d. realizar el genotipado del individuo. En la presente memoria se entiende como "identificación precoz del sexo" aquella que se realiza a cualquier edad del individuo a analizar con anterioridad a la maduración sexual.
Dado que las especies del género Scophthalmus son afines en cuanto a su evolución, la homología global de los genomas al nivel de la secuencia de nucleótidos es elevada. Esto ha permitido la amplificación del marcador microsatélite M-SmaSD, útil para la identificación del sexo en rodaballo, en otra especie del género Scophtthalmus de valor comercial, S. rhombus, denominado rémol o coruxo. Por tanto, aunque la presente invención se ejemplifica con individuos de la especie Scophthalmus maximus, los métodos que aquí se proporcionan podrían servir para la obtención de datos útiles y para el diagnóstico precoz del sexo en otras especies del género Scophthalmus, como por ejemplo pero sin limitarnos, Scophthalmus rhombus.
El término "Género", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la categoría de la clasificación biológica (categoría taxonómica) que comprende una o más especies relacionadas filogenéticamente y morfológicamente similares. También se espera que compartan, características bioquímicas y metabólicas similares. Por "categoría taxonómica" se entiende el nivel de jerarquía utilizado para la clasificación de los organismos. El término "filogenia" como aquí se usa se refiere a la relación histórica verdadera entre un conjunto de taxones.
En la presente memoria se entiende por individuo un organismo de cualquiera de las especies del género Scoph- thalmus, pez perteneciente a la familia Scophthalmidae, del orden Pleuronectiformes, de la clase Actinopterigios.
Una muestra biológica aislada incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin.
En una realización preferida de la invención, la muestra biológica aislada procede de la aleta caudal del individuo, entendiéndose como aleta caudal la aleta única vertical en la parte posterior del pez, en la cola. Para la amplificación del marcador microsatélite M-SmaSD se pueden diseñar numerosos cebadores. Sin embargo, cuando se diseñan cebadores es necesario hacer una serie de predicciones, como la temperatura de fusión (Tm) , la presencia de pares indeseables (a) o la posibilidad de formación de horquillas (b) que puedan reducir, por competencia, la efectividad de emparejamiento con la secuencia de ADN diana. Así pues, en otra realización preferida los cebadores para el marcador microsatélite M-SmaSD son los que se recogen en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.
La metodología empleada en la presente invención, se basa en el principio de "selección asistida por marcadores" que consiste en utilizar como criterio de selección una variable genética, en este caso marcadores moleculares, asociados a la característica de interés, en este caso el sexo. Se trata de identificar previamente en el genoma marcadores próximos a las regiones cromosómicas implicadas en la manifestación de caracteres de interés dentro de las familias. Estas regiones se llaman "QTL" o "Quantitative Trait Loci".
La contribución de estas regiones QTL que están involucradas en la expresión de un carácter se puede evaluar seleccionando genes candidatos (aquellos involucrados en la fisiología del carácter) . La secuencia de ADN de la región QTL candidata permite identificar marcadores que se encuentran en ella, o cerca de ella. Estos marcadores son entonces utilizados para posicionar a la región QTL en el mapa de ligamiento, y para establecer su asociación con el carácter de interés. Como ejemplo, si un marcador se identifica en una región QTL determinante del sexo, las diferentes formas del marcador (conocidas como alelos) se utilizan para establecer qué alelo del marcador genético está asociado al fenotipo correspondiente con el sexo femenino, y qué alelo está asociado con el fenotipo correspondiente al sexo masculino. Esta estrategia permite establecer el efecto de una región QTL en la expresión de un carácter productivo.
Para asociar un fenotipo a un alelo concreto del marcador asociado a la región determinante del carácter estudiado, se hace un análisis del marcador dentro de las familias, de los descendientes y/o ascendientes, para ello se establece por medio de técnicas de biología molecular, como por ejemplo, pero sin limitarnos, el análisis de fragmentos, qué alelos ha heredado de los progenitores cada miembro de la familia.
