ES 2 386 860 Al DESCIIIPCIÓN PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN DE MADERA DE OLIVO Y EXTRACTOS
ENRIQUECIDOS EN PRODUCTOS DE INTERÉS ALIMENTARIO
Sector de la técnica La presente invención se refiere a un procedimiento de extracción de madera de oliv'O, en particular de virutas de madera, así como a extractos de madera de olivo enriquecidos
en productos de alto valor añadido, tales como hidroxitirosol,
oleuropeína y ácido elenólico, junto con D-manitol, útiles en
el sector de la alimentación.
Estado de la técnica
El olivo (Olea europaea L., Oleaceae) es uno de los árboles frutales más importantes de los países de la cuenca del Mediterráneo y ocupa más de 8.000.000 ha de suelo cultivado a nivel mundial. El número de olivos en España ronda los 300 millones, siendo el país con más olivos del mundo, seguido a distancia por Grecia e Italia.. El fruto del olivo se utiliza para obtener aceituna de mesa y principalmente para obtener aceite de oliva, cuyos aspectos nutricionales y beneficiosos para la salud lo convierten en un aceite vegetal muy apreciado por los consumidores. Ello justifica el alto número de estudios existentes sobre .la composición química de la aceituna y del aceite de oliva y sobre las actividades biológicas de los compuestos identificados. Durante el proceso de elaboración del aceite de oliva se generan cantidades importantes de residuos, en los cua.les se han detectado algunos componentes con propiedades antioxidantes ya identificados en la aceituna y el aceite. Así, son numerosas las patentes existentes encaminadas a la recuperación de compuestos de valor añadido él. partir de residuos, tales como el orujo y el alpeorujo: EP 1953133; EP 1623960; WO
, ,
2008142178 ; WO 2008067976; U., 2002058078; wo 2004009206; wo 2002064537; Y el hueso de aceituna : ES 2145701 .
Si bien la obtención de ac·eite de oliva genera residuos, tambi én el cultivo del olivo origina anualmente un volumen considerable de biomasa procedente de la poda del árbol . Una hectárea de olivar ori gi na de 1. 000 a 3.000 kil os de subproductos al año, lo cual si gnifica que sólo en España se están generando anualmente más de dos mil lones de tonel adas de un material or gánico infrautilizado. Por ello, y teni endo en cuenta que se t rata de un material vegetal abundante y
compl etamente renovable, parece bi en justificado el
considerabl e esfuerzo c:i.entif ico-técni co que vi ene
desarrollándose en l os ú l t i mos años para encontrar
apl icaciones que proporci onen mayor val or añadido a este impor tante subproducto agrícola. En este sentido, los intentos para revalorizar las hojas de olivo ya se recogen en diversas patentes sobre la obtenci ón de extractos de hojas de olivo, como son: WQ 2005075614; EP :1582512; US 5714150; EP 1389465, así como patentes referidas a la aplicabil idad de dichos ext ractos en alimentación, cosmética y farmacia: WQ 200147537; WO 2003080008; FR 2507477; EP 9374 55; EP 200378256; JP 2001181198; EP 0937455; US 20030152656. Si n embargo, hay que destacar que son muy pocos l os estudi os que se conocen sobre la composición química y aplicaciones de los extractos de madera de olivo procedentes de l a poda del oli var.
Por otro lado, el val or de los componentes de los extractos de
l a madera ha s i do puesto de manifiesto en patentes en las que
se apli can l os mismos en di f e :rentes campos : hidroxitirosol [JP
2009191012 ; EP 1915991 ; WO 2008006581; US 2003108651; WO
2001076579; WO 2008143137J, oleuropeína rus 2004097428; US
2004048808; FR 25074 77; I T 2004CSOO01; JP 2009191012; wo
2008108817J, D-manitol [ES 2056745J Y áci do elenólico [JP
20091141 30; DE 2141255; GB 1256092; App. Microbiol. 1973 , 26,
777-82 J.
Si bien es conocida la presencia de hidroxitirosol y oleuropeina en extractos de madera de olivo, aún no se ha descrito un procedimiento de extracción de madera de olivo que permita obtener extractos enriquecidos en esos productos y que constituyan una alternativa adecuada a los obtenidos de otros residuos o subproductos del olivo.
