Procedimientos para la identificación genética de las especies europeas del género Maja (centollas) .
Sector de la técnica
La centolla es un recurso pesquero muy importante en Europa y, como tal, una exigencia básica de mercado es la autentificación de su origen y su correcto etiquetado. Además, se está explotando de forma intensiva y, de hecho, en el Mediterráneo, la especie más comercializada ya se considera amenazada. Por eso también es fundamental la identificación de estas especies para desarrollar programas de recuperación y repoblación, de modo que se asegure la incorporación correcta de cada especie en su área de distribución geográfica.
Estado de la técnica
La centolla es uno de los crustáceos de mayor importancia económica en las costas europeas. Pertenece al género Maja y en esta región se han definido cuatro especies: M. brachydactyla, M. squinado, M. crispata y M. goltziana (Neumann 1998) , si bien el interés comercial se centra en las dos primeras. M. brachydactyla se distribuye en el Atlántico (desde el sur del Mar del Norte hasta Senegal) mientras que M. squinado es endémica del Mediterráneo. M. crispata y M. goltziana fueron descritas inicialmente tanto en el Atlántico (desde el oeste de Portugal hasta el Golfo de Guinea) como en el Mediterráneo, aunque los registros recientes corresponden al Mediterráneo (Carmona-Suárez 2003, Fürböck y Patzner 2005; Soppelsa et al. 2005, Lelli et al. 2007) .
La diferenciación de estas especies es muy complicada, especialmente en el caso de M. brachydactyla y M. squinado; se basa en una serie de caracteres morfológicos como la forma de los primeros gonópodos, la forma de las espinas del caparazón (y su disposición) y varias medidas morfométricas (Neumann 1998) . Sin embargo, estas diferencias no son definitivas, son apreciables sólo por expertos y tienen el inconveniente añadido de que cambian a lo largo de la vida del individuo (no se observan en estado larvario y varían entre juveniles y adultos) . Por este motivo, las centollas pescadas en el Atlántico (M. brachydactyla, según Neumman) son todavía etiquetadas en los mercados como M. squinado.
Desde el punto de vista comercial, las capturas de centolla superaron las 5000 toneladas en el año 2005 (según los últimos datos disponibles de la FAO) ; y, siendo un producto muy apreciado en el mercado, alcanza además precios elevados. Se pesca casi exclusivamente en el litoral Atlántico, mientras que en el Mediterráneo es cada vez más difícil de encontrar. De hecho, en algunas zonas del Mediterráneo, M. squinado se considera una especie amenazada. Por estos motivos, se está desarrollando el cultivo en cautividad, tanto para abastecer a los mercados y paliar la sobreexplotación de las poblaciones naturales como para repoblar y recuperar las áreas más afectadas.
Para resolver los problemas de identificación, hemos llevado a cabo un estudio genético con marcadores de ADN mitocondrial: un fragmento de 710 pb del gen COI y un fragmento de 560 pb del gen 16S (Sotelo et al. 2008) , confirmando el estatus de especie de cada una de las formas propuestas.
En este estudio concluimos además que el fragmento de 16S es un marcador idóneo para la identificación de estas centollas, por ser invariable dentro de especie y variable entre especies. Conociendo la secuencia nucleotídica de estos fragmentos, es posible asignar una muestra de centolla europea de forma inequívoca a una de las cuatro especies. La ventaja de la identificación genética es su validez en cualquier etapa del desarrollo del individuo, desde larva a adulto, y su aplicación sobre una pequeña cantidad de tejido del individuo analizado, por lo que no es necesario disponer del individuo completo.
Aunque la secuenciación del fragmento del 16S es un buen método de identificación, hemos diseñado un protocolo de asignación molecular más rápido y sencillo, pero igualmente eficaz. El principal objetivo es la identificación de M. brachydactyla frente a M. squinado, ya que estas dos especies de centolla son las más parecidas morfológicamente y de mayor interés comercial. Sin embargo, para evitar cualquier posible confusión con las demás especies del Mediterráneo, éstas también se han incluido a la hora de desarrollar la técnica.
