c) mezclar bajo agitación las soluciones obtenidas en a) y b) con formación espontánea de las nanopartículas. La invención hace referencia asimismo al uso de un sistema como se ha definido anteriormente para mejorar la estabilidad en un producto cosmético.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Imágenes de TEM de sistemas nanoparticulares elaboradas a base de sulfato de condroitina asociando kinetina.
Figura 2. Imágenes de TEM de sistemas nanoparticulares elaboradas a base de ácido hialurónico asociando kinetina.
Figura 3. Estudio de liberación de kinetina a partir de nanopartículas: Modulación de los perfiles de liberación mediante modificación de la composición de las nanopartículas. Nanopartículas elaboradas empleando: ácido hialurónico (A) , sulfato de condroitina (B) o mezclas sulfato de condroitina/gelatina previamente cationizada (C) .
Figura 4. Estudio de liofilización: Tamaño medio de sistemas nanoparticulares elaborados a base de sulfato de condroitina asociando kinetina (carga de 2.5%) antes y después de su liofilización en presencia de diferentes porcentajes de trealosa como agente crioprotector.
Figura 5. Estudio de estabilidad: Evolución del tamaño medio durante el almacenamiento a diferentes temperaturas de sistemas nanoparticulares elaborados a base de sulfato de condroitina asociando kinetina (carga de 2.5%) , liofilizados en presencia de diferentes porcentajes de trealosa como agente crioprotector.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se dirige a la elaboración de sistemas nanoparticulares para la administración de moléculas bioactivas para uso cosmético, que comprende nanopartículas con un tamaño medio inferior a 1 micrómetro, donde dichas nanopartículas comprenden al menos un polímero aniónico; un agente reticulante catiónico; y opcionalmente un polímero catiónico; y caracterizado porque las nanopartículas se encuentran entrecruzadas mediante interacciones de tipo electrostático.
En la presente invención, por el término "nanopartículas" se hace referencia a estructuras estables y de características homogéneas, reproducibles y modulables perfectamente diferenciables de sistemas autoensamblados, que se forman como consecuencia de un proceso controlado de entrecruzamiento ionotrópico del polímero aniónico constitutivo de las mismas mediado por agentes reticulantes catiónicos. La interacción electrostática que resulta entre los diferentes componentes de las nanopartículas en el proceso de reticulación genera entidades físicas características, que son independientes y observables, cuyo tamaño promedio es inferior a 1 μm, es decir, un tamaño promedio de entre 1 y 999 nm.
Por el término "tamaño promedio" se entiende el diámetro promedio de la población de nanopartículas, que comprende la estructura reticulada polimérica, que se mueve junta en un medio acuoso. El tamaño promedio de estos sistemas puede medirse utilizando procedimientos estándar conocidos por el experto en la técnica.
Las nanopartículas del sistema de la invención tienen un tamaño de partícula promedio inferior a 1 μm, es decir, tienen un tamaño promedio de entre 1 y 999 nm, preferiblemente de entre 50 y 600 nm, incluso más preferiblemente de entre 100 y 400 nm. El tamaño promedio de las partículas está influido principalmente por la composición y las condiciones de formación de partículas.
Por otra parte, las nanopartículas pueden presentar una carga eléctrica (medida mediante el potencial Z) , cuya magnitud puede tomar valores positivos o negativos dependiendo de la proporción de los diferentes componentes en el sistema. En una realización particular de la invención, las nanopartículas presentan carga negativa que puede variar entre -1 mV y -30 mV.
El potencial zeta de partícula de los sistemas de la invención puede medirse utilizando procedimientos estándar conocidos por el experto en la técnica, y que se describen, por ejemplo, en la parte experimental de la presente memoria descriptiva.
Polímero aniónico
Por el término "polímero aniónico" se entiende cualquier polímero, preferiblemente de origen natural, con una carga neta negativa, incluyendo en dicha definición aquellos polímeros amónicos sobre los que se han efectuado modificaciones tales como fragmentación enzimática o química o derivatización. En una realización particular, el polímero aniónico se selecciona entre ácido hialurónico o sales del mismo, sulfato de condroitina, así como fragmentos de los mismos o derivados de los mismos.
