MÉTODO PARA LA SELECCIÓN DE CÉLULAS NEURONALES EN FUNCIÓN DE SU DIFERENCIACIÓN MEDIANTE EXPOSICIÓN A FLUBENDIAMIDA
La presente invención se refiere a un método para la selección de células neuronales en función de su nivel de diferenciación.
La invención resulta de aplicación en aquellos sectores que precisen de la detección, identificación y cuantificación de la población de células neuronales en diferenciación para fines investigadores y/o terapéuticos, como por ejemplo en la 1 O investigación sobre el efecto de factores o sustancias del ámbito medioambiental, agroalimentario, químico, farmacéutico, etc., y en terapias antitumorales o neuro-regenerativas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Las células neuronales adultas representan el grado máximo de diferenciación celular. Durante el proceso de diferenciación, adquieren todas las propiedades que, oportunamente integradas, permiten el funcionamiento del sistema nervioso. El proceso de diferenciación neuronal es consecuentemente un momento crítico para el correcto funcionamiento del sistema nervioso y, particularmente en el ser humano,
para el desarrollo de sus facultades mentales. Fallos en la diferenciación neuronal durante el desarrollo embrionario humano conllevan importantes deficits cognitivos en la vida posnatal cuando ésta es posible, y fallos en la diferenciación neuronal de células madres del sistema nervioso central adulto pueden dar lugar a la formación de tumores particularmente agresivos e incapacitantes.
Existen múltiples técnicas para la selección de células en función de su grado de diferenciación. Cada técnica aprovecha metodologías diferentes (fisicas, biofisicas, químicas, farmacológicas, inmunológicas, etc.) asociadas con peculiares características génicas, bioquímicas, fisiológicas, que pueden satisfacer muchas necesidades experimentales. Sin embargo es laborioso y complejo aislar poblaciones de células neuronales durante su desarrollo in vitro ya que se necesitan aparatos específicos, tales como un quot;cell-sorterquot;, que no están siempre al alcance de todos los laboratorios, y esto obliga los investigadores de varios grupos a compartir los aparatos disponibles aumentando los problemas técnicos inherentes (limpieza, esterilidad, calibración, etc) y el tiempo necesario para conseguir la población neuronal deseada.
Además, esto se obtiene sólo en células neuronales que todavía no se hayan adherido a una superficie de cultivo y no hayan iniciado su desarrollo morfológico, bioquímico y fisiológico, de tal manera que no es posible aprovechar estos factores en la selección de las células neuronales .
O DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
A los efectos de la presente invención y su descripción, la flubendiamida es 3-iodo-N'- (2-mesil-1, 1-dimetiletil) -N-{ 4-[ 1 , 2, 2, 2-tetrafluoro-1- (trifluorometil) etil]-o-tolil} ftalimida.
El método objeto de la presente invención se basa en que la exposición a la flubendiamida de una población de células nerviosas con distinto grado de diferenciación, induce la muerte de las células neuronales menos diferenciadas. Con este método es posible: 1) determinar el número de células nerviosas que consigue una diferenciación más rápida en respuesta a distintos tratamientos físicos, químicos y farmacológicos; 2) obtener cultivos neuronales más homogéneos en sus propiedades fisiológicas; 3) reducir la variabilidad de la respuesta celular a la exposición a sustancias de interés fármaco-toxicológico; 4) seleccionar poblaciones neuronales resistentes a la flubendiamida para el estudio de los mecanismos de resistencia con el fin de aprovecharlos terapéuticamente.
La presente invención se refiere a un método para seleccionar células 25 neuronales en función de su grado de diferenciación que comprende los siguientes parámetros y etapas:
• Parámetros:
1) número de días del cultivo primario.
2) tiempo de exposición a flubendiamida.
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3) concentraciones de flubendiamida.
