinó que el compuesto de fórmula XIV presenta un ión de 318 m/z [M+H]+.
- Para el caso particular de emplear colismicina A y cloroacetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de 12 horas y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un nuevo pico con absorbancia característica de colismicina y con movilidad de 2.60 minutos que corresponde con el compuesto de fórmula XV. El análisis posterior por HPLC/MS determinó que el compuesto de fórmula XV presenta un ión de 352 m/z [M+H]+.
- Para el caso particular de emplear colismicina A y butanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de 9 horas y se alcanzó una conversión de 95%. Por HPLC se identificó un nuevo pico con absorbancia característica de colismicina y con movilidad de 3.66 minutos que corresponde con el compuesto de fórmula XVI. El análisis posterior por HPLC/MS determinó que el compuesto de fórmula XVI presenta un ión de 346 m/z [M+H]+.
Datos de espectros de RMN del compuesto de fórmula II: 1H RMN (DMSO-d6, 600 MHz) : 2.35 (s) , 4.75 (s) , 6.30 (sa) , 7.10 (s) , 7.55 (sa) , 8.00 (sa) , 8.25 (sa) , 8.80 (sa) , 11.10 (sa) 13C RMN (DMSO-d6, 150 MHz) : 15.9, 59.1, 112.1, 117.9, 121.2, 125.8, 138.7, 142.2, 148.5, 149.7, 152.0, 177.2
Datos de espectros de RMN del compuesto de fórmula III: 1H RMN (acetona-d6, 600 MHz) : 2.48 (s) , 4.00 (s) , 7.68 (dd, J = 7.6, 4.4 Hz) , 7.89 (s) , 8.16 (dt, J = 7.6, 1.6 Hz) , 8.29 (d, J = 7.6 Hz) , 8.82 (d, J = 4.4 Hz) , 8.86 (s) , 10.80 (s) 13C RMN (acetona-d6, 150 MHz) : 16.0, 110.0, 121.3, 122.9, 126.1, 138.6, 143.7, 145.9, 147.3, 149.5, 150.2, 174.1
Datos de espectros de RMN del compuesto de fórmula IV: 1H RMN (acetona-d6, 600 MHz) : 2.57 (s) , 3.50 (s) , 7.50 (dd, J = 7.6, 4.4 Hz) , 7.99 (dt, J = 7.6, 1.6 Hz) , 8.26 (s) , 8.41 (d, J = 7.6 Hz) , 8.70 (d, J = 4.4 Hz) 13C RMN (acetona-d6, 150 MHz) : 16.9, 110.2, 116.3, 121.0, 124.9, 125.3, 137.5, 137.8, 149.3, 153.6, 157.7, 166.3
Datos de espectros de RMN del compuesto de fórmula V: 1H RMN (DMSO-d6, 600 MHz) : 2.36 (s) , 7.47 (dd, J = 7.8, 4.2 Hz) , 7.94 (t, J = 7.8 Hz) , 7.96 (s) , 8.29 (d, J = 7.8 Hz) ,
8.68 (d, J = 4.2 Hz) , 11.7 (sa) 13C RMN (DMSO-d6, 150 MHz) : 17.7, 108.4, 116.1, 121.2, 125.1, 137.9, 149.8, 154.5, 156.0, 157.6, 166.7, 168.4
Datos de espectros de RMN del compuesto de fórmula VI: 1H RMN (acetona-d6, 600 MHz) : 2.43 (s) , 2.67 (s) , 4.19 (s) , 7.45 (d, J = 7.8 Hz) , 7.96 (t, J = 7.8 Hz) , 8.41 (d, J =7.8 Hz) , 8.18 (s) , 8.88 (s) , 10.70 (s) 13C RMN (acetona-d6, 150 MHz) : 17.2, 23.0, 56.2, 103.3, 118.8, 122.5, 124.7, 138.5, 146.7, 152.3, 153.0, 155.1, 157.8, 168.1
Datos de espectros de RMN del compuesto de fórmula VII: 1H RMN (DMSO-d6, 600 MHz) : 2.36 (s) , 2.47 (s) , 4.08 (s) , 7.45 (d, J = 4.8 Hz) , 8.03 (s) , 8.32 (s) , 8.61 (d, J = 4.8 Hz) ,
8.73 (s) , 10.70 (s) 13C RMN (DMSO-d6, 150 MHz) : 17.3, 20.4, 56.1, 103.9, 121.9, 122.4, 126.2, 147.2, 148.6, 150.0, 153.0, 153.8, 155.4, 167.4
Datos de espectros de RMN del compuesto de fórmula VIII: 1H RMN (acetona-d6, 600 MHz) :2.39 (s) , 2.49 (s) , 4.59 (s) , 4.86 (s) , 7.30 (d, J = 4.8 Hz) , 8.12 (s) , 8.48 (s) , 8.56 (d, J = 4.8 Hz) 13C RMN (acetona-d6, 150 MHz) : 16.5, 20.2, 62.3, 102.6, 117.9, 121.6, 125.1, 148.2, 149.0, 154.8, 155.7, 160.8,
167.2