Ácido hialurónico
El ácido hialurónico o hialuronano es un glucosaminoglicano ampliamente distribuido a lo largo de los tejidos conjuntivo, epitelial y neural. Es uno de los principales componentes de la matriz extracelular y en general contribuye significativamente a la proliferación y migración celular.
El hialuronano es un polímero lineal que comprende la repetición de una estructura de disacárido formada por la adición alterna de ácido D-glucurónico y D-N-acetilglucosamina, unidos alternando enlaces beta-1, 4 y beta-1, 3 glucosídicos tal como se muestra en la siguiente fórmula:
en la que el número entero n representa el grado de polimerización, es decir, el número de unidades de disacárido en la cadena de hialuronano.
En el contexto de la presente invención, se puede emplear ácido hialurónico con un amplio intervalo de pesos moleculares. El ácido hialurónico de elevado peso molecular está comercialmente disponible, mientras que el de peso molecular inferior puede obtenerse mediante la fragmentación del ácido hialurónico de elevado peso molecular, utilizando, por ejemplo, una enzima hialuronidasa.
El término "hialurónico, ácido hialurónico, hialuronano" tal como se utiliza en la presente descripción incluye o bien el ácido hialurónico o bien una base conjugada del mismo (hialuronato) . Esta base conjugada puede ser una sal alcalina del ácido hialurónico que incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, sales orgánicas tales como sales de aminoácidos básicos a pH neutro, preferiblemente dichas sales son farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida de la invención, la sal alcalina es la sal de sodio del ácido hialurónico.
Sulfato de condroitina
El sulfato de condroitina es un glucosaminoglucano (GAG) sulfatado compuesto por una cadena de azúcares alternados. Se encuentra normalmente unido a proteínas como parte de un proteoglucano. Se representa mediante la siguiente estructura:
en la que n es un número entero y representa el grado de polimerización, es decir, el número de unidades de disacáridos en la cadena de sulfato de condroitina y en la que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo SO3H. Cada monosacárido puede dejarse sin sulfatar, sulfatarse una vez, o sulfatarse dos veces. La sulfatación está mediada por sulfotransferasas específicas.
En el contexto de la presente invención, el término "sulfato de condroitina" incluye todos sus diferentes isómeros y derivados, así como combinaciones de los mismos.
En una realización particular, el sulfato de condroitina se selecciona entre las siguientes sustancias y combinaciones de las mismas:
- sulfato de condroitina A que está sulfatado predominantemente en el carbono 4 del azúcar N-acetilgalactosamina (GalNAc) y que también se conoce como sulfato de 4-condroitina (R1=H, R2=SO3H y R3=H)
- sulfato de condroitina B que se denomina también sulfato de dermatano. Esta sustancia está compuesta por unidades de repetición lineales que contienen N-acetilgalactosamina y o bien ácido L-idurónico o bien ácido glucurónico, y cada disacárido puede estar sulfatado una vez o sulfatado dos veces.
- sulfato de condroitina C que está sulfatado predominantemente en el carbono 6 del azúcar GalNAc y que se conoce también como sulfato de 6-condroitina (R1=SO3H, R2=H y R3=H) ;
- sulfato de condroitina D que está sulfatado predominantemente en el carbono 2 del ácido glucurónico y en el carbono 6 del azúcar GalNAc y se conoce también como sulfato de 2, 6-condroitina (R1=SO3H, R2=H y R3= SO3H) ;
- sulfato de condroitina E que está sulfatado predominantemente en los carbonos 4 y 6 del azúcar GalNAc y se conoce también como sulfato de 4, 6-condroitina (R1=SO3H, R2= SO3H y R3=H) ;
El término "sulfato de condroitina" también incluye sales orgánicas e inorgánicas del mismo. Generalmente, tales sales se preparan, por ejemplo, mediante reacción de la forma básica de este compuesto con una cantidad estequiométrica del ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales inorgánicas incluyen, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y las sales orgánicas incluyen, por ejemplo, sales de etilendiamina, etanolamina, N, N- dialquileno-etanolamina, trietanolamina, glucamina y aminoácidos básicos. Preferiblemente las sales son farmacéuticamente aceptables.
