Uso de poloxaminas como inductoras de la diferenciación osteogénica de células mesenquimales.
Sector de la técnica
La presente invención se enmarca en el campo de la inducción de diferenciación de células mesenquimales y progenitoras en osteoblastos.
Antecedentes En situaciones patológicas graves (fracturas complejas, traumatismos, tratamiento de tumores óseos y reemplazamiento de articulaciones o defectos congénitos) el hueso dañado no se forma o regenera espontáneamente. Para restaurar su integridad estructural y funcional, se pueden aplicar autoinjertos o hueso "alogénico" procedente de bancos de tejidos, lo que no está exento de efectos adversos que pueden llegar a ser graves (Bauer y Muschler, Clin. Orthop. 10-27, 2000) . Además, la terapia de reparación del hueso se puede suplementar con la estimulación bioquímica de su curación local mediante la administración de factores de crecimiento que promueven la formación de osteoblastos (Lieberman et al., J. Bone Joint Surg. Am. 84A, 1032-1044, 2002; Finkemeier. J. Bone Joint Surg. Am. 84, 454-464, 2002) . La aplicación terapéutica de los factores de crecimiento plantea importantes dificultades derivadas de su corta semivida biológica, su deficiente estabilidad, su selectividad tisular y su toxicidad y actividad carcinogénica potenciales. Ello hace que la búsqueda de moléculas sintéticas con capacidad osteogénica, mejor perfil de seguridad/eficacia y más accesibles desde el punto de vista económico constituya un área de investigación muy activa (Chun-Ya E. Han y col. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 1442-1445, 2009) . En este sentido, se ha demostrado ya la efectividad osteogénica de la simvastatina (Ayukawa y col., J. Oral Rehab. 37, 123-130, 2010) .
En la patente WO20077108689 se reivindica un método ex vivo que comprende adicionar una poliamina sobre un medio de cultivo que contiene células madre en suspensión. En una reivindicación dependiente se concreta que las poliaminas son las moléculas de origen natural espermidina, espermina y sus precursores ornitina y putrescina. La estructura de la putrescina es H2N- (CH2) 4- NH2, la ornitina es un aminoácido de fórmula H2N- (CH2) 3- CH (NH2) -COOH, la espermidina es una triamina H2N- (CH2) 4- NH- (CH2) 3- NH2 y la espermina es una tetramina H2N- (CH2) 3- NH- (CH2) 4- NH- (CH2) 3- NH2. Todas ellas son aminas o poliaminas de bajo peso molecular caracterizadas por presentar grupos amino terminales y una distancia entre grupos amino de 3 ó más átomos de carbono.
Ming Cai y col. (Pharmazie 63, 751-756, 2008) han descrito la actividad osteogénica de CBMIDA (catecol-3, 6-bis (ácido metileniminodiacetico) ) .
Por otra parte, los copolímeros bloque con capacidad de gelificación in situ se han mostrado como excipientes farmacéuticos muy adecuados para la preparación de sistemas inyectables de factores de crecimiento que forman un depot en las inmediaciones de la zona de administración. Los polímeros bloque de poli (óxido de etileno) -poli (óxido de propileno) -poli (óxido de etileno) , PEO-PPO-PEO, de la familia de los Pluronics han sido ampliamente ensayados como transportadores de factores de crecimiento, que son capaces de retenerlos y de proporcionar una cesión sostenida en el entorno del defecto óseo que se quiere corregir (Clokie y col. Plast. Reconstr. Surg. 105, 628-637, 2000) . Los Pluronics por sí solos, en ausencia de factor de diferenciación, carecen de actividad osteogénica aunque sí se ha descrito su capacidad para inducir la formación de adipocitos a partir de células madre mesenquimales (Vashi y col. Biomaterials 29, 573-579, 2008) .
Otra familia de copolímeros bloque de PEO y PPO es la de las poloxaminas o Tetronics, que presentan una estructura en estrella con cuatro brazos de PEO-PPO que terminan en grupos hidroxilo, unidos a través de un grupo etilendiamino central. Se encuentran disponibles comercialmente en una amplia variedad de pesos moleculares y relaciones molares EO/PO (Chiappetta y Sosnik. Eur. J. Pharm. Biopharm. 66, 303-317, 2007) . Las poloxaminas se utilizan como agentes solubilizantes y estabilizantes de fármacos, para crear superficies stealth en nanopartículas, como componentes de hidrogeles para cesión controlada de fármacos y como componentes de líquidos de limpieza y conservación de lentes de contacto (Alvarez-Lorenzo y col. Frontiers in Bioscience E2, 424-440, 2010) .
