NANOPARTÍCULAS LUMINISCENTES FUNCIONALIZADAS QUE COMPRENDEN UN SISTEMA SOLUBLE EN MEDIO ACUOSO CAPAZ DE AUTO-ENSAMBLARSE DE MANERA REVERSIBLE EN FUNCIÓN DE LA TEMPERATURA
La presente invención se refiere a nanopartículas luminiscentes, en particular a nanopartículas foto-luminiscentes que comprenden un núcleo de material cristalino luminiscente estabilizado por un recubrimiento específico de origen recombinante y a su síntesis. La presente invención también se refiere a nanopartículas luminiscentes que muestran la propiedad de auto-ensamblaje reversible en función de la temperatura del medio. Las nanopartículas pueden ser utilizadas como sensores multi-respuesta para aplicaciones biomédicas ya que son capaces de emitir luz ademas de detectar variaciones de temperatura dentro de los parámetros utilizados en análisis y estudios biológicos. Las nanopartículas pueden ser utilizadas como unidades discretas de transporte) '
vehiculización de metales nanométricos mediante la fonnación de estructuras globulares de escala submicro-métrica para la creación de nano y micro dispositivos inteligentes en aplicaciones tecnológicas, biotecnológicas y biomédicas.
Antecedentes de la presente solicitud
Las nanopartículas, es decir las partículas que muestran dimensiones inferiores a un micrómetro han atraído un gran interés tanto en investigación como en industria debido.a las propiedades especificas que muestran en relación con su tamaño nanoscópico. La incorporación de nanopartículas en aplicaciones tecnológicas ha pennitido el desarrollo y mejora de nuevos productos que abarca desde dispositivos opto-electrónicos hasta sofisticadas sondas inteligentes empleadas en aplicaciones biomédicas [1, 2].
En particular, los nanomateriales luminiscentes poseen cualidades ideales para futuras aplicaciones en señalización y detección. Entre los mas destacados podemos encontrar los derivados de metales semi-conductores conocidos como "quantum dots" (literalmente traducido como "puntos cuanticos") y los nanocristales de sales de "tierras raras" que contempla según la IUPAC (Intemational Union of Pure Applied Chemistr y ) los elementos de la serie del lantano incluyendo los elementos del grupo tres (como por ejemplo el Sc, Y, La) [1-6].
Los nanomateriales luminiscentes son excelentes candidatos para aplicaciones biomédicas de señalización y detección ya que pueden ser inyectados de manera intradennal o intravenosa [6]. En particular se prefieren materiales que no produzcan daño a tejidos biológicos circundantes debido a su luminiscencia, que posean una baja auto-fluorescencia y una alta emisión que pennita penetrar y atravesar los tejidos, quc muestren baja o nula toxicidad. En este aspecto las propiedades de luminiscencia ofrecidas por los nanocristales de sales de lantánidos dopadas (NSLD) son ideales para aplicaciones biomédicas descartando el uso de altemativas basadas en quantum dots quc presentan niveles de toxicidad hasta de 1000 veces superior [6].
Desafortunadamente, los NSLD muestran una solubilidad muy baja en medio acuoso lo cual reduce el numero de aplicaciones y limita su uso para fines biomédicos y biológicos. Una gran ventaja contemplaría la síntesis de NSLD solubles en medio acuoso. Existen en la literatura trabajos recientes centrados en la producción de NSLD solubles en agua aunque de manera general este campo se encuentra todavía prácticamente inexploraoi1 [7]. También es interesante el trabajo de Jan W. Stouwdam y Frank C. J. M. van Vegg~r quienes ya han publicado la preparación de nanopartículas de LaF3 dopadas con Er 3\ Néf> Y H03 + las cuales muestran excelentes propiedades de luminiscencia pata innovadoras aplicaciones ópticas donde el silicio se comportaría como transparente [8]. Sin embargo, la síntesis de nanopartículas luminiscentes basadas en lantánidos todavía esta poco explorada. Diferentes aproximaciones ya han abordado su producción 'Y modificación mediante el uso de recubrimientos con el objetivo de mejorar sus propiedades y aumentar así su versatilidad. En este sentido la preparación de materiales. híbridos constituidos por la combinación de lantánidos junto con macromoléculas como polímeros, proteínas y anticuerpos han dado lugar a la producción de nuevos materiales luminiscentes y agentes de contraste para aplicaciones de resonancia magnetica [9-13].