Las funciones de la condroitina dependen en buena parte de las propiedades del proteoglucano global del que es una parte. Estas funciones pueden dividirse de forma amplia en papeles reguladores y estructurales. Sin embargo, esta división no es absoluta y algunos proteoglucanos pueden desempeñar papeles tanto estructurales como reguladores.
Con respecto a su papel estructural, el sulfato de condroitina es un componente principal de la matriz extracelular, y es importante para mantener la integridad estructural del tejido. Como una parte de un agrecano, el sulfato de condroitina es un componente principal del cartílago. Los grupos sulfato sumamente cargados y de empaquetamiento compacto del sulfato de condroitina generan repulsiones electrostáticas que proporcionan mucha de la resistencia del cartílago a la compresión.
El sulfato de queratano es un glucosaminoglucano sulfatado similar al sulfato de condroitina en el que el grupo sulfato se encuentra en el glucurónico.
Agente reticulante
Las nanopartículas de la invención se caracterizan por haberse formado a través de un mecanismo de interacción iónica que provoca la precipitación conjunta de los componentes de dichas nanopartículas en forma de nanoclusters como consecuencia de la adición de un agente reticulante de carga positiva. Además de ser un procedimiento sencillo, no se requiere el uso de disolventes orgánicos o de sustancias auxiliares tóxicas. La presencia del agente reticulante catiónico permite el entrecruzamiento del polímero aniónico, y en su caso el entrecruzamiento de éste con el polímero catiónico opcional, mediante un proceso de gelificación iónica provocando la formación espontánea de las nanopartículas. De esta manera se obtienen nanopartículas con un tamaño, potencial y unas características estructurales que las hacen ser adecuadas como sistemas de administración de moléculas bioactivas.
En una realización particular, el agente reticulante es una amina de fórmula H2N-[ (CH2) x- NH- (CH2) y]z- NH2, donde x, y y z toman, independientemente, un valor comprendido entre 1 y 66. Preferentemente, x, y y z, independientemente, presentan un valor comprendido entre 1 y 10.
De forma más preferente, la amina se selecciona entre aminas naturales como espermina, espermidina y sales de las mismas. Estas aminas son componentes naturales de las células y fluidos corporales y desempeñan un papel fundamental en los procesos de proliferación y diferenciación celular y de síntesis de macromoléculas biológicas. Aunque las células son capaces de sintetizar las aminas que necesitan para los procesos de crecimiento celular, han sido descritos mecanismos de internalización celular que les permiten obtener estas aminas del torrente sanguíneo. Estos mecanismos están influenciados por proteoglucanos como el sulfato de condroitina y el ácido hialurónico (Belting M. Et al. Biochem J 1999, 338, 317-323) . Por lo tanto, parece lógico suponer un efecto sinérgico entre los constituyentes de las nanopartículas objeto de la presente invención y el agente reticulado empleado en su elaboración.
En una realización particular, la relación en peso agente reticulante/polímero aniónico está comprendida entre 0.1/1 y 0.5/1, preferentemente entre 0.2/1 y 0.4/1, lo que proporciona formulaciones con una baja polidispersidad.
Polímero catiónico
En una realización particular de la invención, las nanopartículas que constituyen el sistema pueden opcionalmente comprender un polímero de carga positiva con el fin de modular las características de los sistemas nanoparticulares que más importancia presentan en su interacción con los medios biológicos, como son el tamaño de partícula, la carga eléctrica superficial y la composición y dotarlas así de una mayor versatilidad.
En el contexto de la presente invención, se entiende por "polímero catiónico" cualquier polímero, preferentemente de origen natural, con una carga neta positiva. En una realización particular, el polímero catiónico es una proteína modificada como la gelatina cationizada.
Por "gelatina cationizada", se entiende la molécula de gelatina modificada de manera que se introducen grupos amino que le otorgan un mayor carácter catiónico al que puede poseer sin modificar.
