e) Comparación de los niveles de viabilidad entre los diferentes grupos de células para identificar al DOM como el agente causante de citotoxicidad y determinar su concentración en la muestra problema. En una realización preferida el ión sodio extracelular se sustituye mediante la reducción o eliminación del cloruro sódico extracelular y la adición de una concentración equivalente a la eliminada de cloruro de colina. En una realización más preferida el cloruro sódico extracelular se sustituye entre 10 y 30 min antes de la adición de la toxina o el bloqueante.
En otra realización preferida, el inhibidor de los receptores activados por DOM es 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2, 3-diona (CNQX) .
En otra realización preferida, el inhibidor de los receptores activados por DOM es un inhibidor de los receptores no-NMDA de tipo AMPA (ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol-propiónico) .
En una realización más preferida, el inhibidor de los receptores activados por DOM es 1- (4-aminofenil) -4-metil-7, 8-metilendioxi-5H-2, 3-benzodiacepina (GYKI) .
En otra realización específica, las células excitables son neuronas del sistema nervioso central. En una realización más específica, las células excitables son neuronas granulares de cerebelo de rata en cultivo primario.
En una realización todavía más preferida, las células excitables son neuronas granulares de cerebelo de rata en cultivo primario y la detección de los efectos citotóxicos se realiza mediante la observación de los cultivos celulares con microscopía en contraste de fase. En una realización aún más específica la detección de los efectos citotóxicos del DOM se realiza transcurridos entre 5 y 15 min desde las adiciones.
En otra realización todavía más preferida, las células excitables son neuronas granulares de cerebelo de rata en cultivo primario y la detección de los efectos citotóxicos se realiza utilizando colorantes vitales y microscopia de epifluorescencia.
En otra realización todavía más específica, las células excitables son neuronas granulares de cerebelo de rata en cultivo primario y la cuantificación de los niveles de viabilidad celular se realiza utilizando colorantes vitales y microscopia de epifluorescencia. En una realización aún más específica, la cuantificación de los efectos citotóxicos se realiza transcurridas 9 h desde las adiciones.
La presencia de DOM se determina mediante la comparación de los niveles de supervivencia de las células tratadas con la muestra problema respecto a las tratadas con la muestra problema y el inhibidor de los receptores activados por DOM, de manera que la protección observable en las células expuestas a la muestra problema y el inhibidor respecto a las expuestas sólo a la muestra problema indica que el agente causante de toxicidad es DOM. La cuantificación de DOM se realiza mediante la comparación de los niveles de supervivencia de las células tratadas con la muestra problema respecto a las tratadas con el DOM.
La aplicación del presente bioensayo para la detección y cuantificación de DOM en el análisis rutinario de muestras problema requiere una inversión mínima, lo que le otorga una gran ventaja sobre otras técnicas. De esta manera, sólo requiere de la adquisición de:
- Una campana de flujo laminar.
- Un incubador de CO2.
- Un microscopio de contraste de fases con epifluorescencia.
El bioensayo con células excitables es un método sencillo, fiable y fácilmente utilizable, que requiere equipos de coste limitado y personal con cualificación media, siendo estas grandes ventajas para su aplicación y generalización, frente a otras técnicas y métodos, como los analítico-químicos, que requieren un equipamiento costoso, complejo, de muestras muy elaboradas y, en muchos de los casos, de personal especializado.
Por otro lado, aunque en el bioensayo del ratón la inyección de DOM induce la aparición de algunos síntomas característicos antes de la muerte del animal, no es posible detectar inequívocamente la naturaleza del agente causal. El procedimiento que se propone permite detectar cualitativa y cuantitativamente la presencia de DOM mediante un único ensayo, suponiendo por tanto un ahorro considerable tanto de tiempo como de animales necesarios, respecto al bioensayo del ratón.
En el presente bioensayo las toxinas son evaluadas por su actividad funcional, lo que le otorga ventaja frente a otros métodos como los ensayos inmunológicos o los de unión al receptor. Otras técnicas determinan un perfil electrofisiológico para cada toxina, pero no son capaces de diferenciar la presencia de varias en una misma muestra problema, mientras que este nuevo método determina la presencia de DOM específicamente. El bioensayo para la detección y cuantificación de DOM en células excitables expuestas a un medio extracelular con el ión sodio sustituido total o parcialmente posee una sensibilidad superior que los ensayos en cultivos neuronales previamente descritos, ya que mediante su aplicación es posible detectar concentraciones de toxina superiores a 1 μM, además de requerir tiempos más reducidos para su cuantificación.