Por otro lado los autores de la presente invención ya han publicado trabajos relacionados con la producción de materiales híbridos basados en la combinación de nanopartículas y biopolímeros que también han facilitado el desarrollo de una patente (P200900418) . Ert particular, el estudio de la interacción entre polímeros derivados de la elastina (PDE) y nanopartículas de oro ha dado lugar al desarrollo de sensores [14]. Los PDE son biopolímeros biocompatibles y biodegradables. Esto supone una ventaja a la hora de su utilización en aplicaciones biomédicas. Además, los rOE exhiben un comportamiento reversible de agregación-expansión de su estructura molecular en función de la variación de propiedades del medio como temperatura, pH, concentración iónica, entre otras [15, 16]. Los POE muestran en su fase condensada uno de los factores más relevantes de su naturaleza inteligente: auto-ensamblaje en función de múltiples estímulos. Oicha característica o propiedad has sido ya explotada para el desarrollo y creación de superficies inteligentes [17]. Los POE son además materiales que muestran una excelente biocompatibilidad tanto en disolución como entrecruzados en forma de hidrogeles [18]. Recientemente han sido publicadas aplicaciones de POE como vehículos de transporte y liberación controlada de fánnacos [] 9]. Oe manera paralela, la conceptualización de platafonnas de POE han sido hasta la fecha, una contribución sustanciosa para el avance de la medicina regenerativa a nivel de control del crecimiento y proliferación celular para la creación y reparación de tejidos [20]. Actualmente existen en la literatura un escaso número de biomateriales luminiscentes basados en NSLD a pesar de la gran versatilidad que presenta el uso de biopolímeros (como por ejemplo los PDE) como componentes de sistemas híbridos. Una gran ventaja contemplaría la síntesis de NSLD solubles en medio acuoso. Ademá~, . otra gran ventaja seria la producción de NSLD inteligentes que muestren una solubilidac.l reversible en medio acuoso con el fin de facilitar su aislamiento, purificación y dosificación en funcion de parámetros como la temperatura del medio.
Resumen de la presente invención
Nanopartículas luminiscentes que comprenden: a) un núcleo compuesto por una sal metálica luminiscente, opcionalmente dopada, seleccionada entre fluoruros y rodeada por: b) un revestimiento compuesto de un PDE
así como el procedimiento para la preparación de estas nanopartículas, comprendiendo dicho procedimiento una única etapa de preparación en medio homogéneo acuoso y a temperaturas inferiores a 75 oC.
También la presente invención contempla la naturaleza inteligente mostrada por las nanopartículas las cuales son capaces de auto-ensamblarse en forma de estructuras globulares-circulares yen función de la temperatura.
Figuras
La Figura 1 muestra la secuencia del POE de origen recombinante utilizado en el modo preferido de realización para funcionalizar las nanopartículas. Su estructura incluye la siguiente secuencia aminoacídica: C-[ (VPGVG) 2 (VPGEG) (VPGVG) z] 15 Donde las letras e, v, P, G, E cOITesponde con los aminoácidos cisteína, vaJina, prolina-. glicina y ácido glutámico, respectivamente.
La Figura 2 muestra una disolución incolora de nanopartículas luminiscentGs funcionalizadas (derecha) junto a una muestra de referencia que contiene agua (izquierda) .
