Método para el pronóstico del ictus.
Campo de la invención
La presenteinvención se encuadra en general dentro del campodela biomedicinay en particular se refierea un método para pronosticar la evolución funcional de un paciente de ictus.
Antecedentes de la invención
El ictus se define como el trastorno brusco del flujo sanguíneo cerebral que se produce como consecuencia de la oclusión (ictus isquémico o infarto cerebral) o rotura (ictus hemorrágico o hemorragia intracerebral) de vasos sanguíneos cerebrales.
El ictus es la principal causa neurológica de muertey discapacidad en el adulto en países desarrollados (Rosamond et al. 2008) . Durante las últimas décadas, numerosos grupos de investigación han tratado de establecer métodos eficacesdeevaluación tempranay agudade pronóstico trasel accidente cerebrovascular. Actualmente, losfactores pronósticos de recuperación funcional en pacientes de ictus se basan, fundamentalmente, en la combinación defactores clínicosy de imagen (Baird et al.A three-item scale for the early prediction of stroke recover y . Lancet 357, 2095-2099. 2001; Muir et al. Imaging of acute stroke. Lancet Neurol 5, 755-768, 2006) . Sin embargo, es frecuente que se desconozca, con exactitud, la progresión del estado funcional de dichos pacientes. Es más, pacientes con sintomatología clínica e imagen similares, a menudo responden de manera muy diferente al accidente cerebrovascular, mejorandoo empeorandodramáticamentealospocosdíastraselmismo (Davalos et al. Deteriorating ischemic stroke: riskfactorsand prognosis.Neurology40, 1865-1869.1990;Bairdand Donnan. Prognosticvaluéof reperfusion during first 48 hours of ischaemic stroke. Lancet 342, 236.1993; Baird et al. Changes in cerebral tissue perfusión during the first48 hoursof ischaemicstroke: relationto clinical outcome. 1996JNeurol NeurosurgPsychiatr y 61, 26-29.) .
El ictus isquémico presenta una mayor prevalencia que el ictus hemorrágico, representando, aproximadamente, el 87% de todos los casos. En ambos casos, se interrumpe el aporte de glucosay de oxígeno a la región cerebral afectada, lo que desencadena una compleja cascada de señalización celular, denominada “cascada isquémica”, que incluyeexcitotoxicidad, estrés oxidativoynitrosativo, inflamación, desequilibrio iónico, entre otros, todo ello culmina en la muerte neuronal (Dirnagl U. et al. (1999) Pathobiologyof ischaemic stroke:an integratedview.TrendsNeurosci 22, 391-397;DoyleK.P. et al. (2008) Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology 55, 310-318) . Esta interrupción transitoriao permanente del flujo sanguíneo cerebral en un territoriovascular determinado genera unárea isquémicaque presenta una zona central infartada en la que se produce la muerte celular rápida, predominantemente por necrosis (LiptonP. (1999) Ischemic cell deathin brain neurons.PhysiolRev79, 1431-1568) . Alrededordedicha zonasesitúala denominada“áreadepenumbra isquémica”, cuyavascularizacióndependedevasos colaterales.Enesta zona, la muerte neuronalesmás tardíayse produce fundamentalmentepor apoptosis (Charriaut-Marlangue et al. 1996. Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia: an in situ DNAfragmentation analysis.JCereb Blood Flow Metab16, 186-194.; Grahamand Chen 2001, Programmedcell deathin cerebral ischemia.JCereb BloodFlow Metab 21, 99-109) . Sin embargo, recientemente se ha sugerido que en la zona isquémica se produce inicialmente la muerte por apoptosis, mientras quela necrosis eselresultado delfallo energético que se produce como consecuencia delalto requerimientode energía del proceso apoptótico (Benchoua et al. 2001. Specific caspase pathways are activated in the two stagesof cerebralinfarction.JNeurosci21, 7127-7134) .