• Etapas:
a) Establecimiento de 5 grupos (A, B, C, D, E) de células neuronales, en su primer, 2°, 4°, 6° y 8° día en cultivo respectivamente, donde cada grupo debe constar de no menos de 2 placas del mismo cultivo (A', Aquot;;
B' Bquot;· C' Cquot;· D' Dquot;· E' Equot;)
' ' ' ' ' ' ' .
b) Establecimiento de una cinética toxicológica por exposición de grupos de células de la misma edad en cultivo a la misma concentración micromolar de flubendiamida que debe variar entre O, 1, 2, 5, 10 y 20 ¡..tM, durante 12h, 24h, 48h, 72h y 96h desde el momento de la adición de flubendiamida, de tal forma que, siguiendo el esquema indicado en la Tabla I como ejemplo para el grupo A, se obtienen los grupos: A, [0], 12, A, [0], 24, A, [0], 48, A, [0], 72, A, [0], 96; A, [1], 12, A, [1], 24, A, [1], 48, A, [1], 72, A, [1], 96 ... etc. hasta E, [20], 96, donde el número entre corchetes indica la concentración de flubendiamida.
e) Detección de los efectos citotóxicos inducidos por la flubendiamida en cada grupo de células y cuantificación de los niveles de viabilidad celular mediante el uso de protocolos o métodos efectivos para estos propósitos.
d) Identificación de la concentración de flubendiamida que produce el máximo efecto tóxico en relación a la edad de las células y al tiempo de exposición en cultivo, para su posterior utilización en la selección de poblaciones de células neuronales en cultivos destinados a la investigación.
e) Interrupción del tratamiento con flubendiamida en cultivos destinados a la investigación mediante lavado de las células previamente tratadas utilizando una solución fisiológica.
Tabla 1: Ejemplo, para el grupo A, de organización de grupos en función del tiempo de exposición a la flubendiamida y la concentración de la misma.
Grupo A Tiempo de exposición a la flubendiamida (h)
Concentración de flubendiamida (~M) 12 24 48 72 96
o A[0]12 A[0]24 A[0]48 A[0]72 A[0]96
1 A[1]12 A[1]24 A[1]48 A[1]72 A[1]96
2 A[2]12 A[2]24 A[2]48 A[2]72 A[2]96
5 A[5]12 A[5]24 A[5]48 A[5]72 A[5]96
10 A[10]12 A[10]24 A[10]48 A[10]72 A[10]96
20 A[20]12 A[20]24 A[20]48 A[20]72 A[20]96
5 En una realización preferida, las células neuronales son neuronas del sistema nervioso central en cultivo primario. En una realización más preferida, las neuronas del sistema nervioso central en cultivo primario son neuronas granulares de cerebelo de rata.
1 O 15 En una realización específica, la detección de los efectos citotóxicos y cuantificación de la viabilidad celular se realizan mediante la observación de los cultivos celulares con microscopía en contraste de fase. En una realización más específica. En una realización más específica, la detección de los efectos citotóxicos y cuantificación de la viabilidad celular se realizan utilizando colorantes vitales y microscopía de epifluorescencia. En una realización aún más específica, la detección de los efectos citotóxicos y la cuantificación de los niveles de viabilidad celular se realizan transcurridas 12h, 24h, 48h, 72h y 96h desde la adición de flubendiamida.
En otra realización específica, la progresión de los efectos del tratamiento con flubendiamida se interrumpe mediante lavado de las células con medio de cultivo. En una realización más específica, el lavado de las células se realiza utilizando medio de cultivo procedente de células no tratadas de la misma edad.
20 su La aplicación del presente método para la selección de neuronas en función de diferenciación requiere una inversión mínima ya que la mayor parte de los
laboratorios en la actualidad dispone de instalaciones para cultivos celulares dotadas de:
- Una campana de flujo laminar.
- Un incubador de C02.
5 -Un microscopio de contraste de fases con epifluorescencia.
1 O El procedimiento de la presente invención se sitúa entre las técnicas que se aprovechan del uso de compuestos químicos. Utiliza el compuesto flubendiamida que nunca ha sido utilizado para el fin que aquí se propone, y permite seleccionar poblaciones de células neuronales que hayan ya iniciado su desarrollo morfológico, bioquímico y fisiológico en un quot;networkquot; in vitro, tras adherirse a la superficie de la placa de cultivo; de suerte que el proceso de selección no altera el patrón de crecimiento y diferenciación general de las neuronas en cultivo.