La invención resulta de aplicación en aquellos sectores que precisen de la detección, identificación y cuantificación de sustancias químicas y bioquímicas de carácter tóxico en seres vivos, como por ejemplo en los sectores medioambiental o agroalimentario, y en particular en el campo de la seguridad alimentaria de productos marinos.
Explicación de una forma de realización preferente
Para una mejor comprensión de la presente invención, se expone el siguiente ejemplo de realización preferente, descrito en detalle, que debe entenderse sin carácter limitativo del alcance de la invención.
La preparación de los cultivos de neuronas granulares de cerebelo de rata en cultivo primario se llevó a cabo mediante el procedimiento previamente establecido que se describe a continuación:
Se prepararon las siguientes soluciones:
Solución I
NaCl 124 mM, KCl 5, 37 mM, NaH2PO4 1 mM, D-glucosa 14, 5 mM, Hepes 25 mM, rojo fenol 27 μM, MgSO4 1, 2 mM, seroalbúmina bovina (BSA) 3 mg/mL. La solución se equilibró a pH 7, 4 con NaOH.
Solución II
Solución I suplementada con 0, 25 mg/mL de tripsina.
Solución III
Solución I suplementada con 80 μg/mL de Desoxirribonucleasa I (DNAsa I) , 0, 52 mg/mL de inhibidor de tripsina y MgSO4 elevado a 2, 8 mM.
Solución IV
Solución I suplementada con 25, 6 μg/mL de DNAsa I, 166, 4 μg/mL de inhibidor de tripsina y MgSO4 elevado a 1, 7 mM.
Solución V
Solución I suplementada con 0, 1 mM de CaCl2 y elevada a 2, 5 mM de MgSO4.
A continuación se extrajeron por disección 8-13 cerebelos procedentes de crías de rata de 8 días de edad y se depositaron en 2 mL de solución I. Con ayuda de unas pinzas, se eliminó la meninge que individualiza el cerebelo de otras partes del cerebro y lo separa del hueso del cráneo. Los cerebelos se desmenuzaron mediante cortes ortogonales con una cuchilla, y los pequeños fragmentos de tejido se resuspendieron en 30 mL de solución I. Tras una centrifugación a baja velocidad, el tejido se resuspendió en 30 mL de solución II y se incubó a 37ºC durante 10 min con agitación con el fin de producir la tripsinización del mismo. La reacción se detuvo añadiendo 15 mL de la solución IV. La suspensión se agitó ligeramente durante 1 minuto y después se centrifugó. El precipitado obtenido se resuspendió en 2 mL de solución III.
El tejido se sometió entonces a una disgregación mecánica, disociando por aspiración-expulsión con una pipeta Pasteur, y se añadieron 5 mL de solución V. La suspensión se agitó y se dejó reposar verticalmente durante 5-10 min con el fin de permitir la sedimentación de posibles grumos de células no disociadas. Las células en suspensión se recogieron por centrifugación a baja velocidad durante 5 min y el precipitado obtenido se resuspendió en medio de cultivo Basal Eagle's Medium suplementado con 10% de suero fetal de ternera (inactivado por calor a 56ºC durante 30 min) , 100 μg/mL de gentamicina, 2 mM de glutamina y 25 mM de KCl.
Los grumos de células no disociadas se sometieron a un nuevo tratamiento de trituración con una pipeta Pasteur, y las células disociadas así obtenidas se añadieron a las anteriores. Las células se sembraron a una densidad de 2, 5 x 105 células/cm2 sobre placas Petri de plástico pretratadas con poli-L-lisina (5 μg/mL) . Los cultivos se incubaron a 37ºC, en una atmósfera de CO2 al 5% y una humedad del 95%. Tras este proceso se obtuvieron 10-12 placas de cultivo de 35 mm de diámetro por cerebelo, y la preparación se llevó a cabo en aproximadamente 3 h. La utilización de placas de menor diámetro permitió aumentar considerablemente el rendimiento sin perjudicar la sensibilidad del método.
