Obtención de un extracto proteico mediante hidrólisis enzimática a partir de hojas
de tabaco y su aplicación como fertilizante
5 Objeto de la invención
El objeto de esta invención es la obtención de un concentrado proteico a partir de
hojas de tabaco (frescas y/o secas) no aprovechables para la fabricación de dicho
tabaco mediante el proceso de hidrólisis enzimática lo que origina concentrados
con un alto contenido proteico (80%) . La mayoría de estos hidrolizados están
1O formados por péptidos, oligopéptidos y aminoácidos libres con alta solubilidad.
Esto hace que estos compuestos proteicos se absorban por la planta a una mayor
velocidad de manera más eficiente y, sobre todo, son una buena fuente de
aminoácidos esenciales, muy importante para la nutrición de las plantas.
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Estado de la técnica
El tabaco, es a día de hoy uno de los principales cultivos a nivel mundial
cuyo fin no es alimenticio. En España se cultiva tabaco en 7 comunidades
autónomas: Extremadura, Andalucía, Canarias, Castilla y León, Castilla la
20 Mancha, Navarra y País Vasco. Extremadura es la región autonómica donde se
concentra el 85% de la producción española, seguida de Andalucía.
España es el tercer país de Europa con 40991 T de cosecha en 2005 y un
valor de producción de 144, 5 millones de euros en 2003 (ASTRA) , dando empleo
a más de 20000 familias.
25 La elaboración del tabaco, se hace en base a un proceso que consta de
varias etapas, y que tiene por objeto producir en las hojas una serie de
transformaciones químicas que las hacen más aptas y aceptables para el uso. Sin
embargo, no todas las hojas de la planta del tabaco tienen la misma composición
química, y por ello, en el cultivo del tabaco, no todas las hojas son aprovechadas
30 para la fabricación de tabaco.
Generalmente, las 2-3 hojas que se desarrollan en la parte más baja del
tallo suelen quedar deterioradas por el contacto con las aguas de riego y con el
suelo. Son hojas con menor contenido en nicotina, aroma, etc., y por tanto, resulta
conveniente suprimirlas en la primera parte del ciclo vegetativo que sigue al
35 transplante.
Por otro lado, en la fase de despunte se suelen suprimir varias hojas que salen justo debajo de la inflorescencia. Este despunte influye notablemente en la composición física y química del tabaco curado. Con el despunte, al reducir el número de hojas a recolectar, los nutrientes se acumularán en las hojas que quedan.
Del mismo modo, en la fase de despalillo y clasificación se manipulan las hojas seleccionadas para la fabricación de tabaco. Normalmente, a estas hojas se les retira la parte más gruesa del nervio, dos tercios en el caso de las hojas destinadas a tripa, y tres cuartas partes en el caso de los capotes.
Como consecuencia de todo esto, el cultivo de tabaco también origina un material vegetal no aprovechable para el proceso de elaboración de tabaco y que podría ser usado con otros fines, como por ejemplo, la obtención de biofertilizantes o bioestimulantes.
En los últimos años, ha ido aumentando el consumo de proteínas vegetales a causa de una mayor utilización de productos proteicos de buena calidad, ya sean en forma de concentrados o de aislados proteicos. Sin embargo, el uso de estos productos se ve limitado por su baja solubilidad o por sus caracteres potencialmente alergénicos. Estas dos razones han conducido al estudio de procesos de hidrólisis enzimática para obtener nuevos productos proteicos con características nutricionales y funcionales definidas, minimizando o eliminando los inconvenientes.
Estos nuevos productos, denominados biofertilizantes o bioestimulantes están constituidos generalmente péptidos, aminoácidos, polisacáridos, ácidos húmicos, fitohormonas, etc que son absorbidos directamente por la planta, gastando la misma una menor cantidad de energía para dicho proceso de absorción, lo cual repercute positivamente no solo en su crecimiento sino también en la calidad y producción del fruto o grano recolectado. El objetivo de estos productos no es suministrar la nutrición, sino más bien para favorecer y estimular el metabolismo de la planta, reducción de estrés, etc (Parra do et al., 1991, 2008) . Por esta razón, el desarrollo de nuevos biofertilizantes/bioestimulantes, utilizando materiales naturales, se ha convertido en el foco de interés en la investigación.
