o sus sales orgánicas o inorgánicas. En la presente invención el término "alquilo" se refiere a radicales de cadenas de hidrocarburos lineales o ramificadas, que consisten en átomos de carbono e hidrógeno, que pueden o no contener insaturaciones, que tienen de uno a veinte átomos de carbono y que están unidas al resto de la molécula por un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n- butilo, t-butilo, n-pentilo, etc. Los radicales alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como un arilo, halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto, alquiltio, etc.
El término "acilo" se refiere, en la presente invención, a un derivado de ácido carboxílico por eliminación de un grupo hidroxilo. Los grupos acilo tienen como fórmula general Ra-CO-, donde Ra es un grupo alquilo con las acepciones anteriores y preferiblemente se refiere a grupos alquilo (C1- C20) . donde alquilo es como definido anteriormente.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) , donde R1 y R2 son C2- C14 alquilo o acilo.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) , donde X es -CH2- .
En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) , donde X es -CH2YR3 Y es azufre, R3 es - (CH2) p- NH-CO- (CH2) q- , p es 2 y q es 1.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) , donde R4 y R5 son - (CH2) r[ (NHMCH2) s]t- NH2, donde r tiene un valor de 1, s tienen un valor de 2 y t tiene un valor comprendido entre 0 y 4.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) donde su sal se selecciona entre el grupo formado por acetato, trifluoroacetato, propionato, benzoato, metanosulfonato y trifluorometanosulfonato.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) donde su sal se selecciona entre el grupo formado por cloruro, bromuro y yoduro. Más preferiblemente, dicha sal es cloruro.
En otra realización preferida, la presente invención se refiere al compuesto de fórmula (I) donde n es 5.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) que se selecciona entre el siguiente grupo:
- Heptakis[6- (4-aminometil-1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]ciclomaltoheptaosa
- Heptakis[6- (4- (2, 2-diaminoetilaminometil) -1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]ciclomaltoheptaosa
- Heptakis[6- (4- (2, 2-diaminoetilaminometil) -1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) -6-desoxi-2, 3-di-O- miristoil]ciclomaltoheptaosa
- Heptakis[6- (2- (4-aminometil-1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) acetamidoetiltio) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]ciclomaltohep-taosa
- Heptakis[6- (2- (4- (2, 2-diaminoetilaminometil) -1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) acetamidoetiltio) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexa-noil]ciclomaltoheptaosa
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) donde alguno de los grupos amino terminales está sustituido con un fluorocromo.
En la presente invención, el término "fluorocromo" se refiere a un componente de una molécula que hace que ésta sea fluorescente. Es un grupo funcional de la molécula que absorberá energía de una longitud de onda específica y la volverá a emitir en otra determinada de mayor longitud de onda (es decir, con menor energía) . La cantidad de energía emitida y su longitud de onda dependen tanto del propio fluorocromo como de su ambiente químico. Algunos ejemplos de fluorocromos que pueden ser empleados en la presente invención, pero sin limitarse, son rodamina, fluoresceína o dansilo.
En otra realización preferida, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) donde alguno de los grupos amino terminales está sustituido con un grupo que incorpora al menos un ligando capaz de ser reconocido por un receptor celular.
En la presente invención, el término "receptor celular" se refiere a un componente de la superficie de la célula que reconoce o interacciona de manera específica con una molécula o "ligando". La interacción del ligando con el receptor celular puede favorecer, por ejemplo, la distribución selectiva a una determinada célula diana.
Más preferiblemente, este ligando se selecciona entre un mono u oligosacárido, un anticuerpo monoclonal o un derivado de ácido fólico. Aún más preferiblemente, el mono u oligosacárido se selecciona entre mañosa, galactosa, glucosa, N-acetilglucosamina, ácido siálico, lactosa ó un oligosacárido formado a partir de cualquiera de ellos o sus combinaciones.
En la presente invención el término "monosacárido" se refiere a los glúcidos más sencillos, que no se hidrolizan, es decir, que no se descomponen para dar otros compuestos, conteniendo de tres a seis átomos de carbono. Su fórmula empírica es (CH2O) n donde n ≥q 3. La cadena carbonada de los monosacáridos no está ramificada y todos los átomos de carbono menos uno contienen un grupo alcohol (-OH) . El átomo de carbono restante tiene unido un grupo carbonilo (C=O) . Si este grupo carbonilo está en el extremo de la cadena se trata de un grupo aldehido (-CHO) y el monosacárido recibe el nombre de aldosa. Ejemplos de aldosas, pero sin limitarse a, son gliceraldehído, eritrosa, treosa, ribosa, arabinosa, xilosa, lixosa, alosa, altrosa, glucosa, mañosa, gulosa, idosa, galactosa, talosa. Si el carbono carbonílico está en cualquier otra posición, se trata de una cetona (-CO-) y el monosacárido recibe el nombre de cetosa. Ejemplos de cetosa, pero sin limitarse a, son dihidroxiacetona, eritrulosa, ribulosa, xilulosa, sicosa, fructosa, sorbosa y tagatosa.
En la presente invención el término "oligosacárido" se refiere a un polímero formado a partir de monosacáridos unidos por enlaces O-glicosídicos, con un número de unidades monoméricas entre 3 y 10. Dentro de los oligosacáridos destacan los disacáridos, que son oligosacáridos formados por la unión de dos monosacáridos iguales o distintos mediante enlace O-glucosídico (con pérdida de una molécula de agua) , mono o dicarbonílico, que además puede ser α o β en función del -OH hemiacetal o hemicetal. Los disacáridos más comunes son, sin limitarse a, glucoas, fructosa, lactosa, maltosa, isomaltosa, trehalosa y celobiosa.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del compuesto de fórmula (I) como vehículo transportador de, al menos, una molécula al interior de una célula.
El término "transportador" o "carrier", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la capacidad del compuesto de la invención para transportar una molécula al interior de una célula. En el ejemplo 2 de la patente, se utiliza un ácido nucleico como molécula para ilustrar el potencial del compuesto de la invención para actuar como transportador penetrante de células. Sin embargo, la molécula que puede ser introducida mediante el uso del compuesto de la invención puede ser de muy diversa naturaleza, por ejemplo, pero sin limitarse, un ácido nucleico, un ácido nucleico peptídico, un péptido, una proteína, una glicoproteína, un carbohidrato, un lípido, un glicolípido, una sonda fluorescente o un medicamento. En el ejemplo 2, el plásmido de ADN se administra a células de ovario de hámster chino tipo salvaje (CHO-k1; nº ATCC CCL-61) . Sin embargo, el compuesto de la invención es útil para introducir una molécula en otros tipos de células eucariotas y también en células procariotas.
Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso de los compuestos de la invención como transportadores de ácidos nucleicos al interior de una célula.
El ácido nucleico, puede ser un ácido desoxirribonucleico, como, por ejemplo, pero sin limitarse, ADN de cadena doble, ADN de cadena simple o ADN circular, o un ácido ribonucleico, como por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ARN de interferencia de señal (siRNA) . El compuesto de la invención puede ser empleado para introducir más de un tipo de molécula, por ejemplo, dos secuencias de ADN diferentes.
En una realización más preferida el ácido nucleico es ADN. En una realización aún más preferida, el ADN es de cadena doble. En una realización aún más preferida, el ADN de cadena doble es circular.
En otra realización más preferida el ácido nucleico es ARN. En una realización aún más preferida, el ARN es un ARN de interferencia de señal (siRNA) .