Las nanopartículas de la presente invención proporcionan sistemas con una elevada capacidad de asociación de moléculas bioactivas para uso cosmético. En consecuencia, en un aspecto adicional la invención se refiere a un sistema como el que se ha definido anteriormente que comprende además una molécula bioactiva. La liberación de las moléculas bioactivas puede ser controlada mediante la selección de los componentes de las nanopartículas, lo cual supone un claro beneficio sobre formulaciones galénicas convencionales, en las cuales no es posible ejercer control sobre la liberación de una molécula asociada.
El término "molécula bioactiva para uso cosmético" se refiere a cualquier sustancia que se utiliza como cosmético, así como aquel compuesto que se destina a regenerar tejidos o en ingeniería de tejidos. Las nanopartículas objeto de la presente invención son adecuadas para asociar moléculas bioactivas para uso cosmético independientemente de las características de solubilidad de las mismas. La capacidad de asociación dependerá de la molécula incorporada, pero en términos generales será elevada tanto para moléculas hidrófilas, como para las de marcado carácter hidrófobo. En una realización particular, la molécula bioactiva se selecciona entre péptidos, proteínas, compuestos lipídicos o lipofílicos, compuestos sacarídicos, compuestos de ácidos nucleicos o nucleótidos como oligonucleótidos, polinucleótidos o bien combinaciones de las moléculas citadas. En una realización más particular, la molécula bioactiva es kinetina.
La kinetina es un tipo de citoquinina, un grupo de hormonas vegetales que promueven la división y diferenciación celular.
Su estructura deriva de una adenina con una cadena lateral unida al grupo amino en posición 6, responde a la N6- furfuriladenina.
La kinetina presenta propiedades antioxidantes y antienvejecimiento y por estos motivos se utiliza en tratamientos antienvejecimiento.
La proporción de molécula bioactiva incorporada en las nanopartículas puede llegar a ser de hasta el 95% en peso con respecto al peso total de los componentes de las nanopartículas. Sin embargo, la proporción adecuada dependerá en cada caso de la molécula bioactiva que va a incorporarse, la indicación para la que se utiliza y la eficiencia de administración. En una realización particular, la proporción de molécula bioactiva se encuentra entre 1 y 10% en peso.
Todas las moléculas bioactivas para uso cosmético que pueden ser incorporadas al sistema de nanopartículas de la invención mencionadas anteriormente, se pueden adicionar a las soluciones de los polímeros constituyentes de las nanopartículas previamente a la formación de las mismas o bien pueden ser adicionadas a las nanopartículas una vez formadas.
En un aspecto adicional, la presente invención se dirige a una composición cosmética que comprende el sistema de nanopartículas previamente descrito. Este sistema nanoparticular es especialmente ventajoso para constituir una composición cosmética debido a sus buenas propiedades para la administración sobre o a través de la piel, y a su estabilidad duradera.
Las composiciones cosméticas según la invención incluyen cualquier composición líquida (suspensión o dispersión de nanopartículas) o cualquier composición que comprenda el sistema de la invención y que esté en la forma de gel, crema, pomada o bálsamo para su administración por vía tópica.
Dicha composición cosmética puede ser aplicada a diversas partes superficiales del cuerpo humano o animal tal como la piel, sistema piloso y capilar, uñas, labios y órganos genitales externos, y a dientes o mucosas del cuerpo humano o animal.
En una realización particular de la invención, la composición que comprenda el sistema de la invención tiene una finalidad de higiene persona o estética, para neutralizar o eliminar ectoparásitos, para perfumar, modificar el aspecto de la superficie corporal y/o corregir olores corporales y/o protegerla o mantenerla en buen estado.