Una gran parte de estos nuevos biofertilizantes/bioestimulantes se han procesado a partir de métodos bioquímicos, generalmente por medio de hidrólisis enzimática. La hidrólisis enzimática se ha monitorizado mediante la técnica del pH-stat, utilizado un biorreactor con control de pH, temperatura y agitación y medida del consumo de NaOH. El parámetro usado para controlar la reacción hidrólítica es el grado de hidrólisis (GH) , el cual se define como el porcentaje de uniones peptídicas rotas (Adler Nissen, 1977) . El fundamento de la técnica del pH-stat radica en que bajo condiciones de hidrólisis neutra o alcalina la disociación del grupo amino resulta significativa y el continuo consumo de base necesario para mantener el pH constante durante la reacción es un medio de controlar la magnitud del proceso hidrolítico. Así pues, el grado de hidrólisis se define como la relación entre el número de uniones peptídicas rotas y el número total de uniones peptídicas.
En este sentido, cabe a destacar una gran cantidad de trabajos cientificos así como de patentes realizadas sobre distintos productos vegetales (algarroba, trigo, maiz, girasol, arroz, etc.) utilizando la hidrólisis enzimatica, obteniendo productos caracterizados principalmente por su alto contenido en péptidos de bajo peso molecular y aminoácidos libres y que tienen una importante repercusión en el mundo agrícola debido a una mejora en la nutrición de la planta, afectando positivamente no solo a su crecimiento sino también a la producción del grano o fruto obtenido (Bautista, 1999; Bautista et al., 1996; Garcia-Martínez et al., 2007, 2008; Parrado et al., 2006, 2007a, 2007b; Pedroche et al., 2000; Romero et al., 2007; Villa nueva et al., 1999) . Del mismo modo, existe una gran cantidad de patentes que tratan sobre la obtención de productos solubles utilizables en la agricultura y que se han elaborado mediante procesos de hidrólisis (ver referencias) . Sin embargo, no hay patentes ni estudios de elaboración de biofertilizantes a partir de hojas de tabaco (frescas y/o secas) utilizando procesos enzimáticos directos. Se han encontrado patentado, procesos relacionados con tabaco y su conversión en fertilizantes compuestos por de polipéptidos y su uso como producto agroquímico (PCT/EP2007/002075) , en este caso el proceso es muy diferente y más complejo que el se describe en esta patente, ya que utiliza substratos y procesos diferentes, en concreto los substratos son células BY2 de tabaco y procesos de fermentación con microorganismos, separación de la células del medio de fermentación, homogeneización, precipitación de las paredes celulares seguido de lavados para eliminar componentes citoplásmicos, hervido de las paredes celulares en disolución acida para separar los azucares unidos a las proteínas, digestión de las proteínas de las paredes en medio acido o enzimático ( usando enzimas proteolíticas) , y finalmente, una separación de los péptidos y aminoácidos.
5 La hidrólisis enzimática es pues el procedimiento óptimo para conseguir la extracción de las proteínas a partir de las plantas de tabaco y su conversión en hidrolizados proteicos, principalmente debido a que es un proceso biológico donde la calidad del producto final permanece inalterada.
1 O Una alternativa para el proceso de extracción sería una hidrólisis química, en la cual se hidrolizan/extraen las proteínas llevando a ebullición con ácido clorhídrico fuerte, seguido de enfriamiento y neutralización del hidrolizado con carbonato sódico o hidróxido sódico y separación del material sólido no hidrolizado. Las concentraciones de ácido utilizadas son altas por ejemplo: Acido Clorhídrico 35% , en la hidrólisis de proteína de maíz (ES 2 034 593) , Sulfúrico 3 Molar (EP2128114A2) .
15 Estudios realizados han demostrado que los hidrolizados de proteína preparados con ácido clorhídrico contienen una cantidad de compuestos indeseables cono dicloropropanoles (DCPs) , especialmente 1, 3 dicloropropan-2-ol y monocloropropanodioles MCPs) y ha surgido el problema de su eliminación o más bien de la prevención de su formación.
20 25 La hidrólisis enzimática es un proceso muy eficiente, que se lleva a cabo en condiciones suaves de temperatura, pH y presión, con lo que la calidad nutricional de los aminoácidos no resulta alterada, ya que de esta manera, no tiene lugar la destrucción o modificación de ciertos restos aminoacídicos, como sí ocurre con la hidrólisis química. Efectivamente para la extracción de proteínas es una técnica ampliamente utilizada, debido a su eficiencia y nulo impacto ambiental, pero no ha sido descrita en el substrato descrito en la invención, esto es, plantas de tabaco con un pretratamiento físico.