También se ha propuesto el uso de poloxaminas como componentes de sistemas de liberación de factores de crecimiento para el tratamiento de defectos óseos. Por ejemplo, Tae y col. (Composite comprising polysaccharide-fimctionalized nanoparticle and hydrogel matrix, a drug deliver y system and a bone defect replacement matrix for sustained release comprising the same, and the preparation method thereof. U.S. Pat. Appl. Publ. (2007) , Cont. in-part of U.S. Ser. No. 391, 480. CODEN: USXXCO US 2007248675 A1) reivindican la preparación y el uso de nanopartículas recubiertas con polímeros emulsificantes biocompatibles, entre los que se citan las poloxaminas, para controlar la cesión de factores de crecimiento. Por otra parte, en la solicitud de patente WO94/25080 se reivindica un método que comprende mezclar un hidrogel con células e implantarlas en un animal. Entre los copolímeros que se citan como componentes de los hidrogeles se encuentran las poloxaminas. En estos sistemas, las poloxaminas sólo actúan como excipientes inertes y no como sustancias activas.
Descripción de la invención
En la presente invención se describe por primera vez la actividad de las poloxaminas como inductoras en la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras. En particular, se demuestra que tienen capacidad osteogénica.
Por tanto se proporcionan métodos para tratar a pacientes que padecen defectos óseos en general, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de poloxaminas. Las poloxaminas son el ingrediente activo en estas composiciones, y por lo tanto, no se requiere de la incorporación de otras sustancias activas.
De este modo, un aspecto de la invención se dirige a una o varias poloxaminas para su uso como medicamento; en un aspecto particular se dirige a una o varias poloxaminas para su uso como medicamento para inducir diferenciación de células mesenquimales o progenitoras; en un aspecto más particular, para inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos.
En otro aspecto particular, la invención se dirige a una o varias poloxaminas para su uso como medicamento para el tratamiento de defectos óseos creados en fracturas conminutas.
En otro aspecto particular se dirige a una o varias poloxaminas para su uso como medicamento para el tratamiento de fracturas asociadas a osteopenia. De entre dichas fracturas son típicas las de la zona distal del radio.
En un aspecto particular se dirige a una o varias poloxaminas para su uso como medicamento para el tratamiento de pseudoartrosis.
En un aspecto particular se dirige a una o varias poloxaminas para su uso como medicamento para el tratamiento de pérdidas de la reserva ósea. Dicha pérdida de la reserva ósea puede ser consecuencia de diversos problemas como por ejemplo la respuesta a ciertos materiales traducida en osteolisis y/o protección de esfuerzos, como ocurre en las prótesis articulares, en quistes oseoesenciales, gangliones intraóseos y fusiones espinales.
Las poloxaminas tienen grandes ventajas frente a las sustancias para las que se ha descrito hasta el momento capacidad osteogénica:
- Las poloxaminas, debido a que son polímeros sintéticos, tienen una estructura bien definida y conocida, y se incluyeron en numerosos ensayos para aplicaciones biomédicas, y su uso está autorizado en cosmética y productos de limpieza y conservación de lentes de contacto;
- Las poloxaminas son citocompatibles hasta proporciones muy elevadas, lo que hace que su margen de seguridad pueda ser más alto que el de los factores de crecimiento;
- No se ha descrito hasta el momento para las poloxaminas ninguna actividad farmacológica, por lo que no es previsible que de su uso se puedan derivar efectos secundarios relevantes;
- Se comercializan a precios mucho más bajos que los factores de crecimiento, por lo que ofrecen una mejor relación coste/efectividad;
- Son estables frente a la esterilización por procedimientos convencionales;
- En un intervalo de concentración adecuado para ejercer la actividad osteogénica, permiten preparar composiciones que se comportan como implantes inyectables, es decir, como sistemas de gelificación in situ que se pueden aplicar fácilmente por inyección y que permanecen en el lugar de aplicación durante tiempos prolongados.
Una ventaja adicional de la invención es que para la utilización de las poloxaminas como agentes osteoinductores no se requiere la modificación previa de su estructura, ni tampoco se requiere la incorporación de factores de crecimiento o sustancias osteogénicas adicionales.
Para la presente invención, se entiende por "poloxaminas" un copolímero de bloque de poli (óxido de etileno) (PEO) y poli (óxido de propileno) (PPO) que presentan una estructura en estrella con cuatro brazos de PEO-PPO que terminan en grupos hidroxilo; estos cuatro brazos están unidos a través de un grupo etilendiamino central, y se representan por las siguientes fórmulas generales I y II:
donde a tiene un valor entre 1 y 150 y b tiene un valor entre 1 y 150.