En un aspecto particular de la invención, la composición cosmética o de higiene personal también puede incorporar moléculas activas de naturaleza lipófila e hidrófila que, aunque no tengan ningún efecto terapéutico, tienen propiedades como agente cosmético o de higiene personal. Entre las moléculas activas que pueden incorporarse en las nanopartículas pueden citarse agentes emolientes, conservantes, sustancias de fragancia, agentes antiacné, agentes antifúngicos, antioxidantes, desodorantes, antitranspirantes, agentes contra la caspa, despigmentantes, agentes antiseborréicos, tintes, lociones bronceadoras, absorbentes de luz UV, enzimas, entre otros.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un sistema de nanopartículas como se ha definido previamente que comprende:
a) preparar una disolución acuosa de al menos un polímero amónico; b) preparar una disolución de un agente reticulante catiónico y, opcionalmente adicionar a dicha disolución un polímero catiónico; c) mezclar bajo agitación las disoluciones obtenidas en a) y b) con formación espontánea de las nanopartículas. La incorporación del/los polímero/s aniónico/s se lleva a cabo mediante disolución acuosa del mismo a una concentración de entre 0, 1 y 6 mg/mL, más preferiblemente entre 0.1 y 5 mg/mL.
De acuerdo con otra realización particular, el agente reticulante catiónico se disuelve en agua a una concentración de entre 0, 0625 y 1, 5 mg/mL, preferiblemente entre 0, 25 y 1, 5 mg/mL.
La formación de las nanopartículas objeto de la presente invención es consecuencia de un proceso controlado de entrecruzamiento ionotrópico de los componentes que presentan carga opuesta. Fruto de dicho proceso controlado, denominado reticulación iónica o ionotrópica, se obtienen nanopartículas de tamaño y carga superficial predeterminados, homogéneos, ajustables y reproducibles, con independencia de que se asocie o no molécula bioactiva alguna y de la carga eléctrica que ésta presente.
La molécula bioactiva para uso cosmético, y/o un compuesto estabilizante, es disuelta en una de las disoluciones a) o b) , dependiendo de la carga que posea, es decir, si presenta carga negativa se disuelve en la disolución a) y, si por el contrario, presenta carga positiva, se disuelve en la disolución b) . En un aspecto particular, cuando la molécula bioactiva es kinetina, se disuelve preferentemente en la disolución b) , habida cuenta que a pH ácido la kinetina tiene carga positiva.
El procedimiento de elaboración de las nanopartículas mencionadas puede incluir una etapa adicional de liofilización, con el fin de preservarlas durante su almacenamiento para que conserven sus características iniciales y se reduzcan los volúmenes de producto que van a manipularse. Por otra parte, el grado de reticulación de las nanopartículas puede aumentar con este proceso, ya que puede tener lugar una aproximación entre las cadenas poliméricas, lo que podría facilitar que aumente el grado de entrecruzamiento polimérico, así como que se potencie el efecto del agente reticulante. Para la liofilización de las nanopartículas puede ser únicamente necesaria la adición de pequeñas cantidades de azúcares tales como glucosa, sacarosa o trealosa a una concentración que oscila desde un 1 hasta un 5% u otras moléculas que actúen como crioprotectores y/o lioprotectores. Las nanopartículas de la invención tienen la ventaja adicional de que el tamaño de partículas antes y después de la liofilización no se modifica de manera significativa. Es decir, las nanopartículas tienen la ventaja de que pueden liofilizarse y resuspenderse sin ninguna alteración en las características de las mismas.
A continuación, para una mayor comprensión de las características y ventajas de la presente invención, se hará referencia a una serie de ejemplos que de forma explicativa completen la descripción anterior, sin suponer en modo alguno que ésta se vea limitada a los mismos.
Ejemplos Como procedimiento común a los ejemplos detallados a continuación, se ha caracterizado a las nanopartículas desde el punto de vista del tamaño, el potencial zeta (o carga superficial) y la eficacia de encapsulación.
Durante la exposición de algunos de los siguientes ejemplos se hace referencia a resultados obtenidos mediante las siguientes técnicas:
El tamaño de partícula ha sido determinado mediante la técnica de espectroscopia de correlación fotónica (PCS) y haciendo uso, para ello, de una Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, UK) obteniendo el tamaño medio de la población y el índice de polidispersión de la misma. Para ello las muestras fueron convenientemente diluidas en agua mili-Q.