Los inventores han identificado una región genética o QTL implicada en la determinación sexual, que se recoge en la SEQ ID NO: 3. En concreto, han localizado el gen SmaSD (del inglés "Scophthalmus maximus sex determinant") , principal responsable de la determinación del sexo en la especie. A una distancia de 1 centimorgan de este gen se ha detectado un marcador microsatélite, M-SmaSD, cuyo motivo de repetición es (TA) n. Los autores de la presente invención han diseñado dos cebadores específicos de las secuencias adyacentes a este marcador (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) que permiten la amplificación por PCR de la secuencia recogida en la SEQ ID NO: 3.
Por tanto, un segundo aspecto de la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos de tipo microsatélite que se incluye en la secuencia SEQ ID NO: 3, capaz de ser amplificada por los cebadores cuyas secuencias se recogen en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, en el genoma de las especies del género Scophthalmus.
En esta memoria se entiende por "secuencia microsatélite" una región del genoma formada por repeticiones nucleotídicas de 1-6 pares de bases, que difiere de un genoma a otro en función del número de repeticiones, es decir, cuya longitud varía entre genomas, y que puede ser empleada como marcador, por permitir la discriminación entre individuos. El análisis de estos marcadores puede aplicarse, por ejemplo, a estudios de herencia familiar o al mapeo del genoma. En base a esto, dicha secuencia es utilizada en la invención para llevar a cabo el método descrito.
En esta memoria se entiende por "Quantitative Trait Loci" ó "QTL" aquella región del ADN cuya información genética es capaz de influenciar en la expresión de un carácter, en el individuo o en su descendencia. Por ello, como se ha explicado anteriormente, el análisis en individuos emparentados de un marcador microsatélite asociado a una región QTL, permite hacer un seguimiento familiar del carácter o caracteres influenciados por esta región y así asociar un determinado fenotipo a un alelo del marcador, de manera que dicho marcador puede ser usado en los planes de selección.
El método proporcionado por la presente invención permite analizar el marcador M-SmaSD, independientemente de la procedencia de las muestras. Dichas muestras pueden proceder, por ejemplo, pero sin limitarnos, de cualquier región de tejido epitelial que no afecte a la viabilidad del pez. La muestra una vez tomada es pretratada para poder llevar a cabo una PCR y un posterior análisis de los fragmentos obtenidos mediante el genotipado de los mismos.
En base a este marcador, los machos y las hembras presentan un genotipo distinto, y es precisamente esto lo que permite la discriminación entre sexos. Este genotipo además no es igual para todos los rodaballos, por lo que es necesario genotipar a cada individuo mediante el análisis del marcador M-SmaSD así como a otros parientes (los abuelos, los hermanos de la madre o a otros descendientes o ascendientes de la misma progenie analizada) , sexados con anterioridad, para identificar qué alelo de este marcador está asociado al sexo masculino o femenino en su progenie. El análisis de este marcador ha permitido también evidenciar que la determinación del sexo en las progenies depende únicamente de la madre, de manera que dependiendo de qué alelo materno porten los descendientes pueden ser identificados como machos o hembras.
Para llevar a cabo este estudio, los fragmentos obtenidos en la PCR se analizan, por ejemplo pero sin limitarse, en un secuenciador automático, que permite identificar las variantes alélicas del marcador en función de su tamaño en pares de bases. El locus microsatélite de M-SmaSD, es codominante, por lo que se puede determinar el tamaño de los dos alelos.
Por tanto, el marcador M-SmaSD es de gran valor a la hora de predecir el sexo de las progenies conociendo información adicional del genotipo de otros parientes, según la metodología de "selección asistida por marcadores".
La visualización de los microsatélites puede realizarse por medios bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, pero sin limitarse, mediante electroforesis en geles de acrilamida, tiñendo con nitrato de plata, o empleando radioisótopos. Actualmente suele realizarse con secuenciadores automáticos, empleando cebadores pre-marcados con fluorescencia. Así, en otra realización preferida de la invención, uno de los cebadores empleados en la reacción de PCR está unido a un fluorocromo, que permitirá detectar los fragmentos de la PCR en el secuenciador y visualizar el tamaño de los mismos en un software de imagen.