La Figura 3 muestra una disolución turbia que contiene nanopartículas luminiscentes funcionalízadas en una fase condensada fonnada por el auto-ensamblamiento de Iél'> nanopartículas inducido por la temperatura (derecha) junto a una muestra de referencia que contiene agua a la misma temperatura (izquierda) .
La Fibrura 4 muestra un difractograma de rayos X obtenido para las nanopartículas luminiscentes funcionalizadas y que reproduce índices de Miller comparables a aquellos obtenidos para la estructura cristalina de LaF 3.
La Figura 5 muestra una micrografia de electrónica de transmisión de las nanopartículas luminiscentes funcionalizadas. La barra de escala representa 20 nm.
La Figura 6 muestra los espectros de infrarrojos (FT-IR) de las nanopartículas luminiscentes funcionalizadas y del PDE.
La Figura 7 muestra un análisis te11110gravimétrico (TGA) obtenido para las nanopartículas luminiscentes funcionalizadas llevado a cabo bajo atmósfera de nitrógeno.
La Figura 8 muestra una estructura globular que representa la capacidad de autoensamblaje mostrada por nanopartículas luminiscentes funeionalizadas obtenida mediante la técnica Cr y o-TEM. La barra de escala corresponde con 200 nm. La Figura 9 muestra una estructura globular que representa la capacidad de autoensamblaje mostrada por nanopartículas luminiscentes funcionalizadas obtenida mediante la técnica Cr y o-TEM. La balTa de escala corresponde con 200 11m.
La Figura 10 muestra Ul1a distribución unifonne de nanopartículas luminiscentes funcionalizadas tomada a baja temperatura (4 oC) y obtenida al descongelar la muestra analizada en la Figura 8 y 9 (tomada a 40 OC) donde no se observan las caracteristicas estructuras globulares observadas a alta temperatura (Figura 8 y 9) . La micrografía fu~ obtenida mediante la técnica Cr y o-TEM. La barra de escala corresponde con 200 nm.
La Figura 11 muestra el espectro de excitación obtenido para las nanOPaliícula.". luminiscentes funcionalizadas dentro del rango de longitudes de onda entre 300 y 550 nm.
La Figura 12 muestra el espectro de emlSlon obtenido para las nanopartículas luminiscentes funcionalizadas dentro del rango de longitudes de onda entre 500 y 700 nm.
Descripción detallada de la presente invención
Las partículas luminiscentes, en particular, las nanopartículas foto-luminiscentes que son objeto de la presente invención comprenden un núcleo hecho de sal metálica inorgánica luminiscente, opcionalmente dopada, seleccionada entre t1uoruros de sales de tierras raras. Las nanopartículas descritas en la invención están caracterizadas por su propiedad de luminiscencia, la cual pennite posterior a la absorción de energía (por ejemplo en fOllna de electrones, fótones ... etc) se produzca un fenómeno de emisión energética en forma de luz de menor intensidad que la radiación absorbida. Se debe de entender que el témlino "luminisccnte" incluye la propiedad mas específica y preferida que se corresponde con foto-luminiscente. La fotoluminiscencia se entiende como la capacidad la sal metálica inorgánica de absorber unidades discretas de energía de una longitud de onda determinada y emitir energía en fonna de luz de longitud de onda mayor y por lo tanto menor energía. El periodo de tiempo de emisión de luz se pude corresponder a tiempos de vida del estado excitado que para las sales de lantánidos puede llegar al orden de milisegundos (pqr ejemplo 1-20ms) . El dopante se corresponde con un metal que se encuentra en proporcIOnes relativas respecto a los principales componentes de la nanopmiícula metálica. La cantidad de dopantc que constituyen las nanopmiículas luminiscentes debe de estar dentro de un margen mínimo y máximo. Cuando se excede este límite superior se puede producir un fenómeno de desactivación de la luminiscencia por concentración que esta directament~ relacionado con la distancia entre átomos dopantes en la estructura reticular: Preferiblemente este material dopantc no debe de suponer una cantidad superior al 20 % en moles de la composición de la nanopartícula. El tipo de metal dopante a incorporar debe de ser capaz de convertir los fotones absorbidos en radiación luminiscente. Así pues, se pueden usar metales de transiciól1, como el Cr, Ag, Cu, Co, Mn, aunque se prefiere el uso de metales lantánidos puesto qu~ la luminiscencia mostrada por los lantánidos es particulannente independiente del entorno reticular donde se ubica. Generalmente se prefiere el uso de metales lantánidos divalentes o trivalentes (estado de oxidación II y III respectivamente) y preferiblemente el estado de oxidación III como por ejemplo el Eu 3+ ya que emiten luz en fonna de bandas relativamente estrechas respecto de los divalentes que muestran una absorción relativamente fuerte pero unas bandas de emisión relativamente mas anchas.