Actualmente, las estrategias terapéuticas están encaminadas a reducir el daño isquémico y rescatar las células potencialmente viables, inmediatamente tras el ictus. Así, la zona de penumbra, aunque inactiva funcionalmente, es potencialmente recuperable si se normaliza rápidamente el flujo sanguíneo regional y se establecen medidas cito-protectoras que eviten la muerte por apoptosis de las células potencialmente viables (Benchoua et al. 2001. Specific caspasepathwaysareactivatedinthetwostagesof cerebralinfarction.JNeurosci21, 7127-7134; Bandera et al. 2006 Cerebral blood flow threshold of ischemic penumbra and infarct core in acute ischemic stroke: a systematic review. Stroke 37, 1334-1339) .
La secuencia de acontecimientos que desencadena la muerte neuronal isquémica no se conoce en su totalidad. En los últimos años se ha descrito que la proteína supresora de tumores p53 está implicada en la muerte neuronal causadapor la isquemia cerebral.De hecho, modelosexperimentalesde isquemia cerebral invivo han demostrado que p53 se acumula en las áreas lesionadasyfunciona como un importantefactor pro-apoptótico (Crumrine et al. 1994. Attenuationofp53expression protectsagainst focal ischemic damagein transgenic mice.JCereb BloodFlow Metab 14, 887-891; Li et al, 1994. p53-immunoreactive protein and p53 mRNA expression after transient middle cerebral arter y occlusion in rats. Stroke 25, 849-855; discussion 855-846; Saito et al. 2005, Modulationofp53degradation via MDM2-mediated ubiquitylation and the ubiquitin-proteasome system during reperfusion after stroke: role of oxidative stress.JCereb Blood Flow Metab 25, 267-280; Endo et al. 2006, Mitochondrial translocation of p53 mediates release ofcytochromec and hippocampal CA1 neuronaldeath after transient globalcerebral ischemiain rats.JNeurosci26, 7974-7983; Luo et al. 2009, Delayed treatment withap53 inhibitor enhances recover y in stroke brain.Ann Neurol65, 520-530; Niizuma et al. 2009. Potential role of PUMA in delayed death of hippocampal CA1 neurons after transient global cerebral ischemia.Stroke 40, 618-625) .
La proteínap53, codificadaporelgen supresor tumoral Tp53, esunfactorde transcripciónqueregula importantes procesos celulares como son: el ciclo celular, la estabilidad génicay la muerte celular por apoptosis. Por ello, los niveles intracelulares de p53 están finamente regulados, ya que de ello va a depender su actividad funcional. Así, p53 tiene una vida mediamuy corta (15-20 minutos) y seexpresa constitutivamenteenniveles casi indetectables enla mayoría de células, incluidas las neuronas (Soussi2000, The p53 tumor suppressor gene: from molecular biology to clinical investigation. Ann NYAcad Sci 910, 121-137; discussion 137-129) .
Entre estas condicionesde estrés celular estánel estrésgenotóxico, la hipoxia/isquemiaylaactivación oncogénica, loque desembocaenla estabilizacióny activacióndep53y, por tanto, la paradadel ciclo celular, senescenciay/o apoptosis, dependiendo del contexto celular (Jin andLevine 2001 Thep53 functional circuit.J Cell Sci 114, 41394140.; Culmsee and Mattson 2005, p53 in neuronal apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 331, 761-777) .En el casodela isquemia cerebral, p53seacumulayactiva rápidamenteloque inducela apoptosis neuronal, tantoen la región isquémica como en la zona de penumbra (Crumrine et al. 1994, Attenuation of p53 expression protects against focal ischemic damage in transgenic mice. J Cereb Blood Flow Metab 14, 887-891; Li et al. 1994, p53immunoreactive protein and p53 mRNA expression after transient middle cerebral arter y occlusion in rats. Stroke 25, 849-855; discussion 855-846;Saito et al.2005, Modulation of p53 degradation via MDM2-mediated ubiquitylation and the ubiquitin-proteasome system during reperfusion after stroke: role of oxidative stress. J Cereb Blood Flow Metab 25, 267-280; Luo et al. 2009. Delayed treatment withap53 inhibitor enhances recover y in stroke brain.Ann Neurol 65, 520-530.) .