Descripción de las figuras
30 Figura 1. Esquema del proceso de obtención de extractos proteicos Figura 2. Aspecto de la harina de hojas de tabaco Figura 3. Solubilidad de las HHT a distintos valores de pH 35 Figura 4. Aspecto de los extractos proteicos obtenidos. A. Concentrado (50 materia seca)
B. Atomizado en forma de polvo.
Figura 5. Cromatografía de exclusión molecular, en columna Superdex 200HR
10/30 y distribución de los pesos moleculares de los concentrados proteicos. (A)
BB-163, (B) H-20, (C) GR, (D) BB-
Figura 6. Solubilidad de los extractos proteicos obtenidos en el proceso de hidrólisis enzimática Descripción de la invención La Figura 1 muestra esquemáticamente el proceso de hidrólisis enzimática propuesto para obtener concentrados proteicos a partir de hojas de tabaco.
Las hojas de tabaco seleccionadas correspondieron a las variedades (BB-163, B-194., H-20 y G-20) . Son hojas frescas y secas que se eliminaron de la planta durante la fase de despunte y que se situaban justo debajo de la inflorescencia. Las hojas de tabaco se secan en estufa a 50 o C y se trituran posteriormente obteniendo así la harina de hojas de tabaco (HHT) . La Tabla 1
muestra la composición química de HHT y la Figura 2 muestra una fotografía del aspecto de esta HHT. La solubilidad de dichas HHT no es alta en ningún caso (Figura 3) . Sólo a pH muy alcalino logramos que la solubilidad sea algo significativa, pero en ningún caso superior al 31%. Esta baja solubilidad se debe en parte al calor aplicado en el proceso de secado para la obtención de la HHT,
aumentando así su indegradabilidad.
HHT
BB-163 H-20 GR BB-194 Humedad (g kg-1, w/w) 72 ± 10 79 ± 9 84 ± 13 80 ± 11 Proteínas (g kg-1, w/w) 239 ± 21 245 ± 26 258 ± 22 250 ± 23 Lípidos (g kg-1, w/w) 25 ± 7 21 ± 5 19 ± 6 23 ± 6
k -1
Carbohidratos (g 604 ± 36 639 ± 48 680 ± 41 666 ± 42
g ' Cenizas (g kg-1, w/w) 95 ± 14 93 ± 11 103 ± 16 98 ± 12 lle (*) 4, 1 ± 0, 9 3, 7±1, 1 5, 1±1, 3 4, 1±1, 0 Leu (*) 12, 3±1, 2 7, 2 ± 1, 9 9, 1 ± 2, 1 8, 3 ± 1, 6 Lys (*) 2, 5 ± 0, 5 2, 7 ± 0, 8 3, 3 ± 1, 0 2, 3 ± 0, 7 Met (*) 1, 8 ± 0, 4 1, 7 ± 0, 4 0, 4 ± 0, 1 1, 7 ± 0, 2
Phe (*) 3, 6 ± 1, 0 5, 2 ± 1 '1 5, 7±1, 1 3, 1 ± 0, 6
Thr (*) 3, 6 ± 0, 8 2, 9 ± 0, 7 5, 0 ± 1, 3 3, 5 ± 0, 8
Trp (*) 0, 8±0, 1 0, 8 ± 0, 1 0, 3 ±O, 1 0, 8±0, 1
Tyr (*) 3, 4 ± 0, 9 4, 1 ± 1 '1 2, 8 ± 0, 9 1, 7 ± 0, 5
Val (*) 5, 5± 1, 4 4, 3 ± 1 '1 7, 5 ± 1, 9 5, 2 ± 1, 4
Tabla 1. Composición química y aminoacídica (media ± desviación standard) de
las HHT. Los resultados son la media de tres repeticiones.
(*) Resultados expresados como gramos por cada 100 g de proteína
5
Una variante es la utilización de la hoja de tabaco, principalmente hojas frescas,
procedentes de descartes en la recogida del material, sin secado, se procede a su
homogenización en el agua de la hoja, la pasta resultante tendrá un 35-40% de
materia seca, con lo cual se ahorra agua, energía y tiempo.
1 O Otra variante es la utilización de hoja de tabaco procedente de descartes del
proceso de secado/fermentación industrial.
Los productos serán sometidos a un tratamiento físico de autoclavado, el
cual aumenta la susceptibilidad de extracción proteica por parte de las proteasas.
El proceso se realiza a una presión interna al menos de 103 kPa, lo cual
15 provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centígrados. Siendo
el tiempo del proceso entre 15-20 minutos.