La síntesis de nanopartículas cristalinas funcional izadas se llevó a cabo basándose en el método utilizado por Wang y col. modificado por los autores de la presente invención [4]. La síntesis del POE utilizado en el modo de realización preferido ya ha sido descrita en la literatura por los autores de la presente invención [15]. La estructura del POE utilizado en el modo de realización preferido de la invención está incluido en la Figura 1
y COtTcsponde con la siguiente secuencIa aminoacídica C[ (VPGVGh (VPGEG) (VPGVGh] 15 donde las letras C, V, P, G, Y E correspondcn con los aminoácidos cisteína, valina, prolina, glicina y ácido glutámico respectivamente. La síntesis de las nanopartículas luminiscentes funcionalizadas objeto de la presente 5 invención se obtuvieron sib'1liendo los siguientes pasos. Se disolvieron las sales La (N03h
(0.20 g, 4.635 x 10-4 M) , EuCh (8.3 mg, 2.265 x 10-5 M) en 2 mL de agua y después se añadió una disolución acuosa de POE (30.0 mg, 9.4 x 10-7 mol en I mI de H20) . La disolución resultante fue agitada a 75 oC unos minutos (por ejemplo 5 minutos) . Posterionnente, se aí1adió 1 mL de una disolución acuosa de NH4F (62.7 mg, 1.49 x 10-3 10M) manteniendo la agitación. Los reactivos son solubles en medio acuoso, luego no e's necesario el uso de co-disolventes ni de agentes de transferencia de fase para que la: reacción y el crecimiento cristalino tengan lugar. La disolución resultante fue agitada durante 2 horas a 75 oC. Posterionnente, la fase acuosa de la reacción fue decantada del resto de los productos de reacción constituidos principalmente por sólidos blancos de 15 aspecto cristalino. La disolución decantada incolora contiene las nanopartícula~ luminiscentes y íüeron purificadas mediante un proceso de centrifugación a bajfl' temperatura para eliminar partículas sólidas no solubles en la fase acuosa. En est~ aspecto cabe destacar que las disoluciones de las nanopartícula luminiscentes funcionalizadas son incoloras a baja temperatura (como por ejemplo a 4 ° C) como 20 muestra la Figura 2. La centrifugación se llevó a cabo durante 10 minutos a 10.000 rpm y a 4 oc. A continuación se procedió con las siguientes etapas de purificación qu~ comprendieron con tres ciclos de precipitación-centrifugación-redisolución. Un ciclo comIenza con la precipitación de las nanopartículas luminiscentes funcionalizadas presentes en la fase acuosa. La precipitación se llevó a cabo a 40 oC ya pH ácido donde 25 el producto fonna una fase condensada como la mostrada en la Figura 3. Posteriom1ente esta disolución condensada fue centrifugada (10 minutos, 10.000 rpm y a temperatura de 40 OC) donde se separaron las nanopartículas luminiscentes funcionalizadas del resto de la fase acuosa que contiene impurezas solubles en el disolvente. Entonces como ultima etapa del ciclo se separaron la parte acuosa que contiene impurezas de la parte sedimentada que contiene las nanopartículas luminiscentes funcionalizadas por decantación. En la ultima etapa del ciclo, el producto final sedimentado por centrifugación fue disuelto en agua fria Después de tres ciclos de precipitación