Las poloxaminas se encuentran disponibles comercialmente en una amplia variedad de pesos moleculares y relaciones molares EO/PO (catálogo de BASF, The Chemical Company, en la edición de Norte América, sección marcas en la clasificación de productos químicos) . Son ejemplos de poloxaminas útiles para la invención, los Tetronic (marca registrada de BASF) 304, 701, 901, 904, 908, 1107, 1301, 1304, 1307, 90R4 y 150R1 caracterizados por las propiedades que se especifican en la tabla 1.
TABLA 1 
Otro aspecto de la invención se dirige hacia una composición farmacéutica que consiste en una disolución o dispersión acuosa esterilizada de una o varias poloxaminas para inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras. En particular, para inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblas- tos.
Otro aspecto de la invención se dirige hacia una composición farmacéutica que consiste en una disolución o dispersión acuosa esterilizada, de una o varias poloxaminas para el tratamiento de defectos óseos creados en fracturas conminutas, fracturas asociadas a osteopenia, pseudoartrosis, y pérdida de la reserva ósea.
En un aspecto particular, la invención se dirige al uso de una o varias poloxaminas para la preparación de dichas composiciones farmacéuticas.
En la presente invención, se entiende por "composición farmacéutica" una composición líquida para constituir un medicamento; de forma preferida para su administración parenteral. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse en forma de implante mediante una inyección en la zona específica en la que el paciente sufre la patología, que gelifica a la temperatura corporal y produce sus efectos durante un tiempo continuado en la zona a tratar.
Otro aspecto de la invención se dirige a un gel viscoelástico obtenible mediante un procedimiento que comprende poner en contacto a) una disolución o dispersión acuosa esterilizada de una o varias poloxaminas, con b) células mesenquimales o progenitoras, siendo la concentración total de poloxaminas en la etapa a) superior a la concentración crítica de gelificación a la temperatura del medio en el que se encuentran las células mesenquimales o progenito- ras.
Para la presente invención, se entiende por "concentración crítica de gelificación" aquella a la que la disolución de poloxamina experimenta una transición de sol a gel a la temperatura a la que se encuentran las células mesenquimales o progenitoras o a la temperatura corporal.
En una realización particular, cuando la concentración total de poloxaminas supere la concentración crítica de gelificación a la temperatura del medio en el que se encuentran las células mesenquimales o progenitoras, la composición debe conservarse entre 3 y 7ºC hasta el momento de la aplicación. Cuando esta aplicación se lleva a cabo empleando una jeringa, el mantenimiento en frío asegura una buena jeringabilidad.
Las células mesenquimales o progenitoras pueden encontrarse in vivo o in vitro.
En una realización particular, las células mesenquimales o progenitoras de la etapa b) se encuentran en un medio de cultivo in vitro. Es posible realizar este procedimiento mediante el empleo de una pipeta o jeringa.
De forma preferida, las disoluciones o dispersiones acuosas esterilizadas de una o varias poloxaminas de la invención, presentan una concentración total de poloxaminas comprendida entre el 2 y el 30%. De forma más preferida, la concentración total de poloxaminas está comprendida entre el 10 y el 20%.
En otro aspecto, la invención se dirige a un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica, como se describió anteriormente, que consiste en una disolución o dispersión acuosa esterilizada de una o varias poloxaminas, que comprende a) mezclar una o varias poloxaminas en un medio acuso a pH entre 6.5 y 7.5 y a una temperatura entre 0 y 37ºC, y b) esterilización de la mezcla.
En un aspecto particular, el procedimiento comprende una etapa adicional después de la etapa a) y antes de la etapa b) , que consiste en añadir un agente isotonizante.
Se entiende por agente isotonizante, cualquier sustancia que incremente la presión osmótica de una disolución acuosa como por ejemplo el cloruro sódico, la glicerina, la glucosa, el manitol o el sorbitol.
La etapa b) de esterilización puede llevarse a cabo mediante procesos conocidos por el experto en la materia, entre ellos, están en la práctica común los que se citan en el siguiente grupo: filtración en condiciones estériles, calor húmedo en el envase definitivo, o radiaciones ionizantes y no ionizantes.
En otro aspecto la invención también se dirige a un método para inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos que comprende poner en contacto a) una disolución o dispersión acuosa esterilizada de una o varias poloxaminas, con b) células mesenquimales o progenitoras.
En un aspecto particular, las células mesenquimales o progenitoras se encuentran en un medio de cultivo y el método se realiza in vitro.