En la presente memoria se define fluorocromo como el grupo funcional de una molécula fluorescente que absorbe energía de una longitud de onda específica y la vuelve a emitir en otra determinada de mayor longitud de onda, por ejemplo, pero sin limitarnos, el isotiocianato de fluoresceína o la rodamina.
Otro aspecto de la invención se refiere a un kit de diagnóstico adecuado para llevar a cabo el método de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit de diagnóstico comprende los cebadores de la invención, específicos para la amplificación de la secuencia recogida en SEQ ID NO: 3, u otras secuencias homologas a la SEQ ID NO: 3, que incluyan el marcador M-SmaSD.
En la presente descripción, el termino "específicos" implica que los cebadores comprenden una secuencia nucleotídica totalmente complementaria a las secuencias adyacentes al marcador M-SmaSD empleado por el método de la presente invención.
Dicho kit puede comprender cebadores, sondas y todos aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo el método de la invención. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, el uso de tampones, polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención. A título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, el kit contendrá todos los elementos necesarios para la identificación del sexo en el rodaballo, o en otras especies del género Scophthalmus, por la técnica que se ha descrito anteriormente.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Descripción de las figuras
Fig. 1. Análisis de fragmentos del locus microsatélite M-SmaSD en 4 hembras de la especie Scophthalmus maximus. Los individuos hembras son heterocigóticos (dos picos) muestran dos alelos.
Fig. 2. Análisis de fragmentos del locus microsatélite M-SmaSD en 4 machos de la especie Scophthalmus maximus. Los individuos machos son homocigóticos, presentan un único tipo alélico (un sólo pico) .
Ejemplos A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad del método de obtención de datos para la identificación del sexo en especies del género Scophthalmus mediante el análisis del marcador microsatélite M-SmaSD.
Ejemplo 1
Identificación del marcador asociado a la región genética o QTL implicada en la determinación del sexo en rodaballo
Selección de marcadores genéticos
Para la identificación de la región genómica asociada con el sexo, se utilizó el mapa genético del rodaballo (Bouza et al., 2007, Genetics 177: 2457-246) con 248 marcadores microsatélite anónimos. De ellos, se seleccionaron 99 marcadores distribuidos homogéneamente a lo largo de todo el genoma a distancias mayoritariamente alrededor de 10 cM.
Genotipado del rodaballo a partir de los marcadores
Estos marcadores previamente seleccionados fueron genotipados en abuelos, padres y descendientes de tres familias sexadas con anterioridad. Las tres familias estaban constituidas por 96 (F-1) , 50 (F-2) y 50 (F-3) individuos sexados respectivamente, con proporciones equilibradas de machos y hembras.
Búsqueda de asociación entre los marcadores y el sexo
La búsqueda de asociaciones significativas entre el sexo de los descendientes y los marcadores genotipados a lo largo de todo el genoma se realizó usando el programa QTL Express. La significación de la asociación se realizó mediante un análisis de la varianza. En la familia más amplia (F-1) se identificó un marcador con una asociación muy elevada (F=7815, 63; g.l.=3229; P=0) . Además, se detectaron otras 4 asociaciones de mucho menor efecto, algunas de ellas significativas después de la corrección para múltiples test. En las otras dos familias de 50 individuos (F-2 y F-3) , se detectó únicamente la fuerte asociación previamente observada en la familia F-1.
La utilización del marcador SmaSD, que presentaba el valor de asociación más elevado, permitió sexar correctamente el 97% de los individuos de la familia F-1 y el 100% de los individuos de las familias F-2 y F-3. Globalmente, esto representa un 98.5% de individuos correctamente sexados. El análisis de segregación en las familias indicó igualmente que el sexo de la progenie venía determinado únicamente por la madre. De manera que dependiendo del alelo del marcador que la madre trasmitía a sus descendientes, estos eran machos o hembras.