centrifugación-redisolución, las nanopartículas luminiscentes funcionalizadas fueron purificadas mediantc diálisis frentc a agua ultrapura. La diálisis de las nanopartículas luminiscentes funcionalizadas fuc llevada a cabo durantc 48 horas (tripas de diálisis 1214000 Oalton) . Las nanopartícula luminiscentes funcionalizadas fueron obtenidas como un sólido de aspecto algodonoso de color blanco y con reflejos cristalinos después de la liofilización dc la disolución dializada. La estructura y composición de las nanopartículas fue analizada por difracción de rayos X (Figura 4) . El difractograma obtenido muestra máximos atribuibles a los Índices de Miller o planos de reflexión correspondientes a la red cristalina del LaF3 [4]. Las micrografías electrónicas de transmisión (TEM) de las nanopmiículas luminiscentes funcionalizadas se corresponden con partículas amorías de un tamaño comprendido entre 5 nm y 20 nm (Figura 5) . Las partículas mostradas en la Figura 5 sugieren que el POE actúa como monocapa estabilizante que impide la fonnación de agregados de mayor tamaño. El análisis de espectroscopia infrarroja (FTIR) llevado a cabo para las nanopartículas luminiscentes funcional izadas muestra las bandas de absorción características del material de partida POE (Figura 6) . La cantidad de POE inmovilizado sobre la superficie de las nanopmiículas fue estimado mediant? TOA (análisis tennogravimétrico) . Mediante TOA se detectó que el contenido de POE en las nanopartículas luminiscentes era de un 20 % en peso (Figura 7) . La capacidad de auto-ensamblaje mostrada por las nanopartículas luminiscentes fue analizada por microscopía electrónica mediante la técnica Cr y o-TEM. En la Figura 8 puede observarse que las nanopartículas luminiscentes funcional izadas se encuentran agregadas en forma de estructuras globulares a temperaturas superiores a 25 grados (como por ejemplo a 4~) OC) . Las Figuras 8 y 9 muestran micrografías de las nanopartículas tomada a 40 oC donde puede observarse que las nanopmiículas luminiscentes se auto-ensamblan en estructuras globulares de sección transversal en la escala submicro-métrica, preferiblemente en estructuras de sección transversal inferior a 700 nm. Las estructuras globulares no se observaron para las mismas muestras una vez descongeladas y analizadas a 4 oc como muestra la Figura 10 debido a que la capacidad de autoensamblaje de las nanopmiículas es función de la temperatura. Por 10 tanto, a baja temperatura las nanopartículas no están auto-ensambladas y se observan distribuidas de manera unifonne. La capacidad de auto-ensamblaje mostrada por las nanopartículas puede atribuirse totalmente al rOE utilizado en el modo preferido de realización. Este fenómeno reviste gran interés como un método de preparación y dosificación de nanopartículas luminiscentes en porciones discretas y en tamaños submicro-métricos.