Dentro de la proteína p53 se ha identificado un dominio rico en prolina que es esencial para la función apoptótica dela proteína (WalkerK.K.andLevineA.J. (1996) Identificationofanovelp53 functional domainthatis necessar y forefficientgrowth suppression. Proc Nati AcadSciUSA93, 15335-15340; Sakamuro et al. (1997) . The polyproline region of p53 is required to activate apoptosisbut not growth arrest. Oncogene 15, 887-898; MurphyM. E. (2006) Polymorphic variants in the p53 pathway. Cell Death Differ 13, 916-920) . Esta región contiene un sitio polimórfico, específicode humanos, situadoenelexón4, codón72delgenTp53 (polimorfismoArg72Pro) .Así, el codón72de Tp53 contienenbienCCC, que codificaun residuodeprolinaydalugaralavariantep53-Pro, obienCGC, que codifica una argininay sesintetizalavariantep53-Arg (Pietsch et al. (2006) Polymorphisms in the p53 pathway. Oncogene 25, 1602-1611) .
En los últimos años se ha establecido que la variante p53-Argtiene una capacidad de inducir apoptosis en células en cultivo y líneas tumorales superior a la variante p53-Pro (Bonafe et al. (2002) p53 codon 72 genotype affects apoptosisbycytosine arabinosidein blood leukocytes.BiochemBiophysRes Commun299, 539-541; Dumont et al. (2003) The codon 72 polymorphic variants of p53 have markedly different apoptotic potential. Nat Genet 33, 357365; Bonafé M. et al. “The different apoptotic potential of the p53 codon 72 alleles increases with age and modulates in vivo ischaemia inducedcelldeath”.Celldeathanddifferentiation.England.Sep2004.Vol.11.Nº9.Páginas962973) .
Smith M. A. C. et al. “TP53 codon72 polymorphism asariskfactor for cardiovascular diseaseina Brazilian population”. Brazilian journal of medical and biological research. 2007.Vol. 40. Nº 11. Páginas 1465-1472. En este documento los autores estudian la presencia del polimorfismo del codon 72 del gen Tp53 en un grupo de 383 individuosde entre66a97 años.Enél analizanlas frecuencias alélicas, la distribución genotípica, yla asociación alélicas con enfermedades tales como: enfermedades cardiovasculares, diabetes tipoII, obesidad, neoplasia, demenciay depresión. Sin embargo, el estudio nomuestra una asociación significativa entreel polilmorfismoylas enfermedades analizadas pero los análisis de regresión realizados mostraron una tendencia del alelo Arg a asociarse con enfermedades cardiovasculares.
Alkhalaf et al. “Polymorphismofp53 gene codon72inKuwaiti with coronar y arter y disease and diabetes”. International Journalof Cardiology. .Vol.115.Nº1.Páginas1-6.Los autores analizanla distribución genotípica yla frecuencia alélicas del codon 72 del Tp53 en 158 muestras de pacientes afectados de enfermedad cardiovascular frentea 110 casos control, y en 142 individuos diabéticos frentea 130 controles.En este caso no encontraron asociación alguna entrela distribución genotípica Pro/Pro, Pro/Arg, oArg/Argyla enfermedad cardiovascular (CAD) entre la muestras de pacientes afectados por la misma.
En Bonafé M. et al. “The different apoptotic potential of the p53 codon 72 alleles increases with age and modulates in vivo ischaemia inducedcelldeath”.Celldeathanddifferentiation.England.Sep2004.Vol.11.Nº9.Páginas962973.) , los autores realizan un estudio in vivo de la relevancia del polimorfismo Arg72Pro de Tp53, en un grupo de pacientes (edadescomprendidasentre66-69) afectadosdeepisodiosagudosdeisquemiacardiaca, encontrandoquelos pacientesArg+ mostraronniveles aumentadosde los parámetros analíticosTroponinaIylaCK-MB, marcadoresque se correlacionan con la extensión de la necrosis celular producida por la isquemia, en comparación con los pacientes Pro+.