Con objeto de impedir la replicación de las células no neuronales se añadió, al cabo de 20-24 h, un agente citostático (arabinofuranósido de citosina, 10 μM) . Tras ocho días en cultivo, las células estuvieron listas para su utilización, y pudieron mantenerse en cultivo durante al menos un mes añadiendo periódicamente glucosa (5, 6 mM) al medio de cultivo y reponiendo la pérdida de agua debida a la evaporación. Después de ocho días en cultivo, más del 95% de la población neuronal pudo ser identificada morfológicamente como perteneciente al tipo de neurona granular, siendo el 5% restante neuronas GABAérgicas fundamentalmente. La proporción de astrocitos no superó el 3%.
Para la realización del bioensayo, se formaron 3 grupos con las placas que contienen las neuronas y se sustituyó el medio de todas las células por una solución de Locke (NaCl 130 mM, Ca2Cl 2, 3 mM, KCl 5, 6 mM, Hepes 8, 4 mM, Mg2Cl 1 mM, glucosa 5, 6 mM) con el cloruro sódico sustituido por cloruro de colina (solución Locke modificada) . Las neuronas mantenidas en esta solución sin ión sodio no presentaron alteraciones significativas en su viabilidad durante al menos 10 h respecto a las mantenidas en una solución Locke normal. Se añadió (5R, 10S) - (+) -5-Metil-10, 11-dihidro-5H-dibenzo[a, d]ciclohepten-5, 10-imino hidrogeno maleato (MK-801, 1 μM) a todas las placas de neuronas para evitar la posible excitotoxicidad por glutamato endógeno o exógeno, a través del receptor NMDA. Cada concentración o dilución se ensayó por duplicado y se adicionó a cada grupo:
- Grupo 1. Concentraciones crecientes de DOM comercial (1 μM, 2 μM, 5 μM, 7 μM) . En este grupo se incluyeron dos placas control que no contienen DOM.
- Grupo 2. 200 μL de cada una de las siguientes diluciones de la muestra problema: 0, 10, 50, 100.
- Grupo 3. El inhibidor de los receptores activados por ácido domoico GYKI a una concentración final de 50 μM y 15 min después 200 μL de cada una de las siguientes diluciones de la muestra problema: 0, 10, 50, 100. En este grupo se incluyeron 2 placas que contienen el inhibidor GYKI en ausencia de la muestra problema.
La neuroprotección observada en el grupo 3 respecto al grupo 2 indicó la presencia de DOM en la muestra problema, mientras que la comparación de los porcentajes de supervivencia entre el grupo 1 y el grupo 2 indicó su concentración.
La detección de DOM en la muestra problema se llevó a cabo tras 5-15 min de exposición observando los cultivos con microscopía óptica en contraste de fase y determinando la presencia de "toxicidad temprana", caracterizada por el hinchamiento y ennegrecimiento de las neuronas tratadas con DOM purificado o muestras problema contaminadas con DOM, en ausencia de GYKI. Con este procedimiento rápido se detectaron concentraciones iguales o superiores a 2 μM de toxina.
La cuantificación de DOM mediante el recuento de la supervivencia neuronal se llevó a cabo tras 9 h usando el siguiente protocolo:
- Se aspiró el medio de cultivo.
- Se adicionó 1 mL de la solución Locke modificada.
- Se aspiró y adicionó nuevamente 1 mL de la misma solución.
- Se aspiró y adicionó nuevamente 1 mL de solución Locke modificada que contiene 150 μg/mL de diacetato de fluoresceína.
- Se incubó 4 min a 37ºC.
- Se visualizó en un microscopio de epifluorescencia.
Mediante esta técnica, las células vivas y los circuitos neuronales funcionales aparecieron perfectamente teñidos con el colorante fluorescente, mientras que los núcleos de las células muertas se visualizaron como puntos rojos. Se fotografiaron al azar varios campos representativos del cultivo y se procedió al recuento tanto de las células vivas (de color verde) , como de las muertas (de color rojo) , calculando finalmente el porcentaje de supervivencia neuronal al dividir el número de neuronas vivas entre el número total de neuronas (vivas y muertas) en cada fotografía.