Los transportadores de ácidos nucleicos también se denominan vectores. Tal como se utiliza en la presente invención el término "vector" se refiere a sistemas utilizados en el proceso de transferencia de un ácido nucleico exógeno al interior de una célula, permitiendo de este modo la vehiculación del ácido nucleico al interior de una célula.
El compuesto de la invención se puede emplear, por tanto, como agente de transformación o de transfección. El término "transformación", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la introducción de un ácido nucleico exógeno al interior de una célula procariota. El término "agente de transformación", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un transportador penetrante de un ácido nucleico al interior de una célula procariota. El término "transfección", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la introducción de un ácido nucleico exógeno al interior de una célula eucariota. El término "agente de transfección", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un transportador penetrante de un ácido nucleico al interior de una célula eucariota.
Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso del compuesto de fórmula (I) como agente de transformación de ácidos nucleicos al interior de una célula procariota.
Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso del compuesto de fórmula (I) como agente de transfección de ácidos nucleicos al interior de una célula eucariota.
El compuesto de la invención puede servir para transportar, al menos, una molécula con capacidad terapéutica al interior de una célula de un organismo, preferiblemente un mamífero y, más preferiblemente, un humano. En el ejemplo 2, se muestra la capacidad del los compuesto de la invención para introducir un ácido nucleico en el interior de una célula eucariota. Por tanto, el compuesto de la presente invención es útil como vector capaz de transferir un ácido nucleico profiláctico, de diagnóstico o terapéutico en el contexto de la terapia génica.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del compuesto de la invención para la elaboración de un medicamento.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del medicamento descrito anteriormente para terapia génica.
El término ``medicamento para terapia génica, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un producto obtenido mediante un conjunto de procesos de fabricación destinados a transferir, bien in vivo bien ex vivo, un ácido nucleico profiláctico, de diagnóstico o terapéutico a células animales, preferiblemente humanas, y su posterior expresión in vivo. La transferencia genética supone un sistema de expresión contenido en un sistema de distribución conocido como vector, de origen viral o no viral, que puede incluirse asimismo en una célula animal. Entre los medicamentos de terapia génica se encuentran, pero sin limitarse los siguientes, ácido nucleico desnudo, vectores no virales, vectores virales o células modificadas genéticamente, Puede tratarse de medicamentos de terapia génica basados en células autólogas (procedentes del propio paciente) , como alogénicas (de otro ser humano) o xenogénicas (de animales) .
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el compuesto de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición farmacéutica comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización más preferida de la presente invención, la composición farmacéutica comprende además, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, otro principio activo.
Como se emplea aquí, los términos "principio activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" o "ingrediente farmacéuticamente activo" se refiere a cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de una enfermedad, o que afecte a la estructura o función del cuerpo del ser humano u otros animales.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal y, más preferiblemente, a un mamífero, incluyendo a un humano, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraaricular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracapsular, intracardiaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, o tópica.
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como, por ejemplo, edad, peso, sexo o tolerancia del animal. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la composición farmacéuticamente efectiva que produzca el efecto deseado y, en general, vendrá determinada entre otras causas, por las características propias de dicha composición farmacéutica y del efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" o "vehículos" farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos en el estado de la técnica.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Descripción de las figuras
Figura 1. Muestra una representación esquemática de la síntesis de derivados de βCD policatiónicos anfifílicos rígidos 9-11.
Figura 2. Muestra una representación esquemática de la síntesis de derivados de βCD policatiónicos anfifílicos flexibles 16 y 17.
Figura 3. Representa un ensayo de desplazamiento por electroforesis en gel que muestra la unión de los derivados de βCD anfifílicos (9-11, 16 y 17) o no anfifílicos 18 y 19) al ADNp al aumentar las relaciones de N/P (a) y la cuantificación de la intensidad de las bandas (b) .
Figura 4. Muestra la cuantificación de la intensidad relativa (valor de ADNp sin tratar igual a 100) de la suma de bandas electroforéticas de ADNp relajado y superenrollado correspondientes a las muestras de ADNp complejadas con la ciclodextrinas policatiónicas anfifílicas 9-11, 16 y 17 y tratadas con ADNasa I. Los datos representan la desviación estándar de la media (n = 4) . Se incluyen los datos para los derivados no anfifílicos 18 y 19 como elementos de comparación.
Figura 5. Muestra la eficacia de la transfección de genes in vitro de los complejos con ADNp de 9-11, 16 y 17 en células CHO-k1 en comparación con complejos derivados de derivados policatiónicos no anfifílicos (18 y 19) , poliplejos basados en Lipofectamine 2000 (LP) y ADN desnudo (control) . Los datos representan la desviación estándar de la media (n = 8) .
Ejemplos Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
Ejemplo 1
Síntesis química de los compuestos
Materiales. Los siguientes derivados, utilizados en la preparación de los compuestos de la invención, se prepararon siguiendo métodos descritos en la bibliografía:
. heptakis (6-azido-6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil) ciclomaltoheptaosa (1) (Defaye et al. WO2008009831) .
. heptakis (6-azido-6-desoxi-2, 3-di-O- miristoil) ciclomaltoheptaosa (2) (Defaye et al. WO2008009831) .
. N- (terc- butoxicarbonil) propargilamina (3) (Wu et al. 2007. J. Org. Chem. 72, 2897-2905) ,
. bis[2- (terc- butoxicarbonilamino) etil]amina (Westerberg et al. 1989. J. Med. Chem. 32, 236-243) , y
. heptahidrocloruro de heptakis[6- (2-aminoetiltio) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]-ciclomaltoheptaosa (5) (Díaz-Moscoso et al. 2008. Chem. Commun. 2001-2003) .
3. [Bis (2- (terc- butoxicarbonilamino) etil) amino]propino (4) se preparó a partir de bis[2- (terc- butoxicarbonilamino) etil]amina como se detalla: a una solución de bis[2- (terc- butoxicarbonilamino) etil]amina (872 mg, 2, 86 mmol) y Et3N (1, 2 mL, 8, 6 mmol, 3, 0 eq) en CH3CN (15 mL) , se añadió bromuro de propargilo (0.90 mL, 8, 6 mmol, 3, 0 eq) y la mezcla se agitó a ta durante 2 h. Se eliminó el disolvente a vacío y el residuo se disolvió en CH2Cl2 (100 mL) , se lavó con agua (3 x 30 mL) , se secó (MgSO4 y se concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna (30:1 en CH2Cl2- MeOH) . Rendimiento: 567 mg (58%) ; Rf = 0.22 (50:1 CH2Cl2- MeOH) ; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) : δ 4.93 (bs, 2 H, NH) , 3.42 (d, 2 H, 4JH, H = 2.4 Hz, CH2C≡CH) , 3.20 (q, 4 H, 3JH, H = 5.7 Hz, CH2NHBoc) , 2.64 (t, 4 H, CH2CH2NHBoc) , 2.20 (t, 1 H, C≡CH) , 1.45 (s, 18 H, CMe3) ; 13C NMR (75.5 MHz, CDCl3) : δ 156.0 (CO) , 79.2 (Cq) , 77.9 (C≡CH) , 73.4 (C≡CH) , 52.8 (CH2CH2NHBoc) , 41.8 (HC≡CCH2) , 38.0 (CH2NHBoc) , 28.4 (CMe3) . EM-ESI: m/z 364.2 [M + Na]+, 342.2 [M + H]+.
El plásmido pEGFP-N3 (n° de registro de Genbank: U57609) se obtuvo de Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) . Este plásmido de 4729 pb codifica una variante desplazada hacia el rojo de GFP de tipo salvaje. El plásmido se purificó a partir de bacterias transfectadas usando procedimientos habituales (Sterzel et al. 1985. Anal. Biochem. 147, 462-467) . La concentración de ADN se midió usando un procedimiento fluorimétrico usando el colorante Hoechst 33258.