El potencial Zeta partícula ha sido determinado mediante la técnica de anemometría por dispersión de láser (LDA) y haciendo uso, para ello, de una Zeta Sizer (Zeta Sizer, Nano series, Nano-ZS, Malvern Instruments, UK) . Para ello las muestras fueron convenientemente diluidas en una disolución milimolar de KCl.
La eficacia de asociación de kinetina a las nanopartículas ha sido determinada mediante una técnica espectofotométrica. Para ello, se separó en las diferentes formulaciones la kinetina asociada a las nanopartículas de la kinetina libre, mediante membranas de ultrafiltración (AmiconUltra 5000 MW, Milipore, US) en una centrífuga (Microfuge 22R centrifuge, Beckman Coulter, US) (7500 xg, 30 minutos) . La kinetina libre se cuantificó a una λ=265 nm frente a la correspondiente recta de calibrado y por diferencia se determinó la eficacia de asociación.
Para la realización del estudio de liberación de kinetina asociada a las nanopartículas se incubaron éstas a 37ºC en diferentes medios (tampón HEPES pH 7.4, tampón acetato pH 5.5, HCl 0.01N pH 2) . La kinetina liberada a diferentes tiempos se determinó de acuerdo con la metodología anteriormente descrita.
Los siguientes polímeros, tal y como se utilizan en los siguientes ejemplos, fueron adquiridos a diferentes casas comerciales: Ácido hialurónico, o hialurónico (Bioibérica, Spain) , sulfato de condroitina (Calbiochem, USA) .
La espermina fue adquirida a Sigma Aldrich (Spain) .
La kinetina fue adquirida a Sigma Aldrich (Spain) .
Ejemplo 1
Preparación de nanopartículas elaboradas a base de sulfato de condroitina y asociación a las mismas de una molécula bioactiva
Se prepararon nanopartículas de sulfato de condroitina empleando espermina como agente reticulante según el procedimiento previamente descrito. Se procedió a la asociación de una molécula hidrofílica de uso cosmético en su composición, seleccionando para tal fin una citoquinina, la kinetina. Se trata de una molécula cargada positivamente en las condiciones de formación de las nanopartículas, por lo que se incorporó junto al agente reticulante, de carga también positiva, para evitar la aparición de interacciones previas a la formación de las partículas.
Para ello se prepararon disoluciones acuosas de sulfato de condrotina en tampón acetato (15 mM, pH 5.5) a una concentración de 1.5 mg/mL. Como agente reticulante se empleó espermina disuelta en agua mili-Q a una concentración de 0. 375 mg/mL. La kinetina se incorporó en una proporción de 2.5 y 5% en peso con respecto a los componentes anteriores, para lo cual se disolvió previamente en HCl 0.1N y se incorporó a la disolución del agente reticulante. La disolución resultante se mezcló con la disolución de sulfato de condroitina, bajo agitación magnética, la cual se mantuvo durante media hora, permitiendo la completa evolución del sistema hacia una forma nanoparticular estable. La Tabla 1 muestra el diámetro medio, carga eléctrica superficial (potencial zeta) y la eficacia de asociación de la kinetina a los sistemas obtenidos.
TABLA 1 Características físico-químicas de las nanopartículas de sulfato de condroitina (ChS) empleando espermina (SPM) como agente reticulante y asociando kinetina (n=3) 
Ejemplo 2
Caracterización morfológica de nanopartículas elaboradas a base de sulfato de condroitina asociando una molécula bioactiva
Se prepararon nanopartículas a partir de sulfato de condroitina empleando espermina como agente reticulante según el procedimiento previamente descrito, conteniendo kinetina (carga de 2.5%) . Los sistemas fueron caracterizadas morfológicamente mediante microscopía de transmisión (TEM) (CM12, Philips, Eindhoven, The Netherlands) , utilizando ácido fosfotúngstico 1% como agente de contraste. La Figura 1 muestra las correspondientes imágenes. En dichas imágenes puede comprobarse que los sistemas nanoparticulares presentan una forma regular esférica.