Bibliografía Carmona-Suárez CA (2003) Reproductive biology and relative growth in the spider crab Maja crispata (Crustacea: Brachyura: Majidae) . Scientia Marina 67: 75-80.
Fürböck S, Patzner RA (2005) Daily movement patterns of Maja crispata Risso 1827 (Brachyura: Majidae) Acta Adriatica 46: 41-45.
Lelli S, Carpentieri P, Colloca F, Ardizzone GD (2007) The spiny spider crab Maja gotziana (Crustacea: Majidae) in south Lebanese waters. JMBA2 - Biodiversity Records (Published on-line) .
Neumann V (1998) A review of the Maja squinado (Crustacea: Decapoda: Brachyura) species-complex with a key to the eastern Atlantic and Mediterranean species of the genus. Journal of Natural Histor y 32: 1667-1684.
Soppelsa N, Zenetos A, Papathanassiou E (2005) Maja goltziana d'Oliveira, 1888 (Decapada, Brachyura, Majidae) in the southern Tyrrhenian Sea. Crustaceana 78: 121-124.
Sotelo G, Moran P, Posada D (2008) Genetic identification of the northeastern Atlantic spiny spider crab as Maja brachydactyla Balss, 1922. Journal of Crustacean Biology 28: 76-81.
Explicación de la invención
El objetivo de la invención es la identificación genética inequívoca de las 4 especies de centolla que se han descrito en las costas europeas. La invención se basa en la amplificación de un fragmento de 671 pb del gen 16S del ADN mitocondrial, para el que ya había cebadores disponibles con anterioridad, y en el estudio de las diferencias en la secuencia entre las 4 especies de centolla. Teniendo en cuenta estas diferencias, se han identificado 3 enzimas de restricción que digieren el fragmento de 671 pb (cada enzima por separado, en una reacción independiente) de modo que el patrón combinado de bandas que generan es característico de cada una de las especies.
Descripción detallada de la invención (forma de realización)
El procedimiento para la identificación genética de las 4 especies europeas del género Maja (centollas) , M. brachydactyla, M. squinado, M. crispata y M. goltziana, consta de las siguientes etapas:
1. Extracción de ADN.
2. Amplificación por PCR de un fragmento de 671 pb del gen mitocondrial 16S.
3. Digestión del fragmento amplificado de 671 pb con 3 endonucleasas de restricción, en reacciones independientes.
4. Electroforesis de los fragmentos que resultan de cada digestión y análisis de los patrones combinados de las 3 enzimas, característicos de cada especie.
1. Extracción de ADN
Para extraer ADN se parte de una muestra de tejido de 0.5 cm3, de músculo preferentemente. Se han descrito muchos protocolos de extracción, pero uno de los más sencillos y rápidos es el que utiliza la resina quelante Chelex [Estoup et al. (1996) Mol Mar Biol Biotech 5: 295-298], Consiste en homogeneizar el tejido en 400 μL de una solución de Chelex 100 (Bio Rad) al 10%. La solución debe mantenerse caliente y en agitación antes de tratar la muestra. Para potenciar la eliminación de proteínas, se añaden 30 μL de proteasa 20 mg/mL (Pronase, Roche) al homogeneizado. Éste se incuba primero a 60ºC durante 1 hora (en un baño de agua, con agitación) y después a 99ºC durante 15 minutos (en una estufa) . Para que precipiten los restos de tejido, junto con la resina, y el ADN quede en el sobrenadante, se aplica una centrifugación final de 1 minuto.
Si la cantidad de muestra es limitante (si se trata de una larva, por ejemplo) , el kit NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel) es más adecuado porque permite recuperar más ADN y de mejor calidad. En este caso, se siguen las instrucciones del fabricante.
Para comprobar la efectividad de la extracción, una alícuota de 4 μL se somete a electroforesis en un gel de agarosa (Agarose D-1 low EEO-QDT, Pronadisa) al 1% en tampón TBE 1×. El gel lleva incorporado bromuro de etidio, de modo que el ADN se hace visible bajo luz ultravioleta (Figura 1) .