15 Las ventajas de este método se encuentran en: 1) la obtención de una población neuronal seleccionada organizada en cultivo en un quot;networkquot;; 2) la especificidad celular de los efectos, que se detectan en células neuronales; 3) la especificidad cronológica de sus efectos, que se manifiestan particularmente durante el desarrollo neuronal; 4) la progresividad de sus efectos que pueden ser controlados suspendiendo el tratamiento, lo cual permite realizar la selección de una población de células que en su mayoría serán viables.
20 La invención resulta de aplicación en aquellos sectores vinculados a: 1) Tecnología bio-sanitaria que precise de la utilización de una población celular en la que se haya eliminado la presencia de células neuronales con un grado de diferenciación inferior.
25 2) Tecnología bio-sanitaria que precise de la utilización de una población celular en la que se haya eliminado la presencia de células neuronales en las que se asocie la toxicidad de flubendiamida con un grado de diferenciación inferior.
3) Control de calidad de la producción industrial de moléculas cuyos efectos farmaco-toxicológicos puedan determinarse en poblaciones celulares seleccionadas por grado de diferenciación. 30 4) Control de la presencia de contaminantes en alimentos y otros productos relacionados con la salud humana y animal en cuya determinación se utilicen
poblaciones celulares seleccionadas por su grado de diferenciación.
EXPLICACIÓN DE UNA FORMA DE REALIZACIÓN PREFERENTE
5 Para una mejor comprensión de la presente invención, se expone el siguiente ejemplo de realización preferente, descrito en detalle, que debe entenderse sin carácter limitativo del alcance de la invención.
1O La preparación de los cultivos de neuronas granulares de cerebelo de rata en cultivo primario se llevó a cabo mediante el procedimiento previamente establecido que se describe a continuación:
Se prepararon las siguientes soluciones:
Solución 1
15 NaCl 124 mM, KCl 5, 37 mM, NaH2P04 1 mM, D-glucosa 14, 5 mM, Hepes 25 mM, rojo fenol 27 J.!M, MgS04 1 , 2 mM, seroalbúmina bovina (BSA) 3 mg/mL. La solución se equilibró a pH 7, 4 con NaOH.
Solución JI
Solución I suplementada con 0, 25 mg/mL de tripsina.
Solución /JI
20 Solución I suplementada con 80 J..tg/mL de Desoxirribonucleasa I (DNAsa I) , 0, 52 mg/mL de inhibidor de tripsina y MgS04 elevado a 2, 8 mM.
Solución IV
Solución I suplementada con 25, 6 J..lg/mL de DNAsa I, 166, 4 J..tg/mL de inhibidor de tripsina y MgS04 elevado a 1, 7 mM.
Solución V
25 Solución I suplementada con O, 1 mM de CaCh y elevada a 2, 5 mM de MgS04. A continuación se extrajeron por disección 8-13 cerebelos procedentes de crías de rata de 8 días de edad y se depositaron en 2 mL de solución l. Con ayuda de unas pinzas, se eliminó la meninge que individualiza el cerebelo de otras partes del cerebro
y lo separa del hueso del cráneo. Los cerebelos se desmenuzaron mediante cortes
ortogonales con una cuchilla, y los pequeños fragmentos de tejido se resuspendieron
en 30 mL de solución I. Tras una centrifugación a baja velocidad, el tejido se
resuspendió en 30 mL de solución II y se incubó a 3 7 °C durante 1 O min con agitación
5 con el fin de producir la tripsinización del mismo. La reacción se detuvo añadiendo 15
mL de la solución IV. La suspensión se agitó ligeramente durante 1 minuto y después
se centrifugó. El precipitado obtenido se resuspendió en 2 mL de solución III.