Sería por lo tanto deseable desarrollar un procedimiento optimizado de extracción de madera de olivo que permitiera obtener extractos enriquecidos en productos de alto valor añadido, tales como hidroxitirosol (1) I oleuropeína (2) , Dmanítel (3) Y ácido elenólico (4) , aportando de ese modo un mejor aprovechamiento de este subproducto agricola infrautilizado.
HO~OH HO~OjO
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2 6-r-O~OH HO~OH
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Exposición de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento de extracción de madera de olivo, preferentemente de virutas de madera, que comprende:
(a) extracción de la madera con etanol, preferentemente con 25 etanol del 96%,
"
(b) concentración y precipi tación del extracto etanólico y filtración del residuo obtenido,
(e) hidrólisis del extracto etan61ico concentrado y filtrado obtenido en la etapa (b) , mediante su tratamiento con una disolución acuosa ácida,
(d) adición de una disolución acuosa básica,
(e) extracción con diclorometano,
(f) extracción de la fase ac:uosa de la etapa (e) con acetato de etilo.
Otro objeto de la presente invención son los extractos de madera de olivo enriquecidos en productos de alto valor añadido, tales como hidroxitirosol, oleuropeina y ácido elenólico, así como el producto puro D-manitol, obtenibles en el procedimiento de acuerdo con la invención.
Es decir, la extracción de l.a madera con etanol de la etapa
(a) y la concentración del extracto etanólico, la
precipitación y la filtración en la etapa (b) permite obtener
el sólido identificado como D-manitol.
A continuación, se eliminat el disolvente del extracto etanólico filtrado en la etapa (b) , a presión reducida, y se obtiene un extracto seco que contiene oleuropeina.
Tras la extracción de la mezcla obtenida en las etapas (c) y
(d) con diclorometano en la etapa (e) , se obtiene un extracto del que se elimina el disolvente a presión reducida, rindiendo un extracto seco que contiene ácido elenólico.
y finalmente, de la extracción de la fase acuosa de la etapa (e) con acetato de etilo en la etapa (f) , se obtiene un extracto del que se elimina el disolvente a presión reducida, rindiendo un extracto seco que contiene hidroxitirosol.
Los autores de la presente invención han conseguido desarrollar un procedimiento de extracción de madera de olivo que mejora considerablemente el modo de extracción y la eficacia deseada del procedimiento. Al mismo tiempo permite obtener extractos con activida, d antioxidante y antimicrobi ana, como son los extractos de oleuropeina, ácido elen61ico e hidroxitirosol, junto con D--manitol, conocido edulcorante . Estos compuestos son de int~;rés en el sector alimentario, entre otros.
Los procedimientos conocidos ~;n el estado de la técnica para la obtención de 1, 2, 3 Y 4 utilizan como fuente de obtención otras partes del olivo o residuos generados en la recolección y procesado de la aceituna, no habiendo referencia alguna a la madera de olivo como fuente de estos productos.
Por lo tanto, el procedimiento de acuerdo con la invención presenta varias ventajas frente a los procedimientos conocidos en el estado de la técnica. En primer lugar, se utiliza la madera de olivo, que es un subproducto agrícola de bajo valor para otras aplicaciones conocidas . Además, la producción de este residuo es anualmente alt, a. Las virutas de madera después de ser tratadas según los procedimientos recogidos en esta i nvención pueden utilizarse para muchos de l os usos que actualmente se están dando a. la madera de olivo, como por ejemplo como fuente energética . Pero sobre todo, el procedimiento de acuerdo con la invención permi te obtener un compuesto puro y tres extract:os enriquecidos en un compuesto concreto, todos ellos de alto valor añadido. Es importante señalar, que los extractos obt.enidos no requieren de una etapa de decoloración como si se requiere, por ejemplo, en los extractos de hoja de olivo que se utilizan en la actualidad. Además, existe una gran demanda de este tipo de productos naturales obtenibles de un material vegetal abundante y
3S completamente renovable.
Descripción detallada de la invención El procedimiento para la obtención de extractos de madera de olivo enriquecidos en productos de alto valor añadido consiste en las siguientes etapas:
En la etapa (a) se somete la madera de olivo, preferentemente en forma de virutas, a una, extracción sólido-líquido con etanol, preferentemente con etanol del 96%.