A continuación comienza el proceso de hidrólisis enzimático (tabla 3) , dicha
hidrólisis enzimática se lleva a cabo en un bioreactor con control de pH,
temperatura y agitación, como solvente agua de la red y como medio activo
20 enzimas proteolíticas, preferentemente Subtilisina. A una concentración de
substrato entre 15-20% peso /volumen y una concentración de proteasas entre
0.1-0.3% peso/volumen de reacción, a partir de una solución stock de proteasa
70.000 Unidades de actividad/Ensayo de azocaseína) ) .
BB-163 H-20 GR BB-194 Humedad (g kg-1, w/w) 78 ± 6 72 ± 8 79 ± 6 76 ± 5 Proteínas (g kg-1, w/w) 801 ± 36 815 ± 42 791 ± 31 822 ± 40 Lípidos (g kg-1, w/w) 9 ± 1.1 9 ± 1.0 8 ± 0.9 9 ± 1.2
k -1
Carbohidratos (g g ' 63 ± 11 68 ± 9 80 ± 13 74 ± 12 Cenizas (g kg-1, w/w) 52± 10 40 ± 7 45 ± 9 52± 12 Arg (*) 2.7 ± 0.5 2.8 ± 0.4 2.9 ± 0.4 2.8 ± 0.6
Tyr (*) 3.8 ± 0.9 4.1 ± 0.9 2.9 ± 0.5 2.9 ± 0.6 Ala (*) 5.6±1.1 5.5 ± 1.0 6.1 ± 0.9 5.9 ± 1.0 Asp (*) 5.9 ± 1.5 5.7 ± 1.1 6.0± 1.3 6.9± 1.4 Cis (*) 0.9 ± 0.1 0.9±0.1 0.9 ± 0.1 0.7 ± 0.1 Glu (*) 20.1 ± 1.2 22.4 ± 1.5 22.3 ± 2.0 21.0 ± 1.8 Gly (*) 4.0±1.2 3.1 ± 0.7 3.9 ± 0.8 4.2 ± 1.1 Pro (*) 8.5± 1.6 8.8± 1.4 8.3 ± 1.7 8.0 ± 1.9 Ser (*) 4.5 ± 1.0 4.8 ± 1.2 4.9±1.1 4.8± 1.4 Trp (*) 0.5 ± 0.1 0.6±0.1 0.5 ± 0.1 0.5 ± 0.1 His (*) 1.8 ± 0.5 1.9 ± 0.4 2.0 ± 0.7 2.9 ± 0.5 lle (*) 3.8 ± 0.9 4.1 ± 0.8 4.0 ± 1.0 5.6 ± 1.2 Leu (*) 7.8±1.1 7.5±1.0 7.8±1.3 7.4±1.6 Val (*) 4.1±1.0 4.4 ± 0.8 4.5 ± 1.3 3.8 ± 0.9 Lys (*) 2.8 ± 0.8 2.7 ± 0.6 3.0 ± 0.4 2.1 ± 0.7 Met (*) 1.1 ±0.3 2.0 ± 0.8 1.0 ± 0.2 3.0 ± 0.6
Tabla 3. Composición química y aminoacídica (media ± desviación standard) de
los extractos proteicos obtenidos en el proceso de hidrólisis enzimática. Los datos
son la media de tres repeticiones.
5 (*) Resultados expresados como gramos por cada 100 g de proteína
En primer lugar es muy importante, previo al proceso de hidrólisis, la
homogeneización y solubilización de los sustratos. El desarrollo de la reacción
enzimática se realiza un pH=8-9, 5 y P=50-60°C, lo que supone las condiciones
1O óptimas de máxima actividad de las enzimas empleadas. La temperatura se regula
con baño termostatizado y el pH con NaOH 6N para no incrementar en exceso el
volumen de reacción. La etapa de disolución del sustrato dura hasta que el pH se
equilibra (estabiliza) ; después de esta etapa empieza la hidrólisis con la adición de
la enzima, el pH bajará a liberarse los restos amino terminales, por lo que se
15 requiere la adición de NaOH para seguir manteniendo el pH óptimo de actuación
de la enzima.
La principal diferencia entre los componentes proteicos de las HHT y sus
correspondientes hidrolizados es el tamaño molecular de estos componentes. En
el caso de los hidrolizados son fundamentalmente péptidos, oligopéptidos y
20 aminoácidos libres (Figura 5) , mientras que la mayoría de los componentes de las
HHT son proteínas de alto peso molecular. Al cambiar el tamaño molecular, aumenta drásticamente la solubilidad (Figura
6) , aumentando así su absorción por la planta. Además, estos hidrolizados
5 proteicos debido a su relativamente alto grado de hidrólisis (gt;15%) , pueden considerarse un producto potencialmente hipoalergénico para alimentación animal y como una buena fuente de nitrógeno orgánico para las plantas en caso de utilizarse como biofertilizante/bioestimulante, bien a través de la raíz o foliarmente.