Ejemplo 3
Preparación de nanopartículas elaboradas a base de sulfato de condroitina asociando una molécula bioactiva y modulación de su carga superficial mediante incorporación de un polímero catiónico
Se prepararon nanopartículas de sulfato de condroitina utilizando espermina como agente reticulante iónico, según el procedimiento previamente descrito. Se procedió a la incorporación de un excipiente polimérico de carga opuesta al sulfato de condroitina, la gelatina previamente cationizada con espermina, con el fin de modular las características de las nanopartículas, concretamente la carga eléctrica superficial. Además se procedió a la incorporación de kinetina que se incorporó junto al agente reticulante, de carga también positiva, y la gelatina cationizada para evitar la aparición de interacciones previas a la formación de las partículas.
Para ello se preparó una disolución acuosa de sulfato de condroitina en tampón HEPES (15 mM, pH 7.4) a una concentración de 1.5 mg/mL y una disolución acuosa de gelatina previamente cationizada en agua mili-Q a una concentración de 2 mg/mL, y se mezclaron en una relación de masas de 5:3.5. Como agente reticulante se empleó espermina disuelta en agua mili-Q a una concentración de 0.375 mg/mL. La kinetina se incorporó en una proporción de 2.5% en peso con respecto a los componentes anteriores, para lo cual se disolvió previamente en HCl 0.1N y se incorporó a la disolución del agente reticulante y gelatina cationizada. La disolución resultante se mezcló con la disolución de sulfato de condroitina, bajo agitación magnética, la cual se mantuvo durante media hora, permitiendo la completa evolución del sistema hacia una forma nanoparticular estable.
De este modo, se prepararon nanopartículas con un tamaño medio de partícula de 248 ± 2 nm (índice de polidispersión de 0.047) , carga eléctrica superficial negativa, de -5.8 ± 1.2 mV y una eficacia de asociación de la molécula bioactiva de 41 ± 4%.
Ejemplo 4
Preparación de nanopartículas elaboradas a base de ácido hialurónico y asociación a las mismas de una molécula bioactiva
Se prepararon nanopartículas de ácido hialurónico empleando espermina como agente reticulante según el procedimiento previamente descrito. Se procedió a la asociación de kinetina que se incorporó junto al agente reticulante, de carga también positiva, para evitar la aparición de interacciones previas a la formación de las partículas.
Para ello se prepararon disoluciones acuosas de ácido hialurónico en tampón acetato (15 mM, pH 5.5) a una concentración de 4.5 mg/mL. Como agente reticulante se empleó espermina disuelta en agua mili-Q a una concentración de 1.125 mg/mL. La kinetina se incorporó en una proporción de 5 y 10% en peso con respecto a los componentes anteriores, para lo cual se disolvió previamente en HCl 0.1N y se incorporó a la disolución del agente reticulante. La disolución resultante se mezcló con la disolución de ácido hialurónico, bajo agitación magnética, la cual se mantuvo durante media hora, permitiendo la completa evolución del sistema hacia una forma nanoparticular estable. La Tabla 2 muestra el diámetro medio, carga eléctrica superficial (potencial zeta) y la eficacia de asociación de los sistemas obtenidos.
TABLA 2 Características físico-químicas de las nanopartículas de ácido hialurónico (HA) empleando espermina (SPM) como agente reticulante y asociando kinetina (n=3) 
Ejemplo 5
Caracterización morfológica de nanopartículas elaboradas a base de ácido hialurónico asociando una molécula bioactiva
Se prepararon nanopartículas a partir de ácido hialurónico empleando espermina como agente reticulante según el procedimiento previamente descrito, conteniendo kinetina (carga de 5%) . Los sistemas fueron caracterizadas morfológicamente mediante microscopía de transmisión (TEM) (CM12, Philips, Eindhoven, The Netherlands) , utilizando ácido fosfotúngstico 1% como agente de contraste. La Figura 2 muestra las correspondientes imágenes. En dichas imágenes puede comprobarse que los sistemas nanoparticulares presentan una forma regular esférica.