Por otro lado, la preparación de materiales que muestran geometrías globulares de tamaílo nanométrico en la tase condensada (tanto micelas como vesículas) son también interesantes para el desarrollo de nano-vehículos de transpotie y descarga en aplicaciones biomédicas. Actualmente existe un numero creciente de materiales poliméricos tanto recombinantes [19], como sintéticos (copolímeros en bloque) [21-23] que presentan una altemativa muy ventajosa con respecto al tradicional uso de liposomas [24J en la conceptualización de nuevas plataformas de transpOtie biocompatibles que exhiben dimensiones por debajo de la escala submicro-métrica. Es este sentido, la obtención de materiales capaces de actuar como nano-contenedores presenta una gran perspectiva en el desarrol1º de terapias basadas en la transferencia de: material genético, fánnacos o nano-dispositivos; así como la creación de membranas artificiales, nano-reactores y biosensores [19, 25-28]. Además, las nanopatiículas objeto de la presente invención son foto-luminiscentes y muestran excelentes propiedades ópticas tanto de excitación (Fib'Ura I 1) en el rango de longitudes de onda entre 300 y 550 nm como de emisión (Figura 12) en el rango de longitudes de onda entre 500 y 700 nm. El objetivo de la presente invención se alcanza con una sonda de detección para aplicaciones biológicas y biomédicas la cual está basada en nanopatiiculas luminiscentes funcionalizadas constituidas por un núcleo inorgánico y un PDE que muestra la siguientes propiedades. luminiscencia, solubilidad en agua y capacidad de auto-ensamblarse en función de la temperatura.
DESCRIPCIÓN DE LOS MODOS DE REALIZACIÓN ALTERNATlVOS DE LA INVENCIÓN
Habiéndose descrito la invención con respecto a los modos de realización preferidos actualmente, la invención no queda limitada por ellos. Existen altemativas para los diversos elementos que constituyen las nanopartículas luminiscentes como se describe a continuación. Estas altemativas se pueden emplear individualmente o en consonancia con otras variantes.
I-Nanopartícula con núcleo de sales de tierras raras Las nanopartículas son generalmente partículas de tamaños nanoscópicos y que pueden mostrar geometrías variadas como octaedros, esferas, cilindros .. etc. Los autores de la presente invención han obtcnido nanopartículas amorías. La f0l111a pucdc cubrir todas las posibilidades indicadas para nanopartículas. Tal y como aquí se utiliza el término, por partícula se entiende las de un tamaño de 500 nm o inferior, preferiblemente entre I y 30 nm y mas preferiblemente entre 5 y 20 nm. Se puede utilizar una serie de sales como núcleo de las nanopartículas. El material preferido en la presente invención son sales de elemento de la serie del lantano. De manera altel11ativa, el metal puede seleccionarse entre otros metales denominados tierras raras y que constituyen el grupo III como por ejemplo el Sc yel Y o los metales de la serie de los lantánidos (como por ejemplo: Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb) .
2. El PDE (polímero derivado de elastina) La matriz polimérica que se une a la superficie derivada del núcleo de la nanopartícula es una característica importante del modo de realización preferido de la invención. Se prefiere una secuencia aminioacídica del tipo VPGXG donde V, P Y G corresponden cm;:! los aminoácidos valina, prolina, glicina respectivamente y X corresponde con cualquier aminoácido.
En el modo preferido de realización de la invención se ha seleccionado por grupo X el aminoácido acido glutámico. Sin embargo, no hay que entender que se excluye del marco de la presente invención otros aminoácidos (como por ejemplo los aminoácidos lisina yacido aspártico) .
La secuencia aminoacídica expresada en el modo preferido de realización de la presente invención corresponde con la repetición de las secuencias pentapeptídicas (VPGVG) y (VPGXG) . Sin embargo, tampoco se excluye del marco de la presente invención otras secuencias aminoacídicas pentapeptídicas ni de las combinaciones o repeticiones de las mismas que conlleve estructuras diferentes y pesos moleculares variados.
La síntesis del PDE utilizado en el modo preferido de realización de la invención se ha llevado a cabo mediante técnicas recombinantes. Sin embargo, no se excluyen del marco de la presente invención la síntesis de PDE a través de técnicas de síntesis tradicionales.
Las propiedades inteligentes atribuidas al PDE corresponden con sensibilidad a temperatura. Sin embargo, no se excluyen del marco de la presente invención otras propiedades que pueda mostrar el PDE y que no hayan sido consideradas dentro del modo preferido de realización de la invención como son por ejemplo la modificación del estado de agregación del PDE en función del pH o en función de la concentración de iones del medio.
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