Preparación de precursores de los compuestos de la invención con espaciador rígido (fórmula (I) , X = CH2) protegidos en forma de los correspondientes terc- butil carbamatos
Heptakis[6- (4-terc- butoxicarbonilaminometil-1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]ciclomaltohep-taosa (6)
A una disolución de 1 (765 mg, 0, 28 mmol) y N-terc-butoxicarbonilpropargilamina (3, 405 mg, 2, 59 mmol, 1, 3 eq) en acetona (10 ml) se añadieron Cul• (EtO) 3P (71 mg, 200 μmol, 0, 3 eq) y DIPEA (0, 34 ml, 0, 29 mmol, 1 eq) y la mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 3 h. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo resultante se purificó por cromatografía en columna (50:1 \rightarrow 20:1 de CH2Cl2- MeOH) . Rendimiento: 871 mg (81%) . Rf 0, 47 (15:1 de CH2Cl2- MeOH) ; [α]D = +24, 7 (c 1, 0, CHCl3) . RMN "1"H (500 MHz, CDCl3, 313 K) : δ 7, 62 (s, 7 H, =CH) , 5, 45 (s, 7 H, H-1) , 5, 40 (s, 7 H, NHBoc) , 5, 38 (t, 7 H, J2, 3 = J3, 4 = 8, 0 Hz, H-3) , 4, 86 (da, 7 H, J6a, 6b = 13, 7 Hz, H-6a) , 4, 75 (dd, 7 H, J1, 2 = 2, 1 Hz, H-2) , 4, 57 (sa, 7 H, H-6b) , 4, 48 (sa, 7 H, H-5) , 4, 29 (dd, 7 H, 2JH, H = 15, 2 Hz, JCH, NH = 5, 4 Hz, CHaNHBoc) , 4, 18 (dd, 7 H, JCH, NH = 3, 0 Hz, CHbNHBoc) , 3, 55 (t, 7 H, J4, 5 = 8, 0 Hz, H-4) , 2, 36-2, 13 (m, 28 H, CH2CO) , 1, 57 (m, 28 H, CH2CH2CO) , 1, 40 (s, 63 H, CMe3) , 1, 30 (m, 56 H, CH2CH3, CH2CH2CH3) , 0, 90 (t, 42 H, 3JH, H = 7, 0 Hz, CH3) . RMN 13C (125, 7 MHz, CDCl3, 313 K) : δ 172, 9, 171, 6 (CO éster) , 155, 8 (CO carbamato) , 145, 2 (C-4 triazol) , 124, 6 (C-5 triazol) , 96, 4 (C-1) , 79, 5 (C-4, Cq) , 70, 1 (C-3) , 69, 8 (C-5) , 69, 6 (C-2) , 50, 2 (C-6) , 36, 1 (CH2NHBoc) , 33, 8 (CH2CO) , 31, 4, 31, 2 (CH2CH2CH3) , 28, 3 (CMe3) , 24, 3 (CH2CH2CO) , 22, 3 (CH2CH3) , 13, 8 (CH3) . EM-ESI: m/z 1908, 1 [M + 2 Na]2+.
Heptakis[6- (4- (2, 2-bis-terc- butoxicarbonilamino) etilaminometil) -1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexa-noil]ciclomaltoheptaosa (7)
A una disolución de 1 (156 mg, 58 μmol) y 3-bis[2- (terc- butoxicarbonilamino) etil]aminopropino (4, 182 mg, 0, 53 mmol, 1, 3 eq) en acetona (10 ml) se añadió Cul (EtO) 3P (15 mg, 41 μmol, 0, 1 eq) y la mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 3 h. El disolvente se evaporó a vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna (30:1 \rightarrow 9:1 de CH2Cl2- MeOH) . Rendimiento: 256 mg (87%) ; Rf = 0, 61 (9:1 de CH2Cl2:MeOH) ; [α]D = +25, 9 (c 1, 0, CH2Cl2) ; RMN 1H (400 MHz, CDCl3, 323 K) : δ 7, 73 (s, 7 H, =CH) , 5.44 (d, 7 H, J1, 2 = 3.2 Hz, H-1) , 5, 36 (t, 7 H, J2, 3 = J3, 4 = 8, 7 Hz, H-3) , 5, 21 (sa, 14 H, NHBoc) 4, 90 (da, 7 H, J6a, 6b = 13, 6 Hz, H-6a) , 4, 75 (dd, 14 H, H-2, H-6b) , 4, 51 (m, 7 H, H-5) , 3, 78, 3, 74 (2 d, 14 H, 2JH, H = 15, 6 Hz, CH2N) , 3, 53 (t, 7 H, J4, 5 = 8, 5 Hz, H-4) , 3, 16 (q, 28 H, 3JH, H = 5, 6 Hz, CH2NHBoc) , 2, 56 (t, 28 H, CH2CH2NHBoc) , 2, 45-2, 13 (m, 28 H, CH2CO) , 1, 60 (m, 28 H, CH2CH2CO) , 1, 44 (sa, 126 H, CMe3) , 1, 30-1, 20 (m, 56 H, CH2CH3, CH2CH2CH3) , 0, 94, 0, 93 (2 t, 42 H, 3JH, H = 7, 2 Hz, 3JH, H = 6, 8 Hz, CH3) ; RMN 13C (100, 6 MHz, CDCl3, 323 K) : δ 172, 7, 171, 5 (CO éster) , 156, 0 (CO carbamato) , 143, 6 (C-4 triazol) , 125, 4 (C-5 triazol) , 96, 5 (C-1) , 78, 8 (C-4, Cq) , 70, 0 (C-3) , 69, 7 (C-5) , 69, 3 (C-2) , 53, 0 (CH2CH2NHBoc) , 50, 0 (C-6) , 48, 0 (CH2N) , 38, 5 (CH2NHBoc) , 33, 8, 33, 5 (CH2CO) , 31, 1, 31, 0 (CH2CH2CH3) , 28, 3 (CMe3) , 24, 1 (CH2CH2CO) , 22, 1 (CH2CH3) , 13, 6 (CH3) ; EM-ESI: m/z 2558, 2 [M + 2 Na]2+, 1713, 6 [M + 3 Na]3+.