Una vez finalizada la extracción de la madera con etanol, en la etapa (b) se concentra el extracto etan61ico, preferentemente hasta 1/10 parte del volumen inicial, produciéndose la precipitación de un sólido blanco. La posterior filtración del precipitado de la etapa (b) permite obtener D-manito! (3) , tal y como se confirmó comparando los
datos espectroscópicos de estE;! compuesto con los recogidos en
bibliografía, y un extracto enriquecido en oleuropeína (2) . El
D-manito1 obtenido representa. un 1, 2% en peso, respecto al
peso de madera, y puede E!mp1earse en el sector de la
alimentación como educo10rante. Del extracto etanó1ico filtrado de la etapa (b) se elimina el disolvente a presión reducida obteniéndose un extracto seco que contiene oleuropeína (2) . El extracto obtenido representa un 9, 6% en peso, respecto al peso de madera. El análisis de dicho extracto mediante HPLC, y comparándolo con patrones, indicó que el compuesto mayoritario era oleuropeina (2) , presente en un 11, 6%. El extracto obtenido puede emplearse en el sector de la alimentación como antioxidante, retardando la oxidación y deterioro de los alimentos.
En la etapa (e) se efectúa la hidrólisis del extracto etanólico concentrado obtenido en la etapa (b) , mediante su tratamiento con una disolución acuosa ácida, como por ejemplo, agua acidulada con HCl, prefel:iblemente en un rango de pH de 1 a 2, y más preferiblemente de 1, 5, y se calienta la disolución a 90-9S o C hasta la desaparición en HPLC de la señal de oleuropeina (2) .
Posteriormente, en la etapa (el) se añade una disolución acuosa básica, como por ejemplo una disolución acuosa de NaHC03 , hasta alcanzar un pH en un rango de entre 5 y 6, preferiblemente de S, 5 Y se extrae con CH2C12 calentando a 30-35 oC durante 5 minutos.
Tras la extracción con diclorometano en la etapa (e) , de la mezcla obtenida en las etapas (e) y (d) I se obtiene un extracto del que se elimina el disolvente a presión reducida, obteniéndose un extracto seco que contiene ácido elenólico (4) . El extracto obtenido rep:r~esenta un 1, 4% en peso, respecto al peso de madera. El análisis de dicho extracto mediante HPLC, y comparándolo con pat:rones, indicó que el compuesto
mayoritario era ácido elenólico (4) , presente en un 34, 6%. El
extracto obtenido puede emplearse en el sector de la
alimentación, como antimicrobiano, favoreciendo la
conservación de los alimentos.
y finalmente, en la etapa (f) , la fase acuosa de la etapa (e) se extrae con acetato de e'tilo, para obtener un extracto enriquecido en hidroxitirosol (1) , del que se elimina el disolvente a presión reducida., obteniéndose un extracto seco que contiene hidroxitirosol (1) . El extracto obtenido representa un 1, 2% en peso, respecto al peso de madera. El análisis de dicho extracto mE~diante HPLC, y comparándolo con patrones, indicó que el compuesto mayoritario era hidroxitirosol (1) , presente en un 25, 5%. El extracto obtenido puede emplearse en el sector de la alimentación como antioxidante, retardando la oxidación y deterioro de los alimentos.
El procedimiento invent ivo permite obtener extractos enriquecidos en compuestos de alto valor añadido útiles en el
sector de la alimentación. Es decir, el extracto enriquecido en oleuropeína (2) y el extracto enriquecido en hidroxitirosol
(1) poseen propiedades antioxi.dantes, mientras que el extracto
enriquecido en ácido elen61ico (4 ) posee propiedades
antimicrobianas. Además, se obtiene D-manitol (3) , utilizado
como educolorante.
En un modo de realización de la invención, el extracto enriquecido en oleuropeina (~~) y el extracto enriquecido en hidroxitirosol (1) poseen capacidad para la protección de carne fresca frente a la oxidación.