2. Amplificación de un fragmento de 671 pb del gen 16S
Para amplificar por PCR este fragmento se utilizan los cebadores 16L29 y 16HLeu (SEQ ID NO 1 y 2, respectivamente) , que ya habían sido descritos para otros crustáceos decápodos (en el laboratorio de Christoph Schubart) . Hay que indicar que el extremo 3' del fragmento corresponde al inicio del gen tRNALeu. La reacción contiene: 1 μL de extracción (ADN) , 2 μL de tampón 10× (160 mM (NH4) 2SO4, 670 mM Tris-HCl pH 8.8, 0.1% Tween 20) , 1 μL de MgCl2 50 mM, 0.5 μL de cada uno de los cebadores 20 μM, 1 μL de dNTP Mix 10 mM (Applied Biosystems) , 0.2 μL de ADN polimerasa (BIOTAQ 5 U/μL, Bioline) y agua bidestilada estéril hasta completar un volumen de 20 μL. El programa de amplificación consiste en una desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 minutos, 35 ciclos de desnaturalización a 95ºC, templado a 55ºC y extensión a 72ºC, cada paso durante 20 segundos, y una extensión final a 72ºC durante 7 minutos. El resultado se comprueba migrando 4 μL del producto de PCR en un gel de agarosa (Agarose D-1 low EEO-QDT, Pronadisa) al 2%, durante 30 minutos a 100 V. En el mismo gel se co-migran también 3 μL de un marcador de peso molecular (HyperLadder IV, Bioline) para estimar el tamaño del fragmento amplificado. Este marcador resulta en un patrón de 10 bandas, con un rango de 100 a 1000 pb (cada banda es un múltiplo exacto de 100 pb) . En toda muestra de centolla europea debe visualizarse la banda de 671 pb (Figura 2) .
3. Digestión del fragmento amplificado de 671 pb con 3 endonucleasas de restricción
Para identificar las 4 especies de centolla, atendiendo a las diferencias en la secuencia del fragmento de 671 pb (Figura 3) , se han seleccionado 3 enzimas de restricción que generan patrones combinados de bandas característicos en cada especie; son BsgI, Hpy188I y PsiI (New England Biolabs) . Cada digestión se lleva a cabo como una reacción independiente. Se digieren en cada caso alrededor de 150 ng del producto de PCR con 10U de enzima en un volumen final de 20 μL (2 μL del tampón 10× específico de la enzima y agua bidestilada estéril hasta completar el volumen) ; durante un tiempo mínimo de 1hora a 37ºC.
4. Electroforesis de los fragmentos que resultan de cada digestión y análisis de los patrones combinados
Una alícuota de 10 μL de cada digestión se migra en un gel de agarosa (Agarose D-1 low EEO-QDT, Pronadisa) al 2% en tampón TBE 1×, durante 60 minutos a 100 V. Se co-migran en cada caso 3 μL de marcador de peso molecular (HyperLadder IV, Bioline) . Al igual que en los pasos de comprobación de PCR, el gel contiene bromuro de etidio, por lo que el resultado de la electroforesis se observa bajo luz ultravioleta. Los perfiles de restricción que genera cada enzima son los siguientes:
i. La enzima BsgI tiene como diana de corte la secuencia GTGCAG (N) 14\uparrowNN\downarrow
Esta diana sólo se encuentra en M. brachydactyla, en la posición 516. La digestión da lugar a 2 fragmentos de 516 y 155 pb (perfil A) . En las otras 3 especies el fragmento de 671 pb permanece completo (perfil B) (Figura 4) . Esta enzima ya permite diferenciar M. brachydactyla del resto de especies (Figura 5) .
