Composición celular in vitro con sobreexpresión simultánea de genes humanos mutados PS1M146V, APPSwe y tauP301L.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un modelo in vitro obtenido a partir de ratones 3xTg-AD para la enfermedad de Alzheimer con sobreexpresión simultánea de PS1M146V, APPSwe y tauP301L así como su utilidad para el estudio de las bases biológicas de la enfermedad de alzheimer y/o enfermedades relacionadas con patología tau y beta-amiloide y para la evaluación de terapias preventivas, terapéuticas y/o paliativas para esta enfermedad.
Estado de la técnica
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa de carácter progresivo, de origen todavía desconocido, y frente a la que no se puede, actualmente, ofrecer ningún tratamiento capaz de curarla o prevenirla. Afecta al 5-7% de las personas de más de sesenta y cinco años y es la causa de invalidez, dependencia y mortalidad más frecuente entre las personas de edad avanzada. Según los datos disponibles en la Fundación Alzheimer España (http://www.fundacionalzheimeresp.org) cerca de 700.000 personas están afectadas en España y se manifiestan más de 100.000 nuevos enfermos al año, lo que representa que más de dos millones de españoles y sus familiares, hoy en día, ven su vida trastornada por la enfermedad. Según las últimas estimaciones, 8 millones de europeos están afectados por la enfermedad de Alzheimer y además teniendo en cuenta el envejecimiento de la población se prevé que el número de enfermos se duplique en 2020 y triplique en 2050.
A nivel neuropatológico la EA se caracteriza por dos estructuras anormales que se acumulan en el cerebro: depósitos amiloides y placas neurofibrilares. Los depósitos amiloides son fibras extracelulares formadas por β-amiloide, (βA, concretamente βA40 y βA42) , péptidos generados por la ruptura proteolítica de la proteína precursora de β-amiloide (APP) . Las marañas neurofibrilares, en contraste, son filamentos intracelulares formados por la polimeración de tau, que normalmente funciona como proteína asociada a los microtúbulos en los axones neuronales. Aunque hoy en día, existe considerable debate acerca de si las fibras de βA y los filamentos de tau poseen toxicidad intrínseca o simplemente son resultado de otros procesos neurodegenerativos, numerosas evidencias confirman el papel de tau y βA en la neurodegeneración. A pesar de las investigaciones iniciales encaminadas a dilucidar el papel individual de tau y βA en la EA, los últimos estudios indican que la patología amiloide puede empeorar la patología tau y que no necesariamente los tratamientos que mejoran la patología amiloide mejoran también la patología tau, de ahí la necesidad de disponer de modelos para la enfermedad de alzheimer que presenten patología tau y βA de manera simultánea. La proteína precursora de beta-amiloide (APP) es una proteína transmembrana ampliamente conocida por su papel en la enfermedad de Alzheimer. En los cerebros de pacientes con EA las placas amiloides conteniendo agregados de beta-amiloide aparecen en regiones cerebrales específicas, desencadenando una respuesta inflamatoria, muerte neuronal y deteriodo cognitivo progresivo. Uno de los mecanismos por los cuales el péptido beta-amiloide se genera a partir de APP es la ruptura de APP en una posición extracelular (sitio beta) seguido por una ruptura inusual dentro del segmento transmembrana de APP (sitio gamma) , generando un fragmento de APP que contiene 39-43 aminoácidos. Varias mutaciones en la proteína APP han sido correlacionadas con la EA debido al incremento o alteración en la transformación de APP en beta-amiloide, en particular la transformación de APP a cantidades grandes de la forma larga de beta-amiloide (es decir beta-amiloide 40 y beta-amiloide 42) . El péptido β-amiloide ha sido implicado ademas en defectos neuropatológicos en individuos con el síndrome de Down. Por ejemplo, prácticamente todos los individuos con síndrome de Down, que poseen una copia extra del cromosoma 21 muestran alteraciones neuropatológicas similares a las observadas en la enfermedad de alzheimer si sobreviven más allá de los 40 años y esto parece ser debido a una producción excesiva de β-amiloide, la cual está codificada por el gen de APP localizado en el cromosoma 21.
Durante los últimos años, los modelos animales para la enfermedad de Alzheimer han proporcionado oportunidades excelentes para profundizar en el conocimiento de la etiopatología y de las terapias para la enfermedad. Las principales características de la enfermedad de Alzheimer han sido reproducidas en diferentes modelos murinos obtenidos a partir de ratones transgénicos, obtenidos por ingeniería genética incorporando alguno de los transgenes que en humanos están presentes en los pocos casos (sólo un 10%) de Alzheimer de tipo familiar, principalmente modelos que sobreexpresan el gen APP que da lugar a la proteína precursora del βA. Sin embargo, ninguno de estos modelos había logrado aunar las principales características neuropatológicas, conductuales y neuroquímicas de la enfermedad de Alzheimer hasta que en el año 2003 el Profesor LaFerla desarrolló los ratones triple transgénicos 3xTgAD. Se ha demostrado que los ratones 3xTgAD, con transgenes humanos PS1M146V, APPSwe y tauP301L, presentan los caracteres más sobresalientes de la EA y desarrollan, progresivamente, placas de βA y marañas neurofibrilares de Tau en un patrón temporal y neuroanatómico paralelo al de humanos. Además, presentan disfunción sináptica, deficiencias colinérgicas y conductuales, de forma dependiente a la edad pero iniciándose antes de la patología de placas y marañas, y los déficits en plasticidad sináptica a largo plazo correlacionan con la acumulación de βA a nivel intracelular. En base a todo ello, los ratones 3xTg-AD proporcionan un modelo animal único para estudiar la neurobiología de la enfermedad y evaluar estrategias preventivas y terapéuticas potenciales sobre ambos tipos de lesión (patología tau y beta-amiloide) y otras deficiencias celulares y moleculares presentes en la enfermedad de Alzheimer.
Uno de los mayores desafíos en las aproximaciones a la patogénesis de la EA es el desarrollo de modelos celulares adecuados en los que se reproduzcan determinados aspectos celulares, moleculares y bioquímicos de la EA en humanos. A pesar de la proliferación y utilidad de modelos transgénicos in vivo para la EA, en todos ellos las alteraciones neuropatológicas de la EA no aparecen antes de los 2 meses de edad del animal. Esto conlleva que no se pueden realizar estudios de las bases neurobiológicas de la enfermedad ni evaluar sustancias preventivas y