Heptakis[6- (4- (2, 2-bis (terc- butoxicarbonilamino) etilaminometil) -1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) -6-desoxi-2, 3-di-O- miris-toil]ciclomaltoheptaosa (8)
Una disolución de heptakis[6-azido-6-desoxi-2, 3-di-O- miristoil]ciclomaltoheptaosa (2, 50 mg, 11 μmol) , 3-bis[2- (terc- butoxicarbonilamino) etil]aminopropino (4, 34 mg, 0, 1 mmol, 1, 3 eq) , Cul (EtO) 3P (3 mg, 8 μmol, 0, 1 eq) y N-etildiisopropilamina (13 μl, 80 μmol, 1 eq) en acetona (5 ml) se sometió a reflujo durante 6 h. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía en columna (30:1 \rightarrow 9:1 de CH2Cl2:MeOH) para dar un sólido amorfo. Rendimiento: 61, 3 mg (80%) . [α]D = +26, 2 (c 0, 9, CH2Cl2) : Rf = 0, 51 (9:1 de CH2Cl2- MeOH) ; RMN 1H (500 MHz, CDCl3, 333 K) : δ 7, 28 (s, 7 H, =CH) , 5.45 (s, 7 H, H-1) , 5, 38 (t, 7 H, J2, 3 = J3, 4 = 9, 2 Hz, H-3) , 5, 19 (sa, 14 H, NHBoc) , 4, 90 (d, 7 H, J6a, 6b - 13, 7 Hz, H-6a) , 4, 75 (dd, 14 H, J1, 2 = 3, 6 Hz, H-2, H-6b) , 4, 53 (m, 7 H, H-5) , 3, 78 (2d, 14 H, 2JHa, Hb = 15, 7 Hz, CH2N) , 3, 55 (t, 7 H, J4, 5 = 8, 1 Hz, H-4) , 3, 18 (qa, 28 H, 3JH, H = 5, 2 Hz, CH2NHBoc) , 2, 58 (sa, 28 H, CH2CH2NHBoc) , 2, 44-2, 15 (m, 28 H, CH2CO) , 1, 60-1, 54 (m, 28 H, CH2CH2CO) , 1.46 (s, 126 H, CMe3) , 1, 38-1, 29 (m, 280 H, (CH2) 10) , 0, 92 (t, 42 H, 3JH, H = 6, 5 Hz, CH3) ; RMN 13C (125, 7 MHz, CDCl3, 313 K) : δ 172, 9, 171, 7 (CO éster) , 156, 2 (CO carbamato) , 143, 6 (C-4 triazol) , 125, 7 (C-5 triazol) , 96, 6 (C-1) , 79, 0 (C-4, Cq) , 70, 1 (C-3) , 69, 7 (C-5, C-2) , 53, 1 (CH2CH2NHBoc) , 50, 1 (C-6) , 48, 0 (CH2N) , 38, 4 (CH2NHBoc) , 34, 0, 33, 7 (CH2CO) , 31, 9 (CH3CH2CH2) , 29, 8-28, 9 (CH3CH2CH2 (CH2) 7) , 28, 5 (CMe3) , 24, 6 (CH2CH2CO) , 22, 5 (CH3CH2) , 14, 0 (CH3) ; EM-ESI: m/z 2228, 6 [M + 2 Na + H]3+, 1681, 2 [M +K + 2 Na + H]4+.
Procedimiento general para la preparación de derivados macrocíclicos policatiónicos anfifílicos con espaciador rígido, de fórmula (I) en los que X es CH2 (compuestos 9-11)
El tratamiento del hepta o tetradecacarbamato correspondiente (6-8, 33 μmol) con TFA-CH2Cl2 (1:1, 2 ml) a temperatura ambiente durante 2 h, seguido de evaporación de los disolventes y liofilización en una disolución diluida de HCl, dio 9-11 puros.
Heptahidrocloruro de heptakis[6- (4-aminometil-1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]ciclomaltoheptaosa (9)
El compuesto 9 responde a la fórmula (I) en la que n = 5, los grupos R1 y R2 son iguales y representan hexanoilo (CH3 (CH2) 4CO-) , X es CH2, y R4 y R5 son iguales y representan hidrógeno, en forma de la correspondiente sal de heptahidrocloruro.
Rendimiento: 106, 4 mg (99%) ; [α]D = +31, 5 (c 1, 0, MeOH) ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD, 313 K) : δ 7, 98 (s, 7 H, =CH) , 5, 49 (t, 7 H, J2, 3 = J3, 4 = 9, 3 Hz, H-3) , 5, 46 (s, 7 H, H-1) , 4, 88 (d, 7 H, J6a, 6b = 14, 0 Hz, H-6a) , 4, 78 (dd, 7 H, J1, 2 = 2, 1 Hz, H-2) , 4, 65 (s, 7 H, H-6b) , 4, 53 (sa, 7 H, H-5) , 3, 91 (s, 14 H, CH2NH2) , 3, 67 (t, 7 H, J4, 5 = 8, 5 Hz, H-4) , 2, 47-2, 21 (m, 28 H, CH2CO) , 1, 64 (m, 28 H, CH2CH2CO) , 1, 36 (m, 56 H, CH2CH3, CH2CH2CH3) , 0, 94 (t, 42 H, 3JH, H = 7, 0 Hz, CH3) ; RMN 13C (125, 7 MHz, CD3OD, 313 K) : δ 174, 3, 173, 4 (CO éster) , 145, 5 (C-4 triazol) , 126, 8 (C-5 triazol) , 98, 1 (C-1) , 78, 8 (C-4) , 71, 5 (C-5) , 71, 1 (C-3, C-2) , 51, 6 (C-6) , 36, 5 (CH2NH2) , 35, 0, 34, 9 (CH2CO) , 32, 5, 32, 4 (CH2CH2CH3) , 25, 5 (CH2CH2CO) , 23, 4 (CH2CH3) , 14, 2 (CH3) ; EM (ESI) : m/z 1023, 9 [M + 3 H]3+, 1535, 3 [M + 2 H]2+.
Tetradecahidrocloruro de heptakis[6- (4- (2, 2-diaminoetilaminometil) -1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]ciclomaltoheptaosa (10)
El compuesto 10 responde a la fórmula (I) en la que n = 5, los grupos R1 y R2 son iguales y representan hexanoilo (CH3 (CH2) 4CO-) , X es CH2, y R3 y R4 son iguales y representan 2-aminoetilo (NH2 (CH2) 2- ) . en forma de la correspondiente sal de tetradecahidrocloruro.
Rendimiento: 136, 4 mg (99%) ; [α]D = +18, 5 (c 1, 0, MeOH) ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD, 313 K) : δ 8, 11 (s, 7 H, =CH) , 5, 60 (t, 7 H, J2, 3 = J3, 4 = 9, 9 Hz, H- 3) , 5, 59 (s, 7 H, H-1) , 5, 15 (dd, 7 H, J6a, 6b = 15, 2 Hz, J5, 6a = 2, 5 Hz, H-6a) , 4, 58 (dd, 7 H, J5, 6b = 3, 0 Hz, H-6b) , 4, 57 (m, 14 H, J1, 2 = 3, 5 Hz, H-2, H-5) , 3, 91, 3, 89 (2 d, 14 H, 2JHa, Hb = 15, 3 Hz, CH2N) , 3, 54 (t, 7 H, J4, 5 = 8, 9 Hz, H-4) , 3, 15 (t, 28 H, 3JH, H = 6, 0 Hz, CH2NH2) , 2, 83 (t, 28 H, CH2CH2NH2) , 2, 49-2, 17 (m, 28 H, CH2CO) , 1, 73-1, 58 (m, 28 H, CH2CH2CO) , 1, 37 (m, 56 H, CH2CH3, CH2CH2CH3) , 0, 94, 0, 92 (2 t, 42 H, 3JH, H = 7, 1 Hz, 3JH, H = 6, 9 Hz, CH3) ; RMN 13C (125, 7 MHz, CD3OD, 313 K) : δ 175, 7, 174, 6 (CO éster) , 144, 6 (C-4 triazol) , 129, 7 (C-5 triazol) , 99, 2 (C-1) , 79, 4 (C-4) , 73, 0 (C-2) , 72, 9 (C-5) , 71, 7 (C-3) , 53, 0 (CH2CH2NH2) , 52, 6 (C-6) , 48, 3 (CH2N) , 39, 4 (CH2NH2) , 36, 3, 36, 2 (CH2CO) , 33, 9, 33, 7 (CH2CH2CH3) , 26, 8 (CH2CH2CO) , 24, 7 (CH2CH3) , 15, 6 (CH3) ; EM-ESI: m/z 1837 [M + 2 H]2+, 1225, 0 [M + 3 H]3+, 919, 0 [M + 4 H]4+, 735, 4 [M + 5 H]5+.