ii. La enzima Hpy188I tiene como diana de corte la secuencia TCN\downarrowGA
Esta diana aparece dos veces en M. squinado, en las posiciones 87 y 554. La digestión resulta en 3 fragmentos de 87, 467 y 117 pb (perfil A) . En las otras 3 especies la diana sólo se encuentra una vez, en la posición 554, de modo que se obtienen 2 fragmentos de 554 y 117 pb (perfil B) (Figura 6) . Esta enzima permite diferenciar M. squinado del resto de especies (Figura 5) .
iii. La enzima PsiI tiene como diana de corte la secuencia TTA\downarrowTAA
Esta diana aparece dos veces en M. brachydactyla, en las posiciones 171 y 245, por lo que se forman 3 fragmentos de 171, 74 y 426 pb (perfil A) . En M. squinado y M. crispata sólo se encuentra una vez, en la posición 245, y se obtienen 2 fragmentos de 245 y 426 pb (perfil B) . En M. goltziana aparece tres veces, en las posiciones 171, 245 y 640, por lo que resultan 4 fragmentos de 171, 74, 395 y 31 pb (perfil C) (Figura 7) . Esta tercera enzima permite diferenciar M. crispata y M. goltziana, las 2 especies que no se pueden separar con las enzimas anteriores (Figura 5) .
Los patrones combinados se resumen en la siguiente tabla:
Por lo tanto, la digestión secuencial del fragmento de 671 pb del ADN mitocondrial con las enzimas BsgI, Hpy188I y PsiI permite identificar de forma inequívoca las 4 especies de centolla del género Maja que se han descrito en Europa.
Se trata de un método sencillo y rápido. Los equipos que se requieren son básicos en cualquier laboratorio de análisis molecular y es posible analizar simultáneamente un número elevado de muestras y obtener los resultados en horas. La gran ventaja de la identificación genética frente a la morfológica (la única disponible hasta el momento) es su aplicación a cualquier individuo independientemente de la fase vital en que se encuentre, porque no se ve afectada por cambios ontogénicos, y su aplicación a muestras pequeñas de tejido, sin necesidad de tener individuos completos e intactos.
La aportación más relevante de este procedimiento es la diferenciación de la centolla del Atlántico, M. brachydactyla, frente a las centollas del Mediterráneo. Actualmente, esta especie es la más importante para el comercio y se está evaluando su cultivo en cautividad, por lo que es fundamental asegurar su autenticidad en todo momento. La centolla del Mediterráneo M. squinado está amenazada en varias regiones de su distribución natural y por eso se están desarrollando planes de recuperación y repoblación, en los que es indispensable identificar los individuos de partida. Además, el conocimiento básico de cualquier especie, tanto M. brachydactyla como M. squinado, M. crispata o M. goltziana, incluye la descripción de su área de distribución y su abundancia, dónde la aplicación de esta invención puede ser muy útil.
Descripción de las figuras
Figura 1. Fotografía de un gel de agarosa al 1% en el que se ha comprobado una extracción de ADN a partir de muestras de músculo de centolla. La primera calle de la izquierda corresponde al marcador de peso molecular HyperLadder IV, y las siguientes (de izquierda a derecha) a Maja brachydactyla (br) , M. squinado (sq) , M. crispata (cr) y M. goltziana (go) . Se observa una banda de varios Kpb, resultado de la rotura mecánica del ADN durante el proceso de extracción, pero no se detectan fragmentos pequeños (de cientos de bases) que indicarían que el ADN estaba dañado de antemano. Además, la intensidad de la banda indica que la cantidad de ADN es suficiente para poder realizar el análisis molecular.
Figura 2. Fotografía de un gel de agarosa al 2% en el que se ha comprobado la amplificación por PCR del fragmento de 671 pb del gen 16S, a partir de muestras de centolla procedentes de la costa europea. La primera calle de la izquierda corresponde al marcador de peso molecular HyperLadder IV, y las siguientes (de izquierda a derecha) a M. brachydactyla (br) , M. squinado (sq) , M. crispata (cr) y M. goltziana (go) . En las cuatro calles se observa la banda de 671 pb.