Datos de espectros de RMN del compuesto de fórmula XI: 1H RMN (DMSO-d6, 600 MHz) : 2.14 (s) , 2.35 (s) , 4.06 (s) , 5.40 (s) , 7.49 (dd, J = 7.3, 4.6 Hz) , 7.98 (dt, J = 7.3, 1.8 Hz) , 8.02 (s) , 8.35 (d, J = 7.3 Hz) , 8.71 (dd, J = 4.6, 1.8 Hz)
13C RMN (DMSO-d6, 150 MHz) : 17.7, 21.1, 56.8, 65.8, 103.3, 120.3, 121.1, 125.1, 137.9, 149.7, 154.9, 156.1, 157.5, 167.3, 170.6
Datos de espectros de RMN del compuesto de fórmula XII: 1H RMN (DMSO-d6, 600 MHz) : 0.91 (t, J = 7.2 Hz) , 1.60 (sext, J = 7.2 Hz) , 2.35 (s) , 2.40 (t, J = 7.2 Hz) , 4.06 (s) , 5.41
(s) , 7.48 (dd, J = 7.8, 4.5 Hz) , 7.97 (dt, J = 7.8, 1.8 Hz) , 8.01 (s) , 8.35 (d, J = 7.8 Hz) , 8.71 (dd, J = 4.5, 1.8 Hz) 13C RMN (DMSO-d6, 150 MHz) : 14.0, 17.7, 18.5, 35.8, 56.8, 65.8, 103.3, 120.4, 121.1, 125.1, 137.8, 149.7, 154.9, 156.1, 157.6, 167.2, 172.9
Datos de espectros de RMN del compuesto de fórmula XIII:20 1H RMN (DMSO-d6, 600 MHz) : 2.38 (s) , 4.08 (s) , 5.68 (s) , 7.44 (dd, J = 7.8, 4.4 Hz, 7.57 (t, J = 7.2 Hz) , 7.70 (t, J =
7.2 Hz) , 7.80 (dt, J = 7.8, 1, 2 Hz) , 8.03 (d solapado, J = 7.2 Hz) , 8.02 (s) , 8.18 (d, J = 7.8 Hz) , 8.69 (dd, J = 4.4, 1.2 Hz) 13C RMN (DMSO-d6, 150 MHz) : 17.6, 56.8, 66.6, 103.4, 120.4, 121.0, 125.1, 129.3, 129.7, 130.2, 133.9, 137.7, 149.7, 154.9, 156.0, 157.3, 166.1, 167.3
Ejemplo 10. Actividad antitumoral de los nuevos compuestos generados.
Para los ensayos de actividad antitumoral se utilizaron varias líneas celulares tumorales: A549 (pulmón) , HT29 (colon) , MDA-MB-231 (mama) y HCT116 (colon) , así como la línea control no tumoral de fibroblastos NIH373.
Las células se repartieron en placas de 96 pocillos a razón de 5.000 células/pocillo en 100 mL por pocillo de medio DMEM suplementado con 10% FBS y 2 mM glutamina. A continuación se preincubaron durante 24 h sin fármaco ensayo para que las células se adhirieran a la placa. Al día siguiente se añadieron las concentraciones adecuadas de los distintos compuestos diluidos en medio DMEM y siempre en un volumen de 10 mL. Como controles se añadió medio sin compuesto para cuantificar la viabilidad de la línea celular y SDS al 0.1% como control de 100% de muerte. Transcurridas 24 h de incubación en presencia de cada compuesto se añadieron a cada pocillo 10 mL del reactivo WST8 (Cell Counting Kit-8, Dojindo, Probior, Alemania) y se incubaron durante 2 h a 37ºC tras lo que se determinó la absorbancia a 450 nm en un lector ELISA (ELx800, BioTek) . La actividad de los distintos compuestos se muestra en la tabla 3.
Tabla 9: Actividad antitumoral (IC50) de los distintos compuestos frente a distintas líneas celulares.
Línea celular NIH 373 A549 HT29 MDA-MB-231 HCT116
Compuesto Fibroblastos Pulmón Colon Pecho Colon
Colismicina A >100 µM 5 µM >100 µM >100 µM 0, 6µM
fórmula VI >100 µM 100 µM >100 µM >100 µM 1µM
fórmula VII >100 µM 2, 5 µM >100 µM >100 µM 0.7µM
fórmula II N/D 90 µM 100 µM 100 µM >100 µM
fórmula XI N/D >100 µM 100 µM >100 µM >100 µM
Algunos compuestos ensayados frente a determinadas líneas celulares mostraron valores de IC50 de orden micromolar,
como es el caso de los compuestos de fórmula VI y de fórmula VII frente a HCT116. Sin embargo, algunos compuestos presentaron valores menos elevados de citotoxicidad, de un orden superior a 100 micromolar frente a determinadas líneas celulares.
