Procedimiento para la detección de adulteraciones en aceites de oliva con aceites de semilla (soja y girasol) basado en la determinación de trigonellina por Electroforesis Capilar.
El procedimiento analítico propuesto permite la identificación y la cuantificación de trigonellina en semillas (girasol y soja) y sus aceites empleando la técnica de Electroforesis Capilar (CZE) con detección UV. Este procedimiento también permite establecer la ausencia de trigonellina en aceituna (Picual, Hojiblanca y Arbequina) y aceites de oliva virgen (Picual, Hojiblanca y Arbequina) . Teniendo en cuenta que la mezcla de aceites de oliva con aceites de semillas no está permitida por la legislación vigente, este procedimiento supone un gran avance por la posibilidad de emplear un solo compuesto, trigonellina, como marcador de posibles adulteraciones de aceite de oliva con aceites de semillas (girasol y soja) con el fin de evaluar la calidad de los aceites de oliva, así como para evitar fraudes económicos. Asimismo, permite evaluar la seguridad por la potencial presencia de algunos alérgenos en otros aceites vegetales (p. ej. soja) .
Estado de la técnica
El aceite de oliva es conocido, valorado y producido principalmente en la cuenca Mediterránea desde tiempos remotos y se extrae de los frutos de aceitunas que crecen en los olivos Olea europea L. [1]. Hoy en día, en el mercado se pueden distinguir numerosos tipos de aceites de oliva: aceites de oliva virgen que se clasifican según su grado de acidez y se obtienen mediante un tratamiento físico (prensado o centrifugación) que permite separar el aceite de la aceituna triturada, aceites refinados (de oliva o de orujo) que se obtienen mediante un proceso químico (extracción con disolventes) y el aceite de oliva que se obtiene al mezclar aceite de oliva virgen con aceite de oliva refinado [2, 3]. El aceite de oliva más apreciado y de mayor precio en el mercado es el aceite de oliva virgen extra.
La importancia de los aceites de oliva, y en particular el aceite de oliva virgen extra, se ha puesto de manifiesto en numerosas publicaciones, donde el consumo de este producto se ha relacionado con beneficios para la salud humana. Así, se ha publicado que el aceite de oliva contribuye a reducir el colesterol en plasma [4, 5] y tiene propiedades antioxidantes [1] además de otros beneficios más generales [6]. También se ha investigado su acción protectora frente al cáncer de mama [7-10], al carcinoma colorectal [11] o a enfermedades cardiovasculares [12, 13].
Debido a que el aceite de oliva virgen extra es uno de los aceites más caros de origen vegetal, ha sido objeto de adulteraciones para incrementar los beneficios económicos de los fabricantes. El método más común de adulteración consiste en añadir al aceite de oliva aceites más baratos. Entre ellos, los más comunes son los aceites de girasol o soja. Además, la adulteración del aceite de oliva con aceites de semilla afecta la seguridad alimentaria porque existen aceites de materias primas, como p. ej. la soja, que tienen un conocido potencial alergénico y pueden afectar a la salud del consumidor si se añade fraudulentamente. De hecho, en la normativa vigente se prohíbe concretamente la mezcla de aceite de oliva con los de semillas o con cualquier otro aceite o grasa [14]. Por ello, es necesario desarrollar aproximaciones analíticas que permitan determinar la posible adulteración de los aceites de oliva con aceites de semillas.
El aceite de oliva tiene una composición compleja porque contiene numerosos constituyentes de diversa naturaleza. A grandes rasgos, la composición del aceite de oliva virgen se puede dividir en dos fracciones: (i) una fracción saponificable que forma la mayor parte del aceite, entre el 98.5 y el 99.5%, compuesta por triglicéridos, ácidos grasos, ceras y fosfolípidos y (ii) una fracción no saponificable que solo representa entre el 0.5 y el 1.5% del aceite. Esta última fracción está compuesta por hidrocarburos, tocoferoles, alcoholes grasos, esteroles, compuestos fenólicos, pigmentos y compuestos volátiles y aromáticos. La autenticidad de los aceites de oliva se ha estudiado mediante técnicas cromatográficas determinando ácidos grasos, triglicéridos, esteroles, tocoferoles y tocotrienoles [15]. Por otro lado, estudios recientes confirman que, entre los componentes minoritarios del aceite, existen péptidos y proteínas que se transfieren de las semillas o frutos al aceite [16, 17]. Además, hay un trabajo donde se estudian perfiles de aminoácidos proteicos para clasificar aceites vegetales según su origen botánico utilizando espectrometría de masas [18]. Sin embargo, aunque se ha confirmado la presencia de aminoácidos no proteicos libres en diversas semillas alimenticias [19-21], no existen antecedentes que estudien la presencia de éstos en los aceites obtenidos de estas semillas.