Ejemplo 2
Identificación del sexo en rodaballo
Extracción del ADN
Para la extracción de ADN se tomó una muestra epitelial de la aleta caudal del rodaballo, Scophthalmus maximus. Una vez tomada la muestra, se almacenó a 4ºC en un tubo de 1, 5 mL con alcohol de 96º hasta su análisis. Para la extracción del ADN genómico se aplicó el método de Chelex-100. El protocolo se describe en detalle a continuación:
1. Precalentar a 60ºC la solución Chelex al 10%. 2. Cortar un pequeño trozo de tejido muestral conservado en etanol absoluto a 4ºC. 3. Disponer el fragmento muestral (aleta) en un tubo estéril de 2 mL (con tapa enroscada) y añadir 500 μL de Chelex al 10%. 4. Agitar utilizando un vortex. 5. Añadir 15 μL de Proteinasa K (20 mg/mL) . 6. Incubación a 56ºC durante 1 hora en el horno de hibridación con frecuentes agitaciones, cada 10 minutos. 7. Incubar 15 minutos a 100ºC. 8. Conservar a 4ºC. 9. Antes de cada uso: i) Agitar con vortex durante 10 segundos. ii) Centrifugar 10 minutos a 10.000 r.p.m. iii) Cargar 1 μL para cada reacción de PCR. Amplificación del marcador M-SmaSD
Para el análisis del marcador M-SmaSD, es necesaria su amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADN genómico. A continuación se detalla la mezcla de reacción:
- H2O-miliQ, 35, 5 μL. - Tampón, 5 μL buffer 10x. - dNTPs, 2 μL (stock 10 mn) - 0, 4 mn final. - Cebador forward (SEQ. ID NO: 1) , 2 μL (200 ng) . - Cebador reverse (SEQ. ID NO: 2) , 2 μL (200 ng) . - MgCl2, 1, 5 μL (stock 50 mn) . - Taq polimerasa, 1 μL (0, 5 un) . - ADN genómico, 1 μL (50 ng) . - Volumen total: 50 μL. Las secuencias de los dos cebadores específicos desarrollados en la presente invención para la amplificación de M-SmaSD, son las recogidas en las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y la secuencia amplificada es la recogida en la SEQ ID NO: 3.
A uno de los dos cebadores se le añade un fluorocromo.
Las condiciones de la reacción de amplificación son las siguientes: desnaturalización inicial a 95ºC 10 minutos; 35 ciclos de desnaturalización (94ºC 45 segundos) , anillamiento (58ºC 50 segundos) , y elongación (72ºC 50 segundos) ; finalmente un paso de extensión a 72ºC durante 10 minutos.
Análisis molecular del marcador M-SmaSD
A continuación se realiza el genotipado del individuo mediante el análisis de 50 ng de la solución de amplificación. Los fragmentos de la reacción de amplificación se analizan en un secuenciador automático. Este análisis permite identificar las variantes alélicas del marcador en función de su tamaño en pares de bases.
El fluorocromo añadido en el paso anterior a uno de los cebadores empleados en la reacción de PCR, permite la detección de los fragmentos con el láser del secuenciador y la visualización en el software de imagen.
Siguiendo el principio de la selección asistida por marcadores, es necesario genotipar adicionalmente a: i) los abuelos, ii) los hermanos de la madre, iii) otros descendientes de la misma progenie analizada, sexados con anterioridad. Cualquiera de las tres opciones es válida.
Identificación del sexo
Una vez genotipado el individuo a analizar y cualquiera de sus familiares descritos en el apartado anterior, previamente sexado, se puede asociar un genotipo al sexo femenino o masculino en la progenie analizada.
En el ejemplo de la presente invención, dicho análisis permitió asociar la heterocigosis con las hembras, como se muestra en la Figura 1, y la homocigosis con los machos, como se muestra en la Figura 2.