Manfredi Samantha et al. “p53 codon 72 polymorphism in coronar y arter y disease: No evidence for association with increased risk or micronucleus frequency”. Environmental and Molecular Mutagenesis. 2002. Vol. 40. Nº 2. Páginas 110-115. los autores evaluaron la distribución genotípica del codon 72 en 250 pacientes, 180 con CAD (diagnosticados en base a pruebas de angiografía) y 70 con angiografía coronaria no patológica y encontraron que las frecuenciasde los genotipos Pro/Pro, Pro/ArgyArg/Arg no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos estudiados.
La solicitudde patenteWO9911817 está relacionada con un métodode screening para identificar aquellos individuos conriesgode desarrollar una enfermedad asociada condistintas formas polimórficasdelgenp53, que comprende los siguientes pasos:a) obtenciónde una muestra biológicade talespacientesyb) determinacióndela presenciade los alelos p53pro, o p53argen dicha muestra; en donde el patrón alélico consistente en p53pro/p53pro, p53arg/p53arg y p53pro/p53arg son indicadores del riesgo de desarrollar la enfermedad asociada a las distintas formas polimórficas presentes en el individuo. Concretamente, individuos que son p53arg/argmuestran un mayor riesgo a desarrollar patologías asociadas con infecciones por papilomavirus, incluyendo cáncer cervical.
Ladiversidad genética interindividual puede serunimportantefactora teneren cuentaenlaevolución funcional de los pacientes de ictus. A pesar de las evidencias epidemiológicas y experimentales que relacionan numerosas alteraciones génicas con el riesgo de sufrir un ictus (Matarin et al. (2007) .Agenome-wide genotyping studyin patients with ischaemic stroke: initial analysis and data release. Lancet Neurol 6, 414-420; Ikram et al. (2009) Genomewide association studiesofstroke.NEnglJMed360, 1718-1728) , elhechodeseruna enfermedad poligénicaha dificultado enormemente la identificación de genes individuales implicados en la patología (Hassan and Markus (2000) Genetics andischaemic stroke. Brain 123, 1784-1812.) . Hastael momento, no seha identificado ninguna alteración génicao polimorfismo relacionados con el pronóstico funcional de pacientes de ictus.
Actualmentela predicción del estado funcionalde los pacientesde ictus es imprecisay variable, a pesarde las numerosas escalas clínicasylas técnicasdeimagenquevalorane intentan cuantificarlos diferentesaspectosdelictus (Baird et al. (2001) Athree-item scale for the early predictionof stroke recover y . Lancet 357, 2095-2099; Muir et al. (2006) Imaging of acute stroke. Lancet Neurol 5, 755-768) .
Existe pues la necesidad de encontrar un método de pronóstico de ictus que proporcione información sobre la progresión del pacientedeforma rápidaysencillayque pueda ser incluido enla práctica clínica habitual.
Descripción de la invención
La presenteinvención proporcionaun método genéticopara pronosticarlaevolucióndeun pacientequeha sufrido un ictus cerebralde formarápida, sencillayfiablede tal forma que puede ser incluido enla práctica clínica habitual.
Por lo tanto un primer aspecto de la presente invención se refiere a un Método para pronosticar la evolución funcional en un paciente de ictus que comprende determinar el polimorfismo Arg72Pro del gen Tp53 en una muestra biológica de dicho paciente, donde la presencia del genotipo Arg/Arg es indicativo de mal pronóstico funcional del ictusyla presencia del genotipo Pro/Arg o del genotipo Pro/Pro es indicativodebuen pronóstico funcionalde ictus.
En un aspecto particular de la presente invención, el genotipo Arg/Arg es indicativo de una mayor apoptosis neuronal que el genotipo Pro/Arg o el genotipo Pro/Pro.
Por mal pronóstico de ictus nos referimos a una escala de Rankin modificada ≥ 3.
En un aspecto particular de la presente invención, el ictus es ictus hemorrágico. En otro aspecto particular de la presente invención, el ictus es ictus isquémico.