La trigonellina es un aminoácido no proteico con un grupo amino cuaternario que le proporciona una carga positiva permanente. La trigonellina también es una betaína. Las betaínas son osmorreguladores naturales de muchas plantas y están presentes en un gran número de alimentos. Además, las betaínas han sido objeto de estudio en varias investigaciones por sus efectos biológicos potencialmente positivos en humanos. La trigonellina se ha determinado en un amplio número de alimentos como frutas, cereales, verduras, bebidas, carne, marisco y productos lácteos mediante Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC) tras su derivatización con sulfonato de 2-naftilo trifluorometano [22, 23], En la gran mayoría de ellos, la trigonellina se encontró en concentraciones muy bajas (p.ej. chocolate) o no detectables (p.ej. aceite de oliva) , para un límite de detección de 1 μg/g, mientras que se encontraron concentraciones elevadas de trigonellina en granos de café, lentejas y garbanzos. Esto ha sido corroborado en otros artículos donde el contenido de trigonellina en la planta de lentejas fue determinado mediante HPLC tras su derivatización con fenilisotiocianato (PITC) [20, 24], En granos de café, donde se encuentra el mayor contenido en trigonellina, se ha determinado mediante HPLC [25-31], HPLC acoplada a Espectrometría de Masas (MS) [32], Cromatografía de Gases (GC) [33], GC-MS [34] y MS [35]. La trigonellina también se ha encontrado en cantidades considerables en semillas de soja tras su determinación espectrofotométrica en un espectrómetro UV [36] o mediante HPLC tras su derivatización con PITC [37].
El objetivo de esta invención es el desarrollo de un procedimiento por CE con detección UV que permita estudiar trigonellina, en semillas (girasol y soja) , frutos (aceitunas) y sus respectivos aceites, con el fin de proponer por primera vez este compuesto como marcador de adulteraciones de aceite de oliva con aceites de semillas.
Descripción de la invención
El procedimiento para la determinación de trigonellina por CE se basa en un medio de separación ácido realizado en un equipo de electroforesis capilar HP3DCE equipado con un detector ultravioleta-visible (UV-Vis) de diodos en serie (DAD) .
TABLA 1 Resumen del procedimiento de determinación de trigonellina por CE 
Determinación cuantitativa de trigonellina en semillas de girasol y soja y sus aceites
El procedimiento se aplica a la cuantificación de trigonellina en semillas de soja, semillas de girasol, aceite de girasol y aceites de soja. Los resultados confirman la presencia de trigonellina tanto en las semillas de soja y girasol como en sus respectivos aceites. De esta forma se establece la trazabilidad de trigonellina desde la semilla hasta su aceite. En la Figura 1 se muestra el electroferograma correspondiente a las semillas de soja y girasol mientras que en la Figura 2 se muestran los perfiles electroforéticos obtenidos para los aceites de semillas estudiados (girasol refinado, soja refinado y virgen) . Se observa que el pico de trigonellina se encuentra separado del resto de componentes de la matriz por lo que el método es selectivo a la hora de identificar y cuantificar el analito de interés. Para la identificación de trigonellina se obtienen los espectros UV de los picos y se comparan con el espectro UV de trigonellina patrón. También se enriquece la muestra con una disolución patrón de concentración conocida para observar el aumento del pico asignado a trigonellina según su espectro UV.
Para la determinación de trigonellina se inyectan las muestras sin enriquecer y enriquecidas con cuatro niveles de calibrado, se realiza una recta de calibrado representando las áreas corregidas (Ac) del pico de trigonellina en función de la concentración añadida y conocida de ésta. Esta recta se extrapola hasta cortar el eje de ordenadas (y = 0) para determinar la concentración de trigonellina en la disolución inyectada y se consideran las diluciones realizadas para conocer la concentración de trigonellina en la muestra analizada. La Tabla 2 muestra las concentraciones obtenidas para las semillas (girasol y soja) y los aceites de estas semillas. Las semillas de girasol presentan mayor contenido en trigonellina que las semillas de soja, al igual que sus correspondientes aceites refinados. El aceite de soja virgen tiene más concentración de trigonellina que el aceite refinado, hecho que puede deberse a que en el proceso de refinamiento el aceite se extrae con disolventes orgánicos poco selectivos con compuestos iónicos como la trigonellina.