En un aspecto particular, se exceptúan de las células mesenquimales o progenitoras, las células madre procedentes de embriones humanos.
En otro aspecto particular, la disolución o dispersión de la etapa a) se administra a animales o a humanos in vivo, en particular, mediante inyección en la zona donde debe inducir la diferenciación de células mesenquimales o progenitoras en osteoblastos.
De este modo, cuando la concentración total de poloxaminas supere la concentración crítica de gelificación a la temperatura corporal, se formará in situ un depot de consistencia semisólida o gel viscoelástico.
Descripción de las figuras
Figura 1. Viabilidad celular al cabo de 24 horas de estar en contacto con las disoluciones de poloxaminas (n=3) de distintas concentraciones. 0.01 %p/p: columna blanca; 0.1%p/p: gris claro; 1%p/p: gris oscuro; 5%: negro.
Figura 2. Módulos elástico (G', símbolos cerrados) y viscoso (G'', símbolos abiertos) de disoluciones de Tetronic al 20% en Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) antes y después de ser autoclavadas.
Figura 3. Actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) de las células cultivadas en presencia de distintas poloxaminas. También se muestran los datos correspondientes a los controles positivo y negativo.
Ejemplos de la invención
Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención y no deben interpretarse como limitativos de la misma. Se incluyen ejemplos para ilustrar la citocompatibilidad, capacidad gelificante y capacidad osteoinductora de las poloxaminas en disolución.
Modo de realización de la invención
La poloxamina o combinaciones de varias poloxaminas se disuelven bajo agitación en agua o medio tampón de pH adecuado (entre 6.5 y 7.5) , preferentemente pH 7.4. La concentración total en poloxamina puede estar comprendida entre el 2 y el 30%, preferiblemente entre el 10 y el 20%. La temperatura del medio de disolución puede estar comprendida entre 0 y 37ºC, preferiblemente entre 4 y 20ºC, para evitar la formación de un gel durante la preparación de la disolución. La presión osmótica de la disolución se puede ajustar con NaCl.
La disolución de poloxamina se esteriliza por calor húmedo a 121ºC durante 20 minutos.
Ejemplo 1
Citocompatibilidad de las poloxaminas
Se prepararon disoluciones de Tetronic 304, 901, 904, 908, 1170, 1301, 1307, y 150R1 al 10%, disolviendo la cantidad necesaria de cada poloxamina en el volumen adecuado de tampón fosfato pH 7.4. Las disoluciones se filtraron a través de membranas de 0.2 μm. Se cultivaron células CHO-K1 y Balb/3T3 en medio D-MEM sin rojo fenol, conteniendo suero fetal bovino (10% p/v) y gentamicina (130 μg/100 ml) . Se sembraron 5000 células por pocillo (50 μl) en placas de 96 pocillos y se adicionaron 50 μl de disolución de poloxamina convenientemente diluida para que la concentración en el pocillo fuese de 0.01, 0.1, 1 ó 5% p/v. Las placas se incubaron 24 h a 37ºC en atmósfera 5%CO2 humidificada. Las células supervivientes se evaluaron usando un kit de citotoxicidad LDH y la absorbancia se midió a 490 nm. En la Figura 1 se muestran los resultados obtenidos.
En líneas generales, los copolímeros con peso molecular elevado y carácter hidrofílico (Tetronic 908, 1107, 1301 y 1307) mostraron alta citocompatibilidad.
Ejemplo 2
Viabilidad de los osteoblastos
Se prepararon disoluciones concentradas de Tetronic 908, 1107, 1301 y 1307 al 20% p/p en medio DMEM sin rojo fenol a 4ºC y se filtraron a través de membranas de 0.2 μm. Se cultivaron células SAOS-2 en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino (10% w/v) y gentamicina (130 μg/100 ml) . Se sembraron 200.000 células por pocillo (1.5 ml) en placas de 24 pocillos y se adicionaron 0.5 ml de disolución de poloxamina. Las placas se incubaron 24 h a 37ºC en atmósfera 5%CO2 humidificada. Las células se tripsinizaron y se incubaron a 37ºC durante 5 minutos. A continuación, las células se centrifugaron (1400 rpm, 4 min) y se resuspendieron en medio DMEM fresco, se diluyeron alícuotas de 100 μl de suspensión de células con 200 μl de tampón fosfato de pH 7.4. Se transfirieron a un citospin para fijar las células en un portaobjetos. A continuación, se efectuó una tinción con calceina/yoduro de propidio. Las tinciones revelaron que la viabilidad fue superior al 90% después de 24 horas de contacto con las disoluciones de poloxamina al 20%.