El tejido se sometió entonces a una disgregación mecánica, disociando por
aspiración-expulsión con una pipeta Pasteur, y se añadieron 5 mL de solución V. La
1 O suspensión se agitó y se dejó reposar verticalmente durante 5-1 O min con el fin de
permitir la sedimentación de posibles grumos de células no disociadas. Las células en
suspensión se recogieron por centrifugación a baja velocidad durante 5 min y el
precipitado obtenido se resuspendió en medio de cultivo Basal Eagle's Medium
suplementado con 1 O % de suero fetal de ternera (inactivado por calor a 56 oc durante
15 30 min) , 100 J.tg/mL de gentamicina, 2 mM de glutamina y 25 mM de KCL
Los grumos de células no disociadas se sometieron a un nuevo tratamiento de
trituración con una pipeta Pasteur, y las células disociadas así obtenidas se añadieron a
las anteriores. Las células se sembraron a una densidad de 2, 5 x 105 células/cm2 sobre
placas Petri de plástico pretratadas con poli-L-lisina (5 J.tg/mL) . Los cultivos se
20 incubaron a 3 7 oc, en una atmósfera de C02 al 5 % y una humedad del 95 %.Tras este
proceso se obtuvieron 10-12 placas de cultivo de 35 mm de diámetro por cerebelo, y
la preparación se llevó a cabo en aproximadamente 3 h. La utilización de placas de
menor diámetro permitió aumentar considerablemente el rendimiento sin perjudicar la
sensibilidad del método.
25 Con objeto de impedir la replicación de las células no neuronales se añadió, al
cabo de 20-24 h, un agente citostático (arabinofuranósido de citosina, 10 J.!M) . Las
células pudieron mantenerse varias semanas en cultivo añadiendo periódicamente
glucosa (5, 6 mM) al medio de cultivo y reponiendo la pérdida de agua debida a la
evaporación. Después de ocho días en cultivo, más del 95 % de la población neuronal
30 pudo ser identificada morfológicamente como perteneciente al tipo de neurona granular, siendo el 5 % restante neuronas GABAérgicas fundamentalmente. La
proporción de astrocitos no superó el 3 %.
5 Se establece una cinética toxicológica por exposición de grupos de células de la misma edad en cultivo a la misma concentración micromolar de flubendiamida que debe variar entre O, 1, 2, 5, 10 y 20 J.!M, durante 12h, 24h, 48h, 72h y 96h desde el momento de la adición de flubendiamida, de tal forma que indicando con las letras A, B, C, D, E los grupos de células de distinta edad en cultivo y siguiendo el esquema indicado en la Tabla I, se obtienen los grupos: A, [0], 12, A, [0], 24, A, [0], 48, A, [0], 72, A, [0], 96; A, [1], 12, A, [1], 24, A, [1], 48, A, [1], 72, A, [1], 96 ... etc. hasta E, [20], 96, donde el número entre corchetes indica la concentración de flubendiamida. Los
1O tratamientos fueron añadidos al medio de cultivo y las neuronas fueron mantenidas en el incubador en las condiciones ya descritas.
La cuantificación de la supervivencia neuronal siguiente protocolo: se llevó a cabo usando el
- Se aspiró el medio de cultivo.
15 -Se adicionó 1 mL de la solución de Locke modificada (NaC1130 mM, CaC12 2.3 mM, KC15.6 mM, MgC12 1 mM, Hepes 8.4 mM, glucosa 5.6 mM, pH 7.4.
- Se aspiró y adicionó nuevamente 1 mL de la misma solución.
- Se aspiró y adicionó nuevamente 1 mL de solución Locke modificada que contiene 150 J.lg/mL de diacetato de fluoresceína.
- Se incubó 4 mina 37°C.
20 -Se visualizó en un microscopio de epifluorescencia.
25 Mediante esta técnica, las células vivas aparecieron perfectamente teñidas con el colorante fluorescente, y morfológicamente identificables, mientras que los núcleos de las células muertas se visualizaron como puntos rojos. Se fotografiaron al azar varios campos representativos del cultivo y se procedió al recuento tanto de las células vivas (de color verde) , como de las muertas (de color rojo) , calculando finalmente el porcentaje de supervivencia neuronal al dividir el número de neuronas vivas entre el número total de neuronas (vivas y muertas) en cada fotografia. Se evidenció la disminución de la mortalidad neuronal tras tratamiento con flubendiamida al aumentar la edad en cultivo.