TABLA 2 Cantidades determinadas de trigonellina para las semillas y aceites analizados 
Análisis de aceitunas y aceites de oliva virgen. Propuesta de trigonellina como marcador de adulteraciones de aceites de oliva con aceites de semillas (girasol y soja)
Se estudian aceitunas de tres variedades (Picual, Hojiblanca y Arbequina) y aceites de oliva virgen extra de las mismas tres variedades de aceituna. Al analizar estas muestras por el procedimiento inventado, no se detecta trigonellina. En la Figura 3 se muestra el perfil electroforético obtenido para una muestra de aceituna (variedad Picual) y los perfiles obtenidos para las tres variedades de aceites de oliva virgen extra (Picual, Hojiblanca y Arbequina) . Como la trigonellina no se detecta en los aceites de oliva virgen extra ni tampoco en la aceituna, que en caso de estar presente estaría en mayor concentración, se propone esta betaína como marcador novedoso de adulteraciones de aceites de oliva con aceites de semillas (girasol y soja) . De hecho, como el límite de detección es de 1 ng/g (referido a 0.3 mL de disolución y 40 g de muestra) y la mínima cantidad de trigonellina detectada en aceites es de 10 ng/g (aceite de soja refinado) , en el caso más desfavorable el procedimiento permitirá detectar adiciones de aceite de soja a aceite de oliva virgen de tan solo el 10% del aceite de oliva analizado.
Ventajas principales del procedimiento
Las ventajas principales del procedimiento inventado son las siguientes:
- El procedimiento objeto de la invención es sencillo porque utiliza una separación electroforética en medio ácido y detección UV sin necesidad de llevar a cabo un paso previo de derivatización.
- El procedimiento desarrollado permite identificar la trigonellina a través de su espectro UV y a través del enriquecimiento con un patrón.
- El procedimiento desarrollado permite separar el pico de trigonellina del resto de picos de la matriz analizada en unos 15 min.
- El procedimiento desarrollado permite determinar el contenido de trigonellina en las semillas se soja y girasol y sus respectivos aceites permitiendo establecer relaciones de trazabilidad aceite-semilla al estar presente la trigonellina en ambos tipos de muestra.
- El procedimiento desarrollado pone de manifiesto la ausencia de trigonellina en aceituna (Picual, Hojiblanca y Arbequina) y en aceite de oliva virgen extra de estas tres variedades de aceituna, siendo una herramienta valiosa para los laboratorios de control de calidad porque la trigonellina puede emplearse como nuevo marcador de adulteraciones de aceites de oliva virgen con aceites de semilla (girasol y soja) .
Descripción de las figuras
Figura 1. Perfil electroforético obtenido para semillas de girasol (A) y soja (B) . Los espectros UV de los principales picos también se muestran. Condiciones experimentales: BGE, 0.1 M formiato amónico pH = 2.0; capilar de sílice fundida, 75 cm (66.5 cm a la ventana de detección) x 50 μm ID; temperatura, 35ºC; voltaje, 25 kV; inyección por presión a 50 mbar x 15 s. Muestras disueltas en acetonitrilo:agua (40:60, v/v) . El asterisco señala la posición del pico de trigonellina.
Figura 2. Perfil electroforético obtenido para aceites de girasol y soja diluidos 1/2 sin enriquecer y muestras enriquecidas con 0.025 mM de trigonellina patrón: (A) aceite de soja virgen; (B) aceite de soja refinado; y (C) aceite de girasol refinado. Condiciones experimentales: inyección por presión a 50 mbar x 50 s y demás condiciones experimentales como en la Figura 1. El asterisco señala la posición del pico de trigonellina. El espectro UV de los picos de trigonellina también se muestra.
Figura 3. (A) Perfil electroforético obtenido para una muestra de aceituna (variedad Picual) diluida 1/10 en acetonitrilo/agua (40:60, v/v) , sin enriquecer y enriquecida con 0.025 mM de trigonellina patrón; y (B) perfil electroforético obtenido para tres variedades de aceites de oliva virgen extra a) Picual, b) Hojiblanca, c) Arbequina, y d) Hojiblanca enriquecida con 0.05 mM de trigonellina patrón. Condiciones experimentales de la Figura 2. El asterisco señala la posición del pico de trigonellina no detectado.
Modo de realización
Preparación de patrones y muestras
La preparación de las disoluciones patrón se realiza a partir de una disolución inicial de trigonellina 10 mM en acetonitrilo/agua (40/60) que se diluye hasta la concentración requerida.