Heptakis[6- (4- (2, 2-diaminoetil) aminometil) -1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) -6- desoxi-2, 3-di-O- miristoil]ciclomaltoheptaosa (11)
El compuesto 11 responde a la fórmula (I) en la que n = 5, los grupos R1 y R2 son iguales y representan miristoilo (tetradecanoilo; CH3 (CH2) 12CO-) , X es CH2, y R4 y R5 son iguales y representan 2-aminoetilo (NH2 (CH2) 2- ) , en forma de la correspondiente sal de tetradecahidrocloruro.
Rendimiento: 178, 8 mg (99%) ; [α]D = +30, 7 (c 0, 9, CH2Cl2) ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD, 313 K) : δ 8, 12 (s, 7 H, =CH) , 5, 61 (t, 7 H, J2, 3 = J3, 4 = 9, 3 Hz, H-3) , 5, 60 (s, 7 H, H-1) , 5, 13 (d, 7 H, J6a, 6b = 13, 9 Hz, H-6a) , 4, 97 (d, 7 H, H-6b) , 4, 57 (m, 14 H, H-2, H-5) , 3, 90 (2d, 14 H, 2JH, H = 15, 3 Hz, CH2N) , 3, 55 (t, 7 H, J4, 5 = 9, 2 Hz, H-4) , 3, 16 (t, 28 H, 3JH, H = 5, 5 Hz, CH2NH2) , 2, 82 (t, 28 H, CH2CH2NH2) , 2, 50-2, 15 (m, 28 H, CH2CO) , 1, 80-1, 55 (m, 28 H, CH2CH2CO) , 1, 50-1, 25 (m, 280 H, CH3 (CH22) 10CH2CH2CO) , 0, 93 (t, 42 H, 3JH, H = 6, 6 Hz, CH3) ; RMN 13C (125, 7 MHz, CDCl3, 313 K) : δ 172, 9, 171, 8 (CO éster) , 142, 0 (C-4 triazol) , 126, 9 (C-5 triazol) , 96, 6 (C-1) , 76, 7 (C-4) , 70, 4 (C-5, C-2) , 69, 1 (C-3) , 50, 4 (CH2CH2NH2) , 49, 9 (C-6) , 45, 7 (CH2N) , 36, 7 (CH2NH2) , 33, 6 (CH2CO) , 31, 7, 29, 8-29, 1, 22, 3 (CH3 (CH2) 10CH2CH2CO) , 24, 6, 24, 5 (CH2CH2CO) , 13, 0 (CH3) ; EM-ESI: m/z 2622, 0 [M + 2 H]2+, 1748, 4 [M + 3H]3+, 1311, 7 [M + 4 H]4+, 1049, 7 [M + 5 H]5+.
Preparación de precursores de los compuestos de la invención con espaciador flexible, de fórmula (I) en los que X es -CH2S (CH2) 2- (compuestos 12-15)
Heptakis[6- (2-cloroacetamidoetiltio) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]- ciclomaltoheptaosa (12)
A una disolución del heptahidrocloruro 5 (500 mg, 0, 16 mmol) en DMF seca (10 ml) , bajo atmósfera de Ar, se añadió en porciones DMAP (270 mg, 2, 24 mmol, 2 eq) y la mezcla se agitó durante 15 min. Se añadió anhídrido cloroacético (570 mg, 3, 36 mmol, 3 eq) y la reacción se agitó adicionalmente durante la noche a ta. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió en CH2Cl2, se lavó con agua ligeramente acidificada (3 x 20 ml) , NaHC03 acuoso saturado (3 x 20 ml) y agua (3 x 20 ml) . La fase orgánica se secó (MgS04) , se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna (30:1 de CH2Cl2- MeOH) . Rendimiento: 325 mg (59%) ; Rf = 0, 53 (9:1 de CH2Cl2- MeOH) ; [α]D = +80, 3 (c 1, 0, CH2Cl2) ; RMN 1H (CDCl3l 500 MHz, 313 K) δ 5, 35 (t, 7 H, J2, 3 = J3, 4 = 9, 5 Hz, H-3) , 5, 14 (d, 7 H, J1, 2 = 4 Hz, H-1) , 4, 80 (dd, 7 H, H-2) 4, 21 (m, 7 H, J4, 5 = 9, 0 Hz, J5, 6a = 2, 5 Hz, J5, 6b = 5, 0 Hz, H-5) 4, 11 (2 d, 14 H, 2JH, H = 15, 0 Hz, CH2Cl) , 3, 82 (t, 7H, H-4) , 3, 55 (m, 14 H, CH2NHcist) , 3, 16 (dd, 7H, J6a, 6b = 14, 0 Hz, H-6a) , 3, 10 (dd, 7H, H-6b) , 2, 85 (2dt, 14 H, 2JH, H = 13, 5 Hz, 3JH, H = 6, 5 Hz, CH2Scist) , 2, 43-2, 17 (m, 28 H, CH2CO) , 1, 70-1, 57 (m, 28 H, CH2CH2CO) , 1, 36-1, 29 (m, 56 H, CH2CH2CH3, CH2CH3) , 0, 92 (2 t, 42 H, 3JH, H = 7, 0 Hz, 3JH, H = 7, 5 Hz, CH3) ; RMN 13C (125, 7 MHz, CDCl3, 313 K) δ 173, 3, 171, 7 (CO éster) , 166, 5 (CO amida) , 96, 6 (C-1) , 78, 6 (C-4) , 71, 3 (C-5) , 70, 5 (C-2) 70, 3 (C-3) , 42, 7 (CH2Cl) , 39, 4 (CH2NHcist) , 34, 1, 33, 8 (CH2CO, C-6) , 32, 9 (CH2Scist) , 31, 4, 31, 3 (CH2CH2CH3) , 24, 3 (CH2CH2CO) , 22, 3 (CH2CH3) , 13, 8 (CH3) ; EM-ESI: m/z 1175, 3 [M + 3 Na]3+, 1752 [M + 2 Na]2+, 3477, 7 [M + Na]+.
Heptakis[6- (2-azidoacetamidoetiltio) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]- ciclomaltoheptaosa (13)
A una disolución de 12 (109 mg, 31 μmol) en DMF seca (10 ml) , bajo atmósfera de Ar, se añadió NaN3 (43 mg, 0, 66 mmol, 3 eq) y la mezcla se agitó durante la noche. El disolvente se eliminó a vacío y el residuo se disolvió en CH2Cl2 (50 ml) , se lavó con H2O (3 x 15 ml) , se secó (MgSO4) , se filtró y se concentró. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna (50:1 \rightarrow 30:1 de CH2Cl2:MeOH) .Rendimiento: 93, 2 mg (89%) ; Rf = 0, 48 (9:1 de CH2Cl2:MeOH) , [α]D = +94, 0 (c 1, 0, CH2Cl2) ; RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) δ 5, 34 (t, 7 H, J2, 3 = J3, 4 = 9, 6 Hz, H-3) , 5, 12 (d, 7 H, J1, 2 = 3, 6 Hz, H-1) , 4, 80 (dd, 7 H, H-2) 4, 17 (m, 7 H, H-5) 4, 02 (s, 14 H, CH2N3) , 3, 82 (t, 7 H, J4, 5 = 8, 7 Hz, H-4) 3, 51 (m, 14 H, CH2NHcist) , 3, 10 (m, 14 H, H-6a, H-6b) , 2, 82 (2 dt, 14 H, 2JH, H = 13, 8 Hz, 3JH, H = 7, 2 Hz, CH2Scist) , 2, 44-2, 12 (m, 28 H, CH2CO) 1, 62-1, 55 (m, 28 H, CH2CH2CO) , 1, 34-1, 30 (m, 56 H, CH2CH2CH3, CH2CH3) , 0, 92 (2 t, 42 H, 3JH, H = 11, 1 Hz, 3JH, H = 11.4 Hz, CH3) ; RMN 13C (75, 5 MHz, CDCl3, 313 K) δ 173, 7, 172, 0 (CO éster) , 167, 7 (CO amida) , 96, 7 (C-1) , 78, 8 (C-4) , 71, 5 (C-5) , 70, 8 (C-2) , 70, 5 (C-3) , 52, 8 (CH2N3) , 39, 2 (CH2NHcist) , 34, 3, 34, 1 (CH2CO) , 33, 8 (C-6) , 33, 1 (CH2Scist) , 31, 7, 31, 6 (CH2CH2CH3) , 24, 7 (CH2CH2CO) , 22, 7 (CH2CH3) , 14, 2 (CH3) ; EM-ESI: m/z 1774, 6 [M + 2 Na]2+.