Figura 3. Alineamiento de la secuencia nucleotídica del fragmento de 671 pb del gen 16S de las cuatro especies de centolla, M. brachydactyla, M. squinado, M. crispata y M. goltziana (SEQ ID NO 3 - 6) . En el margen izquierdo se indica la especie a la que pertenece cada línea de la secuencia, que aparece separada en bloques consecutivos de 60 pb, tal como se indica en el margen derecho. Las columnas con un asterisco en la base se corresponden con las posiciones de la secuencia que no varían entre las especies; mientras que la ausencia de asterisco marca las posiciones variables. Las posiciones indicadas en minúscula, las 20 primeras y las 20 últimas, corresponden a los cebadores 16L29 y 16HLeu (SEQ ID NO 1 y 2) .
Figura 4. Localización de la secuencia de reconocimiento de la enzima BsgI, GTCAG (N) 16, sobre el alineamiento del fragmento de 671 pb de las cuatro especies de centolla. Se indica en negrita y sombreada. Se observa que sólo aparece en la secuencia de M. brachydactyla, donde da lugar a dos fragmentos de 516 y 155 pb.
Figura 5. Fotografía de un gel de agarosa al 2% en el que se han comprobado las digestiones del fragmento de 671 pb con las enzima BsgI, Hpy188I y PsiI. Cada bloque de 5 calles corresponde a una digestión, en el orden citado. En cada grupo, la primera calle de la izquierda corresponde al marcador de peso molecular HyperLadder IV, y las siguientes (de izquierda a derecha) a M. brachydactyla (br) , M. squinado (sq) , M. crispata (cr) y M. goltziana (go) .
Con la enzima BsgI: en la calle que corresponde a M. brachydactyla se observan las dos bandas de 516 y 155 pb. En las calles restantes aparece la banda de 671, el fragmento completo sin digerir.
Con la enzima Hpy188I. en la calle que corresponde a M. squinado se observan las tres bandas de 467, 117 y 87 pb (la última es muy tenue, está indicada con una flecha) . En las calles restantes aparecen las dos bandas de 554 y 117 pb.
Con la enzima PsiI: en la calle que corresponde a M. brachydactyla se observan las tres bandas de 426, 171 y 74 pb (la última es muy tenue, está indicada con una flecha) . En las calles de M. squinado y M. crispata aparecen las dos bandas de 426 y 245 pb. En la calle de M. goltziana se diferencian las 4 bandas de 395, 171, 74 (ésta es muy tenue, está indicada con una flecha) y 31 pb.
Figura 6. Localización de la secuencia de reconocimiento de la enzima Hpy188I, TCNGA, sobre el alineamiento del fragmento de 671 pb de las cuatro especies de centolla. Se indica en negrita y sombreada. Se observa que aparece dos veces en la secuencia de M. squinado, donde da lugar a tres fragmentos de 87, 467 y 117 pb, y una vez en las demás especies, donde genera dos fragmentos de 554 y 117 pb.
Figura 7. Localización de la secuencia de reconocimiento de la enzima PsiI, TATTAA, sobre el alineamiento del fragmento de 671 pb de las cuatro especies de centolla. Se indica en negrita y sombreada. Se observa que aparece dos veces en la secuencia de M. brachydactyla, donde da lugar a tres fragmentos de 171, 74 y 426 pb; una vez en las secuencias de M. squinado y M. crispata, donde genera dos fragmentos de 245 y 426 pb; y tres veces en la secuencia de M. goltziana, donde origina cuatro fragmentos de 171, 74, 395 y 31 pb.
Texto libre de la lista de secuencias
SEQ ID NO 1 corresponde al cebador directo diseñado en el laboratorio de Christoph Schubart para amplificar un fragmento del gen 16S en varios crustáceos decápodos.
SEQ ID NO 2 corresponde al cebador reverso diseñado en el laboratorio de Christoph Schubart para amplificar un fragmento del gen 16S en varios crustáceos decápodos; localizado en el extremo 5' del gen tRNALeu.