En un aspecto particular de la presente invención, la determinación del polimorfismo se realiza mediante el genotipado del exon 4, codón 72 del gen Tp53. En un aspecto más en particular, el genotipado se realiza mediante amplificación del ADN mediante la técnicaPCRyposterior análisis por RFLP (polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción) .
En otro aspecto particular de la presente invención, la determinación del polimorfismo se realiza mediante la secuenciación delexon4, codón72 del genTp 53.
Enotroaspectoparticulardelapresenteinvención, la muestraesuntejido.Enotroaspectoparticulardelapresente invención, la muestra es un fluido, en particular, es sangre, saliva, semen, líquido amniótico.
Descripción de las figuras
La figura 1muestrael estudiodela asociación entreel polimorfismoArg72ProdelgenTp53yel estado funcional en pacientesde ictus.El estado funcionalde los pacientesde ictus se cuantificó, a los3meses del ictus isquémico (A)
o hemorrágico (C) , mediantela escalade Rankin modificada (ERm) . Así mismo, se determinóelvolumendel infarto, a los 4-7 días del ictus isquémico (C) yelvolumendela lesión residual, a los3meses del ictus hemorrágico (D) .
La figura 2muestraquelavariante polimórficap53-Argindujolaapoptosis neuronal medianteun mecanismoque implicala disfunción mitocondrialyla activacióndela caspasa3.A) La sobrexpresióndep53-Arg, peronolade p53-Pro promueve la apoptosis neuronal, de manera dependiente de la concentración. B) El inhibidor de la actividad transcripcional de p53, PFT-α (Pifithrin alpha) , noprevinola apoptosis neuronal causadapor p53-Arg.C) El inhibidor general de caspasas (ZVAD 100 µM) ylos específicosde caspasa3 (ZDEVD 100 µM, ZDMQD 100 µM) ycaspasa9 (ZLEHD 50 µM) , peronolosde caspasa8 (ZIETD100 µM) ycaspasa2 (ZVDVAD 100 µM) , previnieron la apoptosis neuronal causadaporp53-Arg.D) p53-Argpromuevela activacióndela caspasa3 enlas neuronas, E) así comola despolarización del potencialde membrana mitochondrial (Δψm) .
Descripción detallada de la invención
Se realizó un estudio observacional prospectivo en dos cohortes de pacientes con ictus isquémicoyhemorrági
co, procedentes del Hospital Universitario de Santiago de Compostela, con el análisis descriptivo que se detalla a
continuación:
1. Cohorte de pacientes con ictus isquémico 408 pacientes con ictus isquémicos ingresados en las primeras 12 horas desde el inicio de la sintomatología, sin
deterioro neurológico previo (ERm ≤ 1) . Edad: 72.8 ± 12.1 años. Sexo: 242 hombres (59.3%) y166 mujeres (40.7%) . Diagnóstico (TOAST) : -Cardioembólicos 148 (36.3%) -Aterotrombóticos 38 (9.3%) -Lacunares 46 (11.3%) -Indeterminados 167 (40.9%) -Otros 9 (2.2%) NIHSS al ingreso 5[2, 11] ASPECTS al ingreso 10 [8, 10] Volumen 2º TC (4º-7º día) 31.1 ± 58.7 mL
n = 399
Fórmula utilizada: 1/2AxBxC Deterioro neurológico precoz: 43 (10.5%) Escalade Rankin modificada (ERm) a los3meses:
- 0 80 (19.6%) -1 98 (24.0%) -2 69 (16.9%) -3 52 (12.7%) -4 44 (10.8%) -5 33 (8.1%) -6 32 (7.8%)
Mal pronósticoa los3 meses (ERm ≥ 3) : 161 (39.5%)
Variantes alélicas de p53: -Arg/Pro 147 (36.0%) -Pro/Pro 26 (6.4%) -Arg/Arg 235 (57.6%)
2. Cohortede pacientes conictus hemorrágico 128 pacientes con hemorragia intracerebral no traumática ingresados en las primeras 12 horas desde el inicio de la