Modo de realización de la invención
EJEMPLO:
1 O 15 A continuación se muestra un ejemplo de obtención de un extracto proteico a partir de hoja de tabaco, se ha procedido a utilizar la harina de hojas de tabaco (HHT) . Una vez establecidas las condiciones óptimas del proceso hidrolítico, se ha elegido para la obtención de un extracto proteico los: temperatura 60°C, pH 8 y concentración de sustrato (15% p/v) y Subtilisina (0.2% peso/volumen, solución stock de proteasa 70.000 Unidades de actividad/Ensayo de azocaseína) este proceso se mantiene 120 minutos, alcanzándose un grado de hidrólisis final superior, en todos los casos, al 15%. El procesamiento del medio de hidrólisis continúa con diferentes etapas: centrifugación, concentración (30-60% en Materia seca) y una etapa opcional de secado y conversión en polvo (atomización) . La Figura 4 muestra una fotografía del aspecto del extracto proteico que se obtiene.
20 25 30 Para determinar los efectos de este nuevo producto, se seleccionó el cultivo de tomate (Lycopersicon escu/entum cv. Momotaro) como cultivo indicador. Del mismo modo, se utilizó un extracto hidrolizado de algarroba para comparar los efectos de este biofertilizante/bioestimulante con el obtenido. El proceso de extracción y composición química del extracto enzimático de algarrobo se encuentran detallados en un trabajo anterior (Parrado et al., 2008) . Se seleccionaron semillas de tomate y se hicieron germinar en condiciones controladas de temperatura (20 °C) y humedad (60%) . Las plántulas fueron transferidas a contenedores que tenían una turba comercial como sustrato. El diseño experimental fue en bloques al azar, incluyendo 9 contenedores y 8 plántulas de tomate por contenedor. Se realizaron 3 tratamientos fertilizantes, realizándose 3 repeticiones por tratamiento. Los tratamientos fueron: (1) tratamiento AO: contenedores fertilizados con una solución NPK (0.6 g N r1 , o.o3 g P 1-1 , o.o9 g K r1)
(2) tratamiento A 1: contenedores fertilizados con un concentrado proteico de algarroba a una dosis de 1 cm3/500 ml-1 agua
(3) tratamiento A2: contenedores fertilizados con el nuevo concentrado proteico de hojas de tabaco a una dosis de 1 cm3/500 ml-1 agua
El tiempo experimental fue de 18 semanas, durante el cual se midió la altura de planta, se determinó el número de flores por planta, y el número de frutos por planta.
La tabla 4 muestra los parámetros analizados en el cultivo de tomate para los diferentes tratamientos. El análisis estadístico mostró diferencias significativas (p lt;0, 05) entre el tratamiento no orgánico (AO) y los dos tratamientos orgánicos (A1 y A2) , mostrando los valores más altos en los parámetros estudiados para los tratamientos A 1 y A2. Parrado et al (2008) encontró la eficacia de un extracto enzimático de algarrobo en un cultivo de tomate haciendo hincapié en la importancia de este bioestimulantes/biofertilizante en el crecimiento de tomate y de la calidad del fruto obtenido. Los resultados encontrados para los concentrados de proteína de tabaco en hoja son ligeramente superiores a los obtenidos para los concentrados de proteínas de algarroba. Por lo tanto, creemos que al igual que los concentrados de proteínas de algarroba, las hojas de tabaco de concentrados de proteínas puede ser utilizado como bioestimulantes 1 biofertilizante en la agricultura.
Tiempo Altura de planta (cm) Número de flores por planta Número de frutos por planta experimental (semanas)
Tratamiento Tratamiento Tratamiento Tratamiento Tratamiento Tratamiento Tratamiento Tratamiento Tratamiento AO A1 A2 AO A1 A2 AO A1 A2
8 Nd Nd Nd 1at 1a 1a
10 Nd Nd Nd 3ab± 1 4b ± 1 4b ± 1
12 Nd Nd Nd ?be± 1 7bc±2 Be± 2 1at 1a 1a
14 Nd Nd Nd 8c±2 14cd ± 2 15cd ± 2 1a 2b± 1 2b ± 1
16 Nd Nd Nd 9c± 2 31d ±4 33d ±4 2b± 1 4c± 1 4c ± 1
18 54.1at± 1.4 82.5b ± 2.1 84.6b ± 2.5 9c±2 33d ±5 34d ±4 3bc ± 1 15d ± 3 16d ±2 Tabla 4. Parámetros obtenidos (media ± desviación standard) en el cultivo de tomate. Los datos son la media de tres repeticiones Nd: no determinado tcolumnas (media ± desviación standard) seguidas de la misma letra no son significativamente diferentes (plt;0.05)