Heptakis[6 (2- (4- (N- terc- butoxicarbonil) aminometil) -1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) acetamidoetiltio) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]ciclomaltoheptaosa (14)
A una disolución de 13 (45 mg, 13 μmol) y 3 (40 mg, 0, 12 mmol, 1, 3 eq) en acetona (5 ml) se añadieron (EtO) 3P•Cul (3 mg, 9 μmol, 0, 1 eq) y DI PEA (15 μl, 90 μmol, 1 eq) y la mezcla se sometió a reflujo durante 4 h. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se purificó por cromatografía en columna (20:1 \rightarrow 9:1 de CH2Cl2:MeOH) . Rendimiento: 53 mg (89%) ; Rf = 0, 4 (9:1 de CH2Cl2:MeOH) ; [α]D = +67, 6 (c 1, 0, CH2Cl2) ; RMN 1H (CD3OD, 500 MHz, 323 K) δ 7, 90 (s, 7 H, =CH) , 5, 32 (t, 7 H, J2, 3 = J3, 4 = 8, 5 Hz, H-3) , 5, 15 (d, 7 H, J1, 2 = 3, 6 Hz, H-1) , 5, 13 (s, 14 H, CH2CONH) , 4, 87 (dd, 7 H, H-2) , 4, 34 (s, 14 H, CH2NHBoc) , 4, 28 (m, 7 H, H-5) , 3, 84 (t, 7 H, J4, 5 = 8, 0 Hz, H-4) , 3, 54 (m, 14 H, CH2NHcist) , 3, 40 (m, 7 H, H-6a) , 3, 08 (dd, 7 H, J6a, 6b = 13, 9 Hz, J5, 6b = 7, 0 Hz, H-6b) , 2, 88 (m, 14 H, CH2Scist) , 2, 50-2, 22 (m, 28 H, CH2CO) , 1, 70-1, 57 (m, 28 H, CH2CH2CO) , 1, 42 (s, 63 H, CMe3) , 1, 40-1, 30 (m, 56 H, CH2CH2CH3, CH2CH3) , 0, 96, 0, 95 (2 t, 42 H, 3JH, H = 7, 0 Hz, CH3) ; RMN 13C (125, 7 MHz, CD3OD) : δ 174, 5, 173, 3 (CO éster) , 167, 9 (CO amida) , 158, 1 (CO carbamato) , 147, 4 (C-4 triazol) , 125, 7 (C-5 triazol) , 98, 3 (C-1) , 80, 6 (C-4, Cq) , 72, 9 (C-5) , 72, 1 (C-3) , 71, 6 (C-2) , 53, 4 (CH2CONH) , 40, 7 (CH2NHcist) , 37, 0 (CH2NHBoc) 35, 1 (CH2CO) , 32, 6, 32, 5 (CH2CH2CH3, CH2Scist, C-6) , 28, 9 (CMe3) , 25, 5 (CH2CH2CO) , 23, 4 (CH2CH3) , 14, 4 (CH3) ; EM-ESI: (m/z) 4606, 9 [M + Na]+, 2317, 9 [M + 2 Na]2+, 1552, 2 [M + 3 Na]3+.
Heptakis[6- (2- (4- (2, 2-bis (terc- butoxicarbonilamino) etilaminometil) - 1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) acetamidoetiltio-6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]ciclomaltoheptaosa (15)
A una disolución de 13 (48 mg, 14 μmol) y 4 (44 mg, 0, 13 mmol, 1, 3 eq) en acetona (5 ml) se añadieron Cul• (EtO) 3P (4 mg, 10 μmol, 0, 1 eq) y DIPEA (17 μl, 0, 1 mmol, 1 eq) y la mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 3 h. El disolvente se eliminó a vacío y el residuo se purificó por cromatografía en columna (30:1 \rightarrow 9:1 de CH2Cl2- MeOH) para dar 15. Rendimiento: 65 mg (79%) ; Rf = 0, 36 (9:1 de CH2Cl2:MeOH) ; [α]D = +51, 5 (c 1, 0, CH2Cl2) ; RMN 1H (500 MHz, CDCl3, 313 K) : δ 7, 81 (s, 7 H, =CH) , 5, 34 (s, 14 H, NHBoc) 5, 26 (t, 7 H, J2, 3 = J3, 4 = 7, 9 Hz, H-3) , 5, 10 (m, 21 H, CH2CONH, H-1) , 4, 76 (da, 7 H, H-2) , 4, 14 (sa, 7 H, H-5) , 3, 81 (sa, 14 H, CH2N) , 3, 72 (ta, 7H, J4, 5 = 6, 95 Hz, H-4) , 3, 44 (m, 14 H, CH2NHcist) , 3, 18 (sa, 14 H, CH2NHBoc) , 2, 98 (sa, 7 H, H-6a) , 2, 80 (sa, 14 H, CH2Scist) , 2, 73 (sa, 7 H, H-6b) , 2, 58 (s, 14 H, CH2CH2NHBoc) , 2, 42-2, 10 (m, 28 H, CH2CO) , 1, 65-1, 50 (m, 28 H, CH2CH2CO) , 1, 42 (s, 126 H, CMe3) , 1, 38-1, 20 (m, 56 H, CH2CH2CH3, CH2CH3) , 0, 95- 0, 84 (2 t, 42 H, 3JH, H = 7, 3 Hz, 3JH, H = 7, 0 Hz, CH3) ; RMN 13C (125, 7 MHz, CDCl3, 313 K) : δ 173, 4, 171, 6 (CO éster) , 166, 0 (CO amida) , 156, 3 (CO carbamato) 144, 1 (C-4 triazol) , 125, 1 (C-5 triazol) , 96, 6 (C-1) , 79, 1 (C-4, Cq) , 71, 4 (C-5) , 70, 4 (C-3, C-2) , 53, 3 (CH2CONH) , 52, 4 (CH2CH2NHBoc) , 48, 3 (CH2N) , 39, 4 (CH2NHcist) , 38, 4 (CH2NHBoc) 34, 0, 33, 8 (CH2CO) , 32, 9 (C-6, CH2Scist) , 31, 3, 31, 2 (CH2CH2CH3) , 28, 5 (CMe3) , 24, 3 (CH2CH2CO) , 22, 3 (CH2CH3) , 13, 8 (CH3) ; EM-ESI: m/z 2969, 7 [M + 2 Na]2+, 2959, 0 [M+ H + Na]2+.