sintomatología. Edad: 71.2 ± 12.3 años Sexo: 74 hombres y54 mujeres Diagnóstico: - Hipertensiva 76 - Otras 22 - Antiagregantes/anticoagulantes 18 - Amiloidea 8 - MAV 2 Localización: - Hemisférica profunda 75 - Lobar 41 - Cerebelosa 7 - Tronco 3 - Intraventricular primaria 1 Contaminación intraventricular o subaracnoidea 34 NIHSS al ingreso 8[4, 12] Volumen inicial 20.5 ± 26.9 mL Escala de Rankin modificada a los 3meses: - 0 26 (20.3%) - 1 22 (17.2%) - 2 17 (13.3%) - 3 18 (14.1%) - 4 21 (16.4%) - 5 9 (7.0%) - 6 15 (11.7%)
Mal pronósticoa los3 meses (ERm ≥ 3) 59 (46.1%)
Variantes alélicas: -Arg/Pro 54 (42.2%) -Pro/Pro 7 (5.5%) -Arg/Arg 67 (52.3%)
Como variable principal se estudió el estado funcional de los pacientes a los 3 meses del ictus, determinado mediante la escala de Rankin modificada (ERm; mal pronóstico functional: ERm ≥ 3) . En el caso de la cohorte de pacientesde ictus isquémico, se utilizaron comovariables secundariaselvolumen del infarto, alos4-7 días trasel ictus, yel deterioro neurológico precoz, a las48 horas del ictus (empeoramientode > 4puntos en NIHSSS, “National Instituteof Health Stroke Scale”) .Enelcaso del ictus hemorrágico, se analizóelvolumendela lesión residuala los3 meses del ictus, como variable secundaria.
El genotipado de los polimorfismos del codón 72 del gen Tp53 (Arg72Pro) se realizó en la Universidadde Sala-manca. Los experimentos con neuronas en cultivo primario se realizaron en el HospitalUniversitario de Salamanca.
Ejemplo1
Genotipado del polimorfismoArg72Prode Tp53
ElDNAseextrajoa partirde sangre periféricadelos pacientes, mediante procedimientosestandarizados. Mediante PCR (“polymerase chain reaction”) se amplificó la región del gen Tp53 que contiene el polimorfismo estudiado (Arg72Pro;rs1042522) . Así, se amplificó un fragmento de 298 pares de bases (pb) utilizándose los primers comerciales (Thermo Scientific, Thermo Fisher Scientific, Alcobendas, Madrid, Spain) . Las PCRs se realizaron en un volumen final de 50 µLquecontenían250ngdelDNAgenómico, MgCl21, 5mM, dNTPs100mM, 15pmoldecadaprimer y 0, 5UdelaTaqpolymerase (Promega®) .Las condiciones de la PCRfueron35 ciclos compuestospor1mina 94ºC, 1 mina 58ºCy1 mina 72ºC.Los productos de la PCRfueron digeridos durante todala noche con5Udela enzima BstUI. Los fragmentos digeridos se separaron en un gel de agarosa del 2, 5%y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. La presencia de un único fragmento de 298 pb correspondió al genotipo Pro/Pro, mientras quela presenciade dos fragmentosde 160pby 129pb correspondióal genotipo homocigotoArg/Arg. Genotipos heterocigotos (Arg/Pro) contenían los tres fragmentos.
LosvaloresdeERm resultaron ser significativamente superiores (Mann-Whitney-Wilcoxon test;p<0.0001) en los pacientes que portan el genotipo Arg/Arg que en los Arg/Pro o Pro/Pro, que resultaron ser similares, tanto en la cohortede pacientes con ictus isquémico como en la de hemorrágico (Figura 1Ay1C) . Así mismo, observamosque elvolumende infartoa los4-7 días del ictus isquémico es significativamente superior (Chi-square test, p<0.0001) en pacientes con el genotipo Arg/Arg (39.7 ± 65.9 mL) que los Arg/Pro (21.8 ± 48.5 mL) o Pro/Pro (6.9 ± 12.0 mL) (Fig. 1B) . Es más, el 17.4%de los pacientes que portan el genotipo Arg/Arg sufrieron deterioro neurológico precoz a las 48 horas del ictus, mientras que éste ocurrió únicamente en el 2% de los pacientes Arg/Pro y0% de losPro/Pro (Chi-square test, p<0.0001) .El análisisderegresión logísticarevelóqueel genotipo Arg/Arg está asociado al deterioro neurológico precoz (OR 7.77;IC95% 1.72-35.01;p = 0.008) .