Los extractos enriquecidos en oleuropeína (2 ) y en hidroxitirosol (1) han sido evaluados en cuanto a su actividad antioxidante mediante el ensayo de captura del radical DPPH
(2, 2-difenil-l-picrilhidracilo) . Una muestra comercial de hidroxitirosol (99% de pureza) ha sido también evaluada y tomada corno referencia. Cada medida se hizo por triplicado y la capacidad de captura de radicales libres de los extractos y de la referencia se expresaron en términos de concentración de antioxidante requerida para disminuir la concentración inicial de DPPH· al 50% (concentración eficiente, ECso) . Los valores de ECso obtenidos son los siguientes: 48, 4 ~g' ml-1
(extracto enri quecido en oleuropeina) , 16, 8 ~g'ml-l (extracto enriquecido en hidroxiti rosol) y 6 , 1 ~g'ml-l (hidroxitirosol de referencia) .
Los extractos enriquecidos en oleuropeína (2 ) y en hidroxitirosol (1) han sido ensayados para su aplicación en la conservación de alimentos mediante la evaluación organoléptica de hamburguesas preparadas con carne de paleta de cerdo picada. A la carne se le adicionó un preparado comercializado por la empresa DOMCA S. A. (preparado SG DMC) , en ausencia (hamburguesa "blanco") o presencia de antioxidantes y
conservantes utilizados habit.ualmente en hamburguesa fresca (hamburguesa "control" ) , o bien mezclando la carne y el preparado SG DMC con extracto de romero comercial o con los extractos enriquecidos en olemropeina (2) y en hidroxitirosol
(1) La evaluaci ón organoléptica de las hamburguesas consistió en la detección de olores, colores y sabores en las hamburguesas frescas recién preparadas y a lo largo de 5 días de almacenamiento en cámara frigorífica a 4 oC.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, los cuales no pretenden ser limitativos de su alcance.
Ejemplo 1:
Una pieza de madera de ol:i.vo (Olea europaea L. variedad Picual ) se cortó de un árbol en época de poda. Se dejó secar y se convirtió en virutas. Las vi rutas (1 kg) se extrajeron calentándolas durante 2 h a refluj o con 17 1 de etanol del 96%. El extracto obtenido se concentró hasta 1/ 10 parte del volumen inicial, por elimina.ción del disolvente a presión reducida a temperatura inferior a 40 oc, y se filtraron 11, 80 9 de un precipitado blanco (3) A continuación, el extracto filtrado se llevó a sequedad, por eliminación del disolvente a presión reducida a temperatu:t:'a inferior a 40 oC, resultando 95, 55 9 de extracto concentrado de oleuropei na (11, 6% de 2; 3, 7% de 1) .
Ejemplo 2:
El extracto de oleuropeina (95, 55 g) se suspendió en 2 1 de agua y se adici onaron 400 mI de disolución acuosa de HCI 0, 1
M. Esta mezcla se calentó durante 4 h a 90-95 oC. A continuación se dejó enfriar a temperatura ambiente y se adicionaron 300 mI de disolución acuosa de NaHC03 • La fase acuosa resultante se extrajo tres veces consecutivas con 400
mI de CH2C12 , calentando a 30-35 oC durante S minutos. El extracto de diclorometano así obtenido se llevó a sequedad por eliminación del disolvente a presión reducida, a temperatura inferior a 40 oC, y se obtuvie~ron 14, 14 9 de extracto de ácido elenólico (34, 6% de 4) .
Ejemplo 3:
La fase acuosa extraída en le1 ejemplo 2 se reextrajo tres veces consecutivas con 800 mI de AcOEt, calentándolo aSO-55 oC durante S minutos. El extracto de acetato de etilo así obtenido se llevó a sequedad por eliminación del disolvente a presión reducida, a temperatura inferior a 40 oC, y se obtuvieron 11, 70 9 de extracto de hidroxitirosol (25, 5% de 1) .