Ejemplo 3
Capacidad de las poloxaminas para formar geles a temperatura corporal
Se prepararon disoluciones concentradas de Tetronic 908, 1107, 1301 y 1307 al 20% p/p en tampón fosfato pH 7.4 y DMEM. Se registró la evolución de los módulos elástico (G') y viscoso (G'') en función de la temperatura entre 15 y 45ºC, a una velocidad de calefacción de 2ºC/min, aplicando una velocidad de oscilación de 5 rad/s. Los ensayos se llevaron a cabo con alícuotas de disolución sin autoclavar y con otras esterilizadas en autoclave a 121ºC durante 20 min.
A 20ºC las disoluciones presentaron una viscosidad muy baja, que corresponde a un sistema fácilmente jeringable. La temperatura de gelificación del Tetronic 908 se situó en 33ºC y para los Tetronic 1107, 1301 y 1307 en 25ºC (Figura 2) . A 37ºC todos los sistemas se comportaron como geles con módulo elástico comprendido entre 103 y 104 Pa y el autoclavado no modificó el comportamiento reológico de las disoluciones.
Ejemplo 4
Capacidad de osteoinducción
Se cultivaron células madre mesenquimales en medio MesenPRO RSTM adecuadamente suplementado y se sembraron (3•104 células/pocillo, 1.5 ml) en placas de 6 pocillos. Se añadieron 200 μl de disolución de poloxamina al 20% en tampón fosfato de pH 7.4 en el compartimento superior de cada Transwell®. En total se incorporaron a cada pocillo 40 mg de poloxamina. Como controles negativo y positivo se utilizaron células en medio basal y células en medio de diferenciación osteogénica (10 mM β-glicerofosfato, 100 μM dexametasona y 50 μl/ml ácido ascórbico) , respectivamente. Las placas se incubaron a 37ºC en atmósfera de 5% CO2 humidificada. El medio se reemplazó con medio fresco dos veces a la semana. Para llevar a cabo el ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) , las células se lisaron al cabo de 3, 7, 14 y 23 días por adición de 150 μl de tampón Tris HCl 10 mM de pH 7.5 con 0.1% Tritón X-100. Las muestras se sometieron a tres ciclos de congelación (-80ºC) /descongelación (45 min por ciclo) . Los lisados se lavaron por centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutes a 4ºC. Cada muestra (50 μl) se incubó con 150 μl de sustrato de ALP en placas de 96 pocillos a 37ºC durante 30 min. La absorbancia de las muestras se leyó a 405 nm usando un lector de ELISA. Se usó una curva de calibración de p-nitrofenilfosfato para determinar la concentración de ALP. Las medidas de actividad ALP se normalizaron por el contenido en proteína, que se midió por el ensayo de proteína BCA, y los resultados se expresaron como micromoles de ALP por minuto y por mg de proteína.
También se llevaron a cabo dos análisis histoquímicas, visualizando la actividad ALP de la manera siguiente: las células se fijaron con una disolución de paraformaldehído al 4% durante 5 min, se lavaron con tampón fosfato, se incubaron en la oscuridad con naftol ASMX-fosfato al 0.1% y violeta rápido al 0.1% AMPD 56 mM y se observaron al microscopio óptico. Para detectar la mineralización de las células se efectuó una tinción con rojo de alizarina. Las células se fijaron con etanol 70% durante 1 hora y se lavaron con agua dos veces. A continuación, se tiñeron con rojo de alizarina al 2% durante 30 min, se lavaron con agua tres veces y se observaron las células al microscopio.
En la Figura 3 se muestran los perfiles de actividad ALP obtenidos con las poloxaminas Tetronic 908, 1107 y 1307 y con controles negativo y positivo de osteogeneidad. Los controles negativos indican que la actividad ALP se incrementa ligeramente a los 7 días retornando después a los valores basales. La actividad ALP de las células mesenquimales cultivadas en medio osteogénico estándar (control positivo) mostraron un máximo en el día 7, que fue mucho más intenso que el que se observó con el control negativo. Los geles de poloxamina indujeron un crecimiento progresivo de la actividad ALP durante dos o tres semanas.
Los geles de poloxamina dieron lugar a la proliferación de las células mesenquimales durante la primera semana y, a continuación, a la diferenciación a osteoblastos en la segunda y la tercera semana. La tinción de alizarina mostró nódulos de mineralización en los cultivos con las poloxaminas Tetronic 908, 1107 y 1307, al cabo de 23 días.