Así mismo, en la Figura 1D se muestra que los pacientes con el genotipo Arg/Arg muestran un volumen residual unas5 veces superior que los genotipos Arg/Pro o Pro/Pro, alos3 meses del citus hemorrágico (Chi-square test, p<0.0001) . De nuevo, el análisis de regresión logística reveló que el genotipo Arg/Arg está asociado al volumen residual (B 15.40;IC 95% 12.17-18.62;p<0.0001) .
En la tabla1 se muestran los datos clínicosy de imagen de los pacientes de ictus, segregados por pronóstico, considerando mal pronóstico aquellos pacientes que tenían valores de ERm ≥ 3.
TABLA1
Análisis multivariado (variable dependiente:malpronóstico) :Los valores son características clínicas y deimagen de los pacientes en el momento del ingreso, salvo cuando se indica el tiempo. Están expresados como medias (SD) o porcentajes.TAS, tensión arterial sistólica;TAD, tensión arterial diastólica; INR, “international normalizedratio”; HIC, hemorragia intracerebral; PCR-us, proteínaCreactiva ultrasensible;MAV, malformación arteriovenosa; NIHSS, “National Institute of Health stroke scale”
El análisisderegresiónlogísticapusode manifiestoquelaedad, elvalorNIHSSalingreso, elvolumendelinfarto, el deterioro neurológico precozyel genotipo Arg/Arg son variables independientes asociadas con un mal pronóstico en el ictus isquémico:
TABLA2
Análisis de regresión logística (variable dependiente: mal pronóstico; ictus isquémico) . OR: Odds ratio; IC 95%: intervalo de confianza de 95%
Así mismo, el análisisderegresión logísticadelasvariablesenla cohortede pacientesde ictus hemorrágico (Tabla 3) ponede manifiestoqueel NIHSSyel genotipoArg/Arg sonvariablesindependientes asociadasalmal pronósticode la enfermedad. Es más, el genotipo Arg/Arg es un potente marcador (OR 360.7; 95% Cl 31.5-4132) de mal pronóstico en pacientes que sufren un ictus hemorrágico.
TABLA3
Análisis de regresión logística (variable dependiente: mal pronóstico; ictus hemorrágico) . OR: Odds ratio; IC 95%: intervalo de confianza de 95%
Ejemplo2
Cultivosde neuronas corticales, transfeccionesytratamientos de la s células
Con objetode establecerlos mecanismos responsables de la fuerte asociación entreel genotipoArg/Argyelmal pronóstico functionalenpacientesdeictus, neuronasencultivoprimariose transfectaronconunplásmidoqueexpresó, junto con la GFP, la secuencia completa de la variante polimórfica p53-Arg o p53-Pro.
Los cultivos de neuronas corticales se prepararon a partir de fetos de rata (Wistar) de 16 días de gestación, como describimos anteriormente (Almeida et al. 2004) . Tras 5-6 días de cultivo, las neuronas se transfectaron con Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Madrid, Spain) (Almeida et al. 2005) . Los plásmidos (plRES2-eGFP; Clontech, BD Biosciences, Madrid) empleados co-expresabanlavariantepolimórficadep53, p53-Argo p53-Pro, yla proteínaverde fluorescente (GFP) , lo que permitió la identificación de las neuronas transfectadas. En algunos experimentos, las neuronas se trataron con glutamato (100 µM, 5 min) (Almeida and Bolanos 2001; Maestre et al. 2008) o se sometieron a un modelode isquemiaexperimental in vitro (deprivaciónde oxígenoyglucose) , anteriormente utilizadopor nosotros (Almeida et al. 2002) .
