2. Requiere de personal altamente especializado. La realización de la técnica se basa en la utilización de dos aproximaciones experimentales previamente descritas pero nunca aplicadas al diagnóstico de mutaciones del gen LRRK2.
La primera técnica previamente descrita es la introducción de mutaciones adicionales en la secuencia del primer directo en el extremo 3' en la posición tercera contando desde ese mismo extremo. Teniendo en cuenta que el primer debe diseñarse de forma que la mutación que se quiere analizar quede en ese extremo 3', la adición de una mutación más en la posición tercera hace que la especificidad del primer aumente de manera notable de forma que con esa modificación adicional el primer es altamente específico y permite la diferenciación entre el genotipo silvestre y el genotipo mutante.
La segunda técnica es la inclusión en uno de los primeros correspondiente al alelo en cuestión de una cola rica en "GC" de forma que el producto generado de PCR tenga una temperatura de desnaturalización mayor y pueda ser analizado en la misma carrera mediante la correspondiente curva de desnaturalización. La unión de las dos técnicas previamente indicadas permite la realización de todo el proceso en una sola carrera mediante un PCR de tipo multiplex.
Ambas aproximaciones han sido previamente descritas por el grupo de Papp AC y colaboradores y publicadas en la revista Biotechniques. 2003 May;34 (5) :1068-72.
Descripción de la invención
La presente invención incluye la posibilidad de desarrollar dos tipos distintos, aunque complementarios de productos:
Prototipo tipo A: Desarrollo de una placa de diagnóstico comprensiva de las mutaciones G2019S; R1441C/G/H y sus respectivos controles. Permitiría el diagnóstico de hasta 12 pacientes de una sola vez, en un único análisis y con una duración aproximada del mismo de unas 2 horas y en un solo paso (Fig. 1) . El dispositivo sería optimizado para partir de DNA obtenido tanto mediante procedimientos invasivos (muestras sanguíneas) como no invasivos (frotis bucales) . Este sistema está más orientado hacia actividades de tipo asistencial y diagnóstico en hospitales.
Prototipo tipo B: Desarrollo de un sistema de diagnostico individual para cada una de las mutaciones. Cada kit incluiría todo lo necesario para poder diagnosticar la presencia de una mutación concreta (G2019S o R1441C/H/G) así como los controles necesarios a partir de una muestra individual de DNA procedente de sangre o frotis bucales. El ensayo podría llevarse igualmente a cabo en un tiempo no superior a 2 horas y en un único paso mediante la utilización de placas o tubos de reacción procedentes de cualquier fabricantes y adaptados a las características del equipo de PCR en tiempo real.
Características comunes a ambas propuestas son: la economía, la velocidad y la eficiencia.
Es el primer sistema de diagnóstico de mutaciones frecuentes relacionadas con la Enfermedad de Parkinson comercializado.
El sistema utiliza las siguientes tecnologías/materiales/productos que tendrían que ser proveídos por terceros participantes:
Para el Prototipo tipo A:
• Soporte plástico (placa de 96 well) .
• Fijado de los primeros en la placa.
• Polimerasas/dNTPs/Otros para la reacción en tiempo Real.
• Fluorocromo SYBR-green I.
Para el Prototipo tipo B:
• Polimerasas/dNTPs/Otros para la reacción en tiempo Real.
• Fluorocromo SYBR-green I.
Por parte de nuestro equipo se han diseñado un total de 12 secuencias de oligonucleótidos específicos, basados en la secuencia publica (traducción de leucine-rich repeat kinase 2 gene ID 120892) del gen LRKK2 humano accesible desde el GeneBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI) . Dichas secuencias son únicas y han sido diseñadas específicamente por nuestro equipo no existiendo copias de las mismas en ningún otro dispositivo o sistema de diagnóstico parecido.
(Tabla pasa a página siguiente)
La idea de sistema diagnóstico tal y como nos referimos en el prototipo A debe entenderse como "un sistema de diagnóstico in vitro basado en PCR en tiempo real utilizando SYBR green I como fluorocromo que permite el diagnostico de las mutaciones G2019S y R1441C/H/G del gen LRRK2 humano". El sistema consta de una placa de 96 pocillos que genotipa hasta 12 muestras procedentes de DNA humano ya sea obtenido a partir de sangre o de frotis bucales facilitando el genotipo completo (homocigótico silvestre, homocigótico mutante o heterocigótico) de cada una de las mutaciones indicadas para el paciente en cuestión.
La idea de sistema de diagnóstico tal y como nos referimos en el prototipo B debe entenderse como "un sistema de diagnóstico in vitro que permite la detección de una mutación aislada del gen LRRK2: G2019S, R1441C, R1441H o R1441G; basado en PCR en tiempo real utilizando el fluorocromo SYBR green I y que a partir de muestras procedentes de DNA humano ya sea obtenido a partir de sangre o de frotis bucales facilita el genotipo completo (homocigótico silvestre, homocigótico mutante o heterocigótico) de la muestra en cuestión".