Procedimiento general para la preparación de derivados macrocíclicos policatiónicos anfifílicos con espaciador flexible, de fórmula (I) en los que X es -CH2S (CH2) 2- (compuestos 16 y 17)
El tratamiento del hepta o tetradecacarbamato correspondiente (14 ó 15, 19 μmol) con TFA-CH2Cl2 (1:1, 2 ml) a ta durante 2 h, seguido de evaporación de los disolventes y liofilización en una disolución diluida de HCl, dio 16 y 17 puros.
Heptakis[6 (2- (4-aminometil-1H- 1, 2, 3-triazol-1-il) acetamidoetiltio) -6- desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]ciclomaltohep-taosa (16)
El compuesto 16 responde a la fórmula (I) en la que n = 5, los grupos R1 y R son iguales y representan hexanoilo (CH3 (CH2) 4CO-) , X es -CH2S (CH2) 2- , y R4 y R5 son iguales y representan hidrógeno, en forma de la correspondiente sal de heptahidrocloruro.
Rendimiento: 72 mg (91%) ; [α]D = +22, 1 (c 0, 8, MeOH) ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD, 323 K) : δ 8, 21 (s, 7 H, =CH) , 5, 34 (t, 7 H, J2, 3 = J3, 4 = 7, 9 Hz, H-3) , 5, 26 (s, 14 H, CH2CONH) , 5, 16 (d, 7 H, J1, 2 = 3, 2 Hz, H-1) , 4, 85 (dd, 7 H, H-2) , 4, 33 (s, 14 H, CH2NH2) , 4, 29 (sa, 7 H, H-5) , 3, 87 (t, 7 H, J4, 5 = 7, 9 Hz, H-4) , 3, 54 (m, 14 H, CH2NHcist) , 3, 42 (da, 7 H, J6a, 6b = 11, 4 Hz, H-6a) , 3, 12 (dd, 7 H, J5, 6b = 4, 3 Hz, H-6b) , 2, 91 (m, 14 H, CH2Scist) , 2, 50-2, 20 (m, 28 H, CH2CO) , 1, 65 (m, 28 H, CH2CH2CO) , 1, 45-1, 30 (m, 56 H, CH2CH2CH3, CH2CH3) , 1, 00-0, 92 (2 t, 42 H, 3JH, H = 7, 3 Hz, 3JH, H = 6, 9 Hz, CH3) ; RMN 13C (100, 3 MHz, CD3OD, 313 K) : δ 173, 3, 171, 9 (CO éster) , 166, 3 (CO amida) , 139, 7 (C-4 triazol) , 126, 0 (C-5 triazol) , 96, 8 (C-1) , 79, 2 (C-4) , 71, 2 (C-5) , 70, 4 (C-3) , 70, 1 (C-2) , 51, 8 (CH2CONH) , 39, 1 (CH2NHcist) , 34, 9 (CH2NH2) , 33, 6 (CH2CO, CH2Scist, C-6) , 31, 5, 31, 1 (CH2CH2CH3) , 24, 1 (CH2CH2CO) , 22, 0 (CH2CH3) , 13, 0, 12, 8 (CH3) . EM-ESI: m/z 1976, 6 [M + 2 Na]2+, 1317, 8 [M + 3 Na]3+, 988, 1 [M + 2 H + 2 Na]4+.
Heptakis[6 (2- (4- (2, 2-diaminoetilaminometil) -1H- 1, 2, 3-triazol-1- il) acetamidoetiltio) -6-desoxi-2, 3-di-O- hexanoil]ciclomaltoheptaosa (17)
El compuesto 17 responde a la fórmula (I) en la que n = 5, los grupos R1 y R2 son iguales y representan hexanoilo (CH3 (CH2) 4CO-) , X es -CH2S (CH2) 2- , y R4 y R5 son iguales y representan 2-aminoetilo (NH2 (CH2) 2- ) , en forma de la correspondiente sal de tetradecahidrocloruro.
Rendimiento: 81, 0 mg (91%) . [α]D = +39, 6 (c 1, 0 en MeOH) ; RMN 1H (500 MHz, CD3OD, 313 K) : δ 8, 05 (s, 7 H, =CH) , 5, 36 (t, 7 H, J2, 3 = J3, 4 = 8, 7 Hz, H-3) 5, 21 (s, 14 H, CH2CONH) , 5, 17 (d, 7 H, J1, 2 = 3, 5 Hz, H-1) , 4, 83 (dd, 7 H, H-2) , 4, 21 (sa, 7 H, H-5) , 3, 90 (sa, 21 H, CH2N, H-4) , 3, 52 (m, 14 H, CH2NHcist) , 3, 15 (t, 14 H, CH2NH2, 3JH, H = 5, 5 Hz) , 3, 11 (m, 7 H, H-6a) , 2, 88 (m, 21 H, CH2Scist, H-6b) , 2, 84 (t, 7 H, CH2CH2NH2) , 2, 50-2, 22 (m, 28 H, CH2CO) , 1, 73-1, 58 (m, 28 H, CH2CH2CO) , 1, 43-1, 30 (m, 56 H, CH2CH3) , 0, 99-0, 91 (2 t, 42 H, 3JH, H = 6, 9 Hz, 3JH, H = 5, 8 Hz, CH3) ; RMN 13C (125, 7 MHz, CD3OD, 313 K) : δ 176, 0, 174, 7 (CO éster) , 169, 2 (CO amida) , 145, 4 (C-4 triazol) , 128, 5 (C-5 triazol) , 99, 5 (C-1) , 81, 8 (C-4) , 74, 5 (C-5) , 73, 0 (C-3, C-2) , 54, 4 (CH2CONH) , 53, 4 (CH2CH2NH2) , 49, 1 (CH2N) , 42, 0 (CH2NHcist) , 39, 6 (CH2NH2) 36, 4, 36, 3 (CH2CO) , 33, 8, 33, 7 (CH2CH2CH3) , 32, 0 (C-6, CH2Scist) 26, 8 (CH2CH2CO) , 24, 7 (CH2CH3) , 15, 7, 15, 6 (CH3) .
Ejemplo 2
Preparación de los complejos entre macrociclos anfifílicos policatiónicos y ADN plásmido
Preparación de complejos a partir de derivados policatiónicos anfifílicos de βCD y plásmido pEGFP-N3. El plásmido pEGFP-N3, usado para la preparación de los complejos de ADN y para el ensayo de transfección, es un plásmido de 4729 pb (pares de bases) . Las cantidades de derivados policactiónicos anfifílicos de βCD usados se calcularon según la concentración de ADN deseada de 0, 02 mg/ml (fosfato 50 μM) , la relación de N/P, el peso molecular y el número de cargas positivas en el derivado de CD seleccionado. Los experimentos se realizaron para N/P 5, 10, 30 y 50. El ADN se diluyó en agua mili-Q hasta una concentración final de fosfato 50 μM, luego se añadió la cantidad deseada de derivado de CD a partir de un disolución madre de 20 mg/ml (1:2 de Me2SO-agua) . La preparación se removió con vórtex durante unos pocos segundos y se incubó durante 30 minutos.
Ejemplo 3
Análisis de las propiedades de las nuevas CD policatiónicas
La capacidad de las nuevas CD policatiónicas anfifílicas para complejar, proteger y transfectar el ADNp fue analizada mediante ensayos de desplazamiento por electroforesis en gel, ensayo de protección frente a la acción de ADNasa y análisis de la eficiencia de transfección del plásmido pEGFP-N3 en células eucariotas, detallados a continuación.