Ejemplo 4:
En el ensayo de evaluación de la capacidad de los extractos de oleuropeina (2) e hidroxitirosol (1) para capturar el radical DPPH, como medida de la actividad antioxidante de dichos extractos, se prepararon disoluciones metanólicas a diferentes concentraciones (2 JLg·ml-1 , 5 J.Lg·mr1 , 10 Jlg·mr1 , 50 j.lg·ml-1 y 100 J.Lg·ml-l) de cada extracto y de una muestra comercial de hidroxitirosol (99% de pureza) , que se tomó como referencia. Se mezclaron en una cubeta de 1 cm de paso 1, 2 mI de cada una de estas disoluciones con 2, 4 mI de disolución metanólica de DPPH· (-7 x 10-5 M; con absorbancia de 515 nm de 0, 80 ± 0, 03 AU; la concentración exacta de DPPH· ha sido calculada de la recta de calibración correspondient~e) . Las cubetas se agitaron y mantuvieron en oscuridad durante 15 minutos antes de medirse la absorbancia a 515 nm en un espectrofotómetro UV/Vis PerkinElmer Lambda 19. Cada medida se hizo por triplicado y la capacidad de captura de radica.les libres de las muestras y de la referencia se expresaron en términos de la concentración de extracto o referencia (J.lg ·ml-1) requerida para disminuir la concentración inicial de DPPH· al 50% (concentración eficiente,
Eeso) .
Ejemplo 5:
El análisis cualitativo de los extractos obtenidos de madera de olivo, conteniendo oleuropeina (2) , ácido elenólico (4) e hidroxitirosol (1) , se llevó a cabo en un cromatógrafo de liquidos de alta resolución (HPLC) acoplado a un espectr6metro de masas (MS) . El cromatógrafo (Agilent 1100) estuvo equipado con un detector de diodos en serie y una columna analítica de fase reversa e 18 Waters spherisorb«' SS OD82 (250 mm x 3 mm, 5 J..lm) , termostatizada en un horno a 30 oC. El espectr6metro de masas (Esquire 6000) estuvo equipado con una fuente de ionización a presión atmosférica, electrospray (ESI) y una trampa de iones como analizador_
El análisis cuanti tativo de los compuestos 1, 2 Y 4 en los extractos de oleuropeina, de ácido elenólico y de hidroxitirosol se llevó a ca.bo según el método de estándar externo y en un cromatógrafo de liquidos de alta resolución (Waters 600E) , equipado con u.n detector de diodos en serie y empleando una columna analitica de fase reversa e 18 Waters 8pherisorb~ SS OD82 (250 mm x :3 mm, 5 ¡..tm) , termostatizada en un horno a 30 oC_ Las muestras se prepararon a una concentración de 1 mg-ml-1 y 10 mg-ml-1, y el volumen de inyección fue de 10
¡..tI. La elución de la muestra se consiguió adecuadamente trabajando a un flujo de 0, 7 ml-min-1 y con un gradiente lineal
de mezclas de metanol (A) yagua (B) , ambos disolventes
acidulados con un 0, 2% de ácido acético, de 20% a 70% de A,
durante 55 minutos.
Ejemplo 6:
A una porción de 200 9 de cal::-ne de paleta de cerdo picada se le añadieron 10 9 de preparado SG DMC disuelto en 10 mI de agua y se movió todo hasta obtener una mezcla completa . Las hamburguesas, de aproximadamente 100 9 cada una, preparadas a 10 oC, se colocaron en una bandeja, se envolvieron en plástico alimentario y se almacenaron em una cámara frigorífica a 4 oC, durante S días. Las hamburguesas así preparadas fueron tomadas como blanco. Para las hamburguesas control, además de los 10 9 de preparado SG DMC, se adicionaron 0, 1 9 de ácido ascórbico, 0, 05 9 de ácido cítrico y 0, 1 9 de sulfito sódico. Las hamburguesas que se evaluaron en la presente invención incorporaban a las hamburguessLs utilizadas como blanco 500 ppm de extracto de romero comercial , de extracto de oleuropeína (2) o de extracto de hidroxitirosol (1) , disueltos en 2 mI de
una mezcla 1: 1 de glicerina:agua. Las propiedades
organolépticas de las hambur'guesas fueron evaluadas por un
panel de expertos de la empresa DOMCA S.A.
Como resultado de este experimento, tanto el uso del extracto enriquecido en oleuropeína (2) como del extracto enriquecido en hidroxitirosol (1) permiti ó mantener el color original de la hamburguesa después de 5 días de almacenamiento en una cámara frigorífica a 4 "' C, lo cual confirmó su capacidad de protección de carne fresca frente a la oxidación. Además, las hamburguesas preparadas con extractos enriquecidos en 1 y 2 se cocinaron y degustaron, sin que pudieran detectarse olores y sabores distintos a los de las hamburguesas control .