Se emplean distintos tratamientos de muestra dependiendo de la complejidad de la muestra analizada: (i) las semillas de girasol, las semillas de soja y las aceitunas se someten a una extracción sólido-líquido con disolventes. Se muelen, se homogenizan y se pesan (10 g) . Se extraen con 40 mL de metanolxloroformo (67:33, v/v) , se agita vigorosamente y se deja una noche a -20ºC antes de centrifugar a 11000 g durante 15 min. El sobrenadante se recoge y el residuo se lava con 25 mL de metanol/cloroformo/agua (53:26:21, v/v/v) . El sobrenadante obtenido se combina con el recogido previamente y se añaden 10 mL de cloroformo y 10 mL de agua y se centrifuga. La fase acuosa se recoge y se lleva a evaporar hasta sequedad. El residuo obtenido se reconstituye en 300 μL de acetonitrilo/agua (40:60, v/v) . (ii) Los aceites vegetales y aceites de oliva virgen extra se someten a una extracción líquido-líquido. Se pesan 40 g y se mezclan con 160 mL de metanol:cloroformo (67:33, v/v) , se agita vigorosamente y se deja una noche a -20ºC antes de centrifugar a 4000 g durante 15 min. La fase acuosa se recoge y la fase orgánica (abajo) se lava con 100 mL de metanol/cloroformo/agua (53:26:21, v/v/v) recogiendo el sobrenadante y añadiéndolo con la fase acuosa previamente obtenida. A esta fase se añaden 100 mL de agua y 40 mL de cloroformo, se centrifuga y se recoge la fase acuosa que se lleva a evaporar hasta sequedad. El residuo obtenido se reconstituye en 300 μL de acetonitrilo/agua (40/60) .
Los extractos de las muestras se congelan hasta su análisis. Antes de su inyección en el sistema de CE se descongelan y se centrifugan en un eppendorf durante 2 min.
Características analíticas del procedimiento
Las características analíticas evaluadas para el procedimiento objeto de la invención son la linealidad, los límites de detección y de cuantificación y la precisión (instrumental e intermedia) .
La linealidad se comprueba en el intervalo de concentraciones de trabajo de 0.025-1 mM de trigonellina inyectada por triplicado tanto para 15 s como para 50 s de inyección.
Los límites de detección se determinan inyectando 15 s o 50 s de una disolución de trigonellina patrón y calculando una relación señal/ruido de 3. Los valores obtenidos son 3.3 μM (0.46 mg/L) y 0.9 μM (0.13 mg/L) , respectivamente. Para los límites de cuantificación se considera una relación señal/ruido de 10 y se obtienen valores de 8.3 μM (1.15 mg/L) y 3.0 μM (0.42 mg/L) para las inyecciones de 15 s y 50 s, respectivamente.
La precisión se expresa como la desviación estándar relativa en % (RSD) , de los tiempos de migración y de las áreas corregidas (Ac=Ai/ti donde Ai corresponde al área de pico y ti al tiempo de migración del pico) , resultantes de inyectar una disolución de trigonellina patrón 0.25 mM durante 15 s o 50 s, respectivamente. Los valores de precisión se evalúan en términos de repetibilidad instrumental y precisión intermedia (ver tabla 3) .
TABLA 3 Precisión del procedimiento desarrollado para la determinación de trigonellina por CE 
El procedimiento inventado es aplicable a la cuantificación de trigonellina en semillas de girasol y soja y sus respectivos aceites. La cuantificación se lleva a cabo utilizando el método de adiciones patrón, que consiste en añadir concentraciones conocidas de trigonellina (0.25, 0.50, 0.75 y 1 mM) a la muestra y calcular por extrapolación la cantidad de trigonellina en las muestras. Este método de cuantificación se emplea porque se comprueba, mediante comparación de las pendientes obtenidas por el método del patrón externo y adiciones patrón, la existencia de efectos de matriz, es decir, que la señal analítica para trigonellina se ve afectada por los demás componentes de la muestra.
Aplicación industrial
Tanto a los fabricantes como a la Administración les interesa que existan procedimientos analíticos rápidos y simples que permitan el control de calidad y seguridad de los aceites de oliva virgen extra, que son productos producidos principalmente por España a nivel mundial. El novedoso empleo de trigonellina como marcador de adulteraciones de aceites de oliva con aceites de semilla (girasol y soja) permite realizar un control de calidad del aceite de oliva de forma rápida y sencilla.
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