Ejemplo 6
Perfiles de liberación de una molécula bioactiva a partir de nanopartículas y modificación del mismo mediante la selección de los componentes de dichas nanopartículas
Se prepararon nanopartículas empleando espermina como agente reticulante según el procedimiento previamente descrito, asociando kinetina (carga de 5%) . Los sistemas fueron sometidos a un estudio de liberación in vitro en diferentes medios de liberación (tampón HEPES buffer pH 7.4, tampón acetato pH 5.5 o HCl 0.01N pH 2) . La Figura 3 muestra los correspondientes perfiles de liberación. Como puede comprobarse, dichos perfiles pueden ser modulados mediante una adecuada selección de la composición de las nanopartículas: elaboradas empleando: ácido hialurónico (A) , sulfato de condroitina (B) o mezclas sulfato de condroitina/gelatina previamente cationizada (C) .
Ejemplo 7
Liofilización de nanopartículas elaboradas a base de sulfato de condroitina asociando una molécula bioactiva
Se prepararon nanopartículas a partir de sulfato de condroitina empleando espermina como agente reticulante según el procedimiento previamente descrito, asociando kinetina (carga de 2.5%) . La suspensión de las nanopartículas fue liofilizada a una concentración de 1 mg/mL en presencia de trealosa como agente crioprotector a diferentes concentraciones (10, 5 y 2.5% p/v) . Para ello las formulaciones fueron sometidas a un proceso de congelación a -80ºC y subsiguiente liofilización (Virtis Genesis freeze dr y er, 25ES, Virtis, NY, USA) . Tras la liofilización, los sistemas nanoparticulares fueron resuspendidos sin dificultad mediante adición de 1 mL de agua mQ, dando lugar a una suspensión de las nanopartículas a una concentración de 1 mg/mL y, a continuación, se determinó el tamaño medio de las nanopartículas. La Figura 4 muestra el tamaño medio de los sistemas nanoparticulares antes y después de su liofilización. Como puede comprobarse, el tamaño medio de los sistemas nanoparticulares se mantiene durante el proceso de liofilización.
Ejemplo 8
Estabilidad de sistemas nanoparticulares liofilizados elaborados a base de sulfato de condroitina asociando una molécula bioactiva durante el almacenamiento a diferentes temperaturas
Se prepararon nanopartículas a partir de sulfato de condroitina empleando espermina como agente reticulante según el procedimiento previamente descrito, asociando kinetina (carga de 2.5%) . La suspensión de las nanopartículas fue liofilizada según el procedimiento previamente descrito a una concentración de 1 mg/mL y en presencia de 5% p/v de trealosa. Posteriormente los liofilizados se almacenaron a diferentes temperaturas. A diferentes tiempos de almacenamiento los sistemas nanoparticulares fueron resuspendidos sin dificultad mediante adición de 1 mL de agua mQ, dando lugar a una suspensión de las nanopartículas a una concentración de 1 mg/mL y, a continuación, se determinó el tamaño medio de las nanopartículas. La Figura 5 muestra la evolución del tamaño medio el tamaño medio de los sistemas nanoparticulares. Como puede comprobarse, éste se mantiene durante el almacenamiento a diferentes condiciones de temperatura.
Ejemplo 9
Cationización de gelatina
La gelatina cationizada con espermina ha sido sintetizada según el método descrito por Seki et al. (Journal of Pharmaceutical Sciences 2006, 95 (6) , 1393-1401) . Para ello se preparó una disolución de gelatina al 1% p/v (100 mg de gelatina en 10 ml de tampón fosfato 0.1 M, pH 5.3) , a la que se añadieron 1620 mg (4.65 mmoles) de espermina y 267.5 mg (1.39 mmoles) de N- (3-dimetilaminopropil) -N'-etil-carbodiimida hidroclorhidrato (EDC) . Seguidamente se ajustó el pH (pH=4.5) a un valor de pH=5 con NaOH, y el conjunto se dejó reaccionar durante 18 h en baño termostatizado, a 37 ± 1ºC. Posteriormente el conjunto se dializó y se liofilizó, obteniendo así la gelatina cationizada con etilendiamina que se reservó para su posterior utilización.