Ejemplo3
Determinación de la apoptosis neuronal mediante citometría de flujo
Tras las transfecciones (14 horas de transfección) , se evaluó la apoptosis neuronal mediante citometría de flujo, para ello, las neuronas se tiñeron con anexinaV, conjugada con APC, y7-amino-actinomicinaD (7-AAD) (Becton Dickinson Biosciences) , siguiendo las instrucciones delfabricante.Tras 15 minutos de incubación, las señales dela GFP (neuronas transfectadas) , de la anexinaV-APCy del7-AAD se analizaron en los canales FL1, FL4Y FL3, respectivamente, de un citómetro de flujo FACScalibur (BD Biosciences) , equipado con un haz láser de argón de 15mW sintonizado a488nm, utilizandolosprogramas CellQuestTMyPaint-A-GateTMPRO (BD Biosciences) .Se consideraron células apoptóticas aquellas anexina V-APC+ y7-AAD− (Almeida et al. 2005) .
Como muestra la Figura 2A, la variante polimórfica p53-Arg, pero no p53-Pro, indujo la apoptosis neuronal, de manera dependiente de la concentración. Dicho efecto no se previno al tratar a las neuronas con PFT-aPifithrin alpha) , un potente inhibidor de la capacidad transcripcional de p53. Estos resultadosdescartaron que la apoptosis neuronal causadaporp53-Argestuviera mediadapor la actividaddep53 comofactorde transcripción.
Ejemplo4
Deteccióndela caspasa3activay dePARP1procesado, mediante citometríade flujo
La caspasa3activa se determinó mediante el kit commercial APOACTIVE3TM Kit (Bachem, San Carlos, CA, USA) , siguiendolasinstruccionesdelfabricante.La deteccióndePARP1 procesadosellevóacabotrasla tinciónde las neuronas con el anticuerpo anti-PARP1 procesado conjugado con3-ficoeritrina (Becton Dickinson Biosciences) , que reconoce, específicamente, un un dominiodePARP1de89 kDagenerado como consecuenciadela proteolisisde la proteína causadapor la caspasa3activa.Las señales de la GFPyla ficoeritrinase analizaronenlos canalesFL1y FL3 del citómetro de flujo, respectivamente (Diaz-Hernandez et al. 2007) .
Ejemplo5
Determinación del potencialde membrana mitocondrial (Δψm)
Utilizando una bateríade inhibidoresde caspasas (Calbiochem, Merck Chemicals Ltd., Nottingham, UK) , demostramos que la apoptosis neuronal causada por p53-Argestá mediada por la activación de las caspasas, concretamente la caspasa9ylacaspasa3.Laactivacióndela caspasa3se corroborómediante citometríadeflujotrasla tincióndelas neuronasconlosanticuerposanti-caspasa3activayanti-PARP1procesado, queesel resultadodelarupturadePARP1 causada por la caspasa3activa. Es más, la apoptosis neuronal causada por p53-Argestá mediada por una alteración en el potencial de membrana mitocondrial. Por tanto, p53-Argindujo la disfunción mitocondrial, la activación de la caspasa3activayla subsecuente apoptosis neuronal.
El Δψm se determinó en las neuronas transfectadas (GFP+ ) mediante citometría de flujo, siguiendo las instrucciones del kit comercial MitoProbeTM DilC1 (5) Assay Kit (Molecular Probes Europe BV, Leiden, Holanda) . Las neuronas se tiñeron con MitoProbeTM DilC1 (5) , que, dado su carácter catiónico, se acumula en las mitocondrias polarizadas, por lo quesupérdidaesun índicede despolarización mitocondrial.Lasmismas muestrasse incubaronen presenciadecarbonil cianurode3-clorofenilhidrazona (CCCP, incluido enel kit) que producela máximadespolarización mitocondrial. Las señales de la GFPyel fluorocromo se analizaron en los canales FL1yFL4 del citómetro de flujoFACScalibur, respectivamente (Diaz-Hernandez et al. 2007) .