Ensayo de retardo por electroforesis en gel. La capacidad de unión del complejo ADN- βCD anfifílica policatiónica se analizó por electroforesis en gel. Las disoluciones madre de derivados de βCD se prepararon en Me2SO-agua 1:2, mientras que el ADN se disolvió en NaCl 150 mM. El ADN de pEGFP-N3 (10 μl a 0, 1 μg/μl) se mezcló con un volumen igual de derivado de βCD usando relaciones de N/P de 0 a 10 y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente antes de la adición de tampón de carga (2 μl) . Una alícuota (5 μl) de cada muestra se sometió a electroforesis en gel de agarosa (0, 8% p/v) en tampón TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM) . La electroforesis se llevó a cabo a 7 V/cm y los geles se tiñeron después de la electroforesis con bromuro de etidio. La cuantificación de la intensidad de las bandas se realizó con el software NIH Image (Rasband et al. 1995. Microbeam Analysis Soc. J. 4, 137-149) . Se ha asignado un valor de 100 a la intensidad de la banda correspondiente al ADN desnudo.
Ensayos de protección de ADNasa. El ADN de pEGFP-N3 (10 μl a 0, 1 μg/μl) se mezcló con un volumen igual de disolución madre de derivado de βCD usando N/P = 5 y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. A la mezcla se añadieron 15 μl de una disolución de ADNasa I (0, 1 mg/ml en Tris HCl 50 mM, pH 8, 2000 U/mg) y se incubó durante 45 minutos a 37°C. Después de la digestión se añadieron 20 μl de una disolución de SDS al 10% y las muestras se incubaron durante 2 h a 85°C. Finalmente, una alícuota (20 μl) de cada muestra se sometió a electroforesis en gel de agarosa (0, 8% p/v) en tampón TAE.
Cultivo celular y ensayos de transfección de ADN. Se cultivaron células de ovario de hámster chino tipo salvaje (CHO-k1; nº ATCC CCL-61) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal, glutamina plus 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 0, 1 μg/ml de estreptomicina. Antes de la transfección, las células se sembraron en 24 placas de pocilios y se incubaron durante 24 h para alcanzar una confluencia de células del 80-90%. Para los experimentos de transfección, el plásmido pEGFP-N3 (1 μg) se mezcló con el derivado de CD correspondiente a relaciones de N/P de 0, 1 a 20 a temperatura ambiente durante 20 minutos en un volumen final de 20 μl. La mezcla se diluyó hasta 0, 5 ml con DMEM sin suero y se añadió a cada pocilio. Las células sin transfectar y el pEGFP-N3 desnudo se usaron como controles negativos. Como control positivo se realizó un experimento de transfección usando 1 μl de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y 1, 0 μg de ADN, según las instrucciones del fabricante. Las células se incubaron con las mezclas de ADN-βCD policatiónica anfifílica durante 18 h, luego se eliminó el medio de transfección y las células se cultivaron adicionalmente en medio DMEM más 10% de SBF durante un periodo adicional de 48 h.
Ensayos de fluorescencia y de proteínas. Las células transfectadas se lavaron tres veces con PBS y se añadieron 600 μl de tritón X-100 al 0, 5% en PBS. Las placas se agitaron durante 10 min a temperatura ambiente, el lisado se recuperó y la fluorescencia se cuantificó en un fluorímetro Shimadzu RF-5301 PC con longitudes de onda de excitación de 460 nm (5 nm) y de emisión de 510 nm (10 nm) . La concentración de proteínas se midió usando el ensayo de proteínas de Bio-Rad (Hercules, CA, EE.UU.) .
Los datos sobre las capacidades relativas de complejación de ADNp (plásmido de pEGFP-N3 que codifica GFP) de las nuevas CD policatiónicas anfifílicas a diferentes valores de N/P (relación entre nitrógenos protonables en el vehículo de CD/grupos fosfato en el plásmido) , el grado de protección del plásmido en los complejos correspondientes frente a la acción de ADNasa y la eficiencia para promover la transfección (células CHO-k1) se presentan en las figuras 3, 4 y 5, respectivamente. Los derivados de βCD modificados por una única cara 18 y 19 se usaron como compuestos de control para evaluar la influencia de la anfifilicidad en la interacción entre los macrociclos policatiónicos anfifílicos de la invención y ADNp. Aunque la arquitectura dendrítica 19 es mucho más eficaz que el derivado de heptamina 18 en la compactación del ADNp y en la protección de la degradación por ADNasa, ninguno de ellos pudo promover la transfección de genes en un grado significativo.
El derivado heptacatiónico tetradecahexanoilado 9 presentó capacidades de complejación de ADNp mejoradas en comparación con el análogo no anfifílico
18. A pesar de ello, el plásmido todavía permanece accesible a la ADNasa en los complejos 9:ADNp correspondientes y los niveles de transfección permanecieron muy bajos. Los beneficios conferidos por la anfifilicidad resultan mucho más evidentes cuando se comparó el comportamiento dentro de la serie de derivados anfifílicos policatiónicos ramificados 19, 10 y 11. El compuesto 10, que posee cadenas de hexanoato, dio lugar a complejos 10:ADNp estables que garantizaban la protección completa del ADNp del entorno para valores de N/P superiores a 4. Además, mostraron eficiencias de transfección sorprendentemente altas, análogas a las obtenidas usando Lipofectamine 2000. El aumento de la longitud de las cadenas de acilo de hexanoato a tetradecanoato no alteró la eficiencia de complejación, como se observa en los datos para 11, pero disminuyó drásticamente la capacidad de transfección, lo que destaca la importancia de poder ajustar el balance hidrófobo-hidrófilo no sólo para optimizar la formación de nanopartículas de CD policatiónica anfifílica-ADN, sino también para los procesos adicionales que conducen a la internalización de células y la expresión génica. La facilidad y eficacia con que este ajuste puede realizarse en el caso de los compuestos de formula (I) es una característica importante de la presente invención.
Los compuestos 16 y 17 reproducen la decoración de poliaminotriazol/tetradeca-O- hexanoílo de 10 y 11 en la cara primaria y secundaria de la βCD, respectivamente, pero incorporan un brazo espaciador entre los anillos de triazol y el núcleo macrocíclico que dota al sistema de una flexibilidad mucho mayor. Un análisis de los datos correspondientes indicó aumentos moderados en la estabilidad del complejo 16:ADNp, en la eficacia en la protección de ADNp contra la acción de ADNasa y en la eficiencia de la transfección de ADN en comparación con el correspondiente complejo 10:ADNp. Inesperadamente, los datos para 11 y 17 no mostraron la misma tendencia, siendo en este caso más ventajoso el motivo rígido en comparación con la arquitectura flexible.
En conjunto, los ejemplos recogidos ilustran la utilidad de los macrociclos policatiónicos anfifílicos de la invención como sistemas de transporte de moléculas y biomoléculas al interior de células, en especial de compuestos polianiónicos como loa ácidos nucleicos. Un aspecto muy importante de la invención es que los macrociclos policatiónicos anfifílicos objeto de la misma pueden prepararse mediante la combinación de procedimientos sintéticos muy eficaces, que permiten acceder a macromoléculas completamente homogéneas. La estrategia bidireccional orientada hacia la diversidad molecular, ilustrada en los ejemplos anteriores, es especialmente adecuada para la realización de estudios estructura-actividad y de optimización. Se ha mostrado que la flexibilidad molecular, la densidad de carga y el equilibrio hidrófobo-hidrófilo son parámetros críticos que pueden ajustarse con exactitud en los compuestos objeto de la invención.