Respecto de las secuencias de oligonucleótidos utilizados indicar que son secuencias específicas que permiten la detección mediante la técnica de PCR del genotipo concreto de la muestra analizada basado en una reacción de tipo multiplex, que en una única reacción indica el genotipo (homocigótico mutante, homocigótico silvestre o heterocigótico) de la muestra analizada. Los oligonucleótidos utilizados han sido modificados sintéticamente y su diseño es único, no derivan directamente de la secuencia del gen si no que se han introducido modificaciones en los mismos que son indispensables para alcanzar la sensibilidad deseada del método.
Ventajas Las ventajas de esta invención se desprenden de la presente memoria si bien a continuación se citan las ventajas más destacadas con carácter meramente enunciativo y no limitativo;
• Se pueden analizar doce muestras de una de las mutaciones en dos horas aproximadamente.
• Se puede emplear sangre o resultados de frotis bucal.
• Las secuencias de oligonucleótidos utilizados son secuencias específicas que permiten la detección mediante la técnica de PCR del genotipo concreto de la muestra analizada basado en una reacción de tipo multiplex, que en una única reacción indica el genotipo (homocigótico mutante, homocigótico silvestre o heterocigótico) de la muestra analizada.
Descripción de los dibujos
Para mejor comprensión de esta memoria se acompañan los dibujos adjuntos que muestran un ejemplo de realización, no limitativo, del objeto de la invención y en los que:
La figura nº 1, es un ejemplo del prototipo A, consistente en una placa cuyo fondo se divide en pocillos dispuestos en columnas desde la A a la H en donde se disponen los oligonucleótidos específicos de cada uno de los productos de PCR adsorbidos al fondo de la placa. Cada circulo representa un pocillo y la indicación de que tipo de primer debe estar adsorbido. El pocillo "G" contiene oligonucleotidos indicadores de "positivo" en cuanto a la reacción de PCR (β-actina humana) . El pocilio "H" no tiene ningún primer adsorbido, actúa como "control negativo" o "control de contaminación" de la reacción.
Las filas de la 1 a la 12 corresponden a cada uno de los pacientes/muestras que pueden analizarse en cada carrera.
El resultado del análisis mediante curva de desnaturalización del producto de PCR de cada una de las columnas es comprensivo del genotipo correspondiente a cada paciente, referido a las mutaciones G2019S y a las del codón 1441 R1441G/C/H.
La figura nº 2, es un ejemplo del resultado obtenido a partir de tres muestras independientes por triplicado que permite la detección del genotipo de la muestra en un solo paso con una fiabilidad y reproducibilidad muy elevadas.
Ejemplo de una realización preferente de la invención
Conforme a los diseños descritos, un ejemplo básico de realización aplicado a la detección de la mutación R1441G, implica la utilización de los siguientes oligonucleótidos.
Los tres oligonucleótidos se utilizan simultáneamente en una reacción de PCR en tiempo real con SYBR-green, que permite discriminar en cada reacción si el genotipo es homocigótico mutante, homocigótico recesivo o heterocigoto respecto de la mutación estudiada. Las condiciones del PCR en tiempo real básicas son:
mM MgC2
DMSO 5%
SYBR@ GREEN 1X
Annealing: 60ºC
Ciclos: 40
Una vez transcurrida la carrera se procede a realizar una curva de desnaturalización (melting curve) del producto de PCR entre 65ºC y 95ºC con intervalos de toma de temperatura del 1%.
Como muestras control se han utilizado preparaciones de plasmidos conteniendo fragmentos de entre 300 y 400 pares de bases del gen de LRRK2 humano. Dichos plasmidos han sido sintetizados artificialmente en un laboratorio externo y posteriormente secuenciados para garantizar la presencia de la mutación. A partir de las diluciones de plasmidos originales se han construidos moldes homocigotos mutantes, homocigotos silvestres y heterocigotos siempre de forma equimolar.
Aplicaciones de la invención
Desarrollo de una placa de diagnóstico comprensiva de las mutaciones G2019S; R1441C/G/H y sus respectivos controles. Permitiría el diagnóstico de hasta 12 pacientes de una sola vez, en un único análisis y con una duración aproximada del mismo de unas 2 horas y en un solo paso (Fig. 1) . El kit seria optimizado para partir de DNA obtenido tanto mediante procedimientos invasivos (muestras sanguíneas) como no invasivos (frotis bucales) . Este sistema está más orientado hacia actividades de tipo asistencial y diagnóstico en hospitales.
Desarrollo de un sistema de diagnostico individual para cada una de las mutaciones. Cada dispositivo incluiría todo lo necesario para poder diagnosticar la presencia de una mutación concreta (G2019S o R1441C/H/G) así como los controles necesarios a partir de una muestra individual de DNA procedente de sangre o frotis bucales. El ensayo podría llevarse igualmente a cabo en un tiempo no superior a 2 horas y en un único paso mediante la utilización de placas o tubos de reacción procedentes de cualquier fabricante y adaptados a las características del equipo de PCR en tiempo real. Inicialmente indicado para labores de investigación básica.