Ejemplo 11. Actividad neuroprotectora de los nuevos compuestos generados.
Los ensayos de actividad neuroprotectora se llevaron a cabo utilizando el modelo del pez cebra. El manejo de los embriones, su mantenimiento y cría se realizó siguiendo procedimientos estandarizados (Westerfield, 1993; Kimmel et al., 1995) . Una vez recolectados fueron mantenidos en agua de embriones (135 µM CaCl2 , 623 µM MgSO4, 1.14mM NaHCO3, 402.41 µM KCl, 10.7 mM NaCl, 348.5 µM CaSO4.2H2O, Scharlau Chemie, SA, 08016 Barcelona, Spain) .
Los embriones fueron tratados tras 3 días postfertilización durante 24 horas con 10 μM ácido retinoico (CAS #302-79-4, Sigma–Aldrich) (Selderslaghs et al, 2009) en presencia de cada uno de los compuestos neuroprotectores a ensayar y utilizando como control positivo ácido α-lipoico (CAS 1077-28-7, Sigma-Aldrich) a 1 μM. Dimetil sulfóxido (DMSO; 1%) fue incorporado a los ensayos al ser el solvente en el que iban disueltos los compuestos a ensayar. El ácido retinoico y los compuestos potencialmente neuroprotectores fueron añadidos al agua de embriones descrito anteriormente, utilizando 15 embriones de pez zebra. Al final del tratamiento embriones de 4 días postfertilización fueron lavados tres veces con agua y sumergidos en una solución de 2 μg/ml de cloruro de acridinio (Sigma-Aldrich) durante 60 min. A continuación se lavaron abundantemente tres veces (5 min por lavado) y se anestesiaron con anestésico MS222 (metanosulfonato de tricaina) Finalmente se posicionaron adecuadamente para su observación por microscopía de fluorescencia. Esta se llevó a cabo utilizando un microscopio de fluorescencia Leica DMIL LED (Leica Microsistemas, S.A., Barcelona) , equipado con un filtro verde FITC (excitación: 488 nm, emisión: 515 nm) , y una cámara digital EC3 (Leica Microsistemas, S.A., Barcelona) . Las imágenes fueron procesadas con LAS EZ V1.6.0 (Leica Microsistemas, S.A., Barcelona) y Adobe Photoshop 7.0 software (Adobe, San Jose, CA) . El análisis de partículas (Wasabi, Hamamatsu Photonics Germany GmbH) fue usado para cuantificar la fluorescencia. Para comparar la eficacia entre los distintos compuestos se utilizó el análisis de la varianza (ANOVA) para detectar si había diferencias significativas entre compuestos en los experimentos. El t-test de Dunnett fue usado para identificar compuestos que exhibían diferencias significativas en comparación al control (n=3) . Todos los cálculos fueron hechos usando el software estadístico GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) . Un P-value menor de 0, 05 fue considerado estadísticamente significativo.
Los neuroprotectores fueron ensayados a la concentración NOEC (Non-observed effect concentration) . Esta NOEC, tras un estudio previo, fue determinada como 1 μM para todos los compuestos ensayados. El control, sin tratamiento con ácido retinoico mostró pocas o ninguna célula apoptótica (FIG. 14A) . Por el contrario, los embriones tratados con ácido retinoico mostraron un aumento significativo en las apoptosis cerebrales (FIG. 14B) . Las imágenes que se muestran en las FIG 14C, D y E) son ejemplos del co-tratamiento con ácido retinoico y cada uno de los compuestos ensayados, incluyendo ácido lipoico como control positivo (Packer et al., 1997. Free Radic Biol Med.;22 (1-2) :359-78.) (FIG. 20F) y usando la concentración NOEC. Los compuestos de fórmula VI y VII mostraron protección frente al ácido retinoico, siendo claramente significativo el efecto del compuesto de fórmula VII (FIG. 14E) .
Microorganismos depositados.
Los siguientes microorganismos fueron depositados en las fechas abajo indicadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , cumpliendo con el Tratado de Budapest:
Microorganismo Número de Identificación Fecha de depósito
Streptomyces spp. CS40 7757 18.06.2010
Streptomyces spp. CLM-L 7754 18.06.2010
Streptomyces spp. CLM-A 7755 18.06.2010
Streptomyces spp. CLM-M2 7756 18.06.2010
Streptomyces spp. CLM-G 7861 16.12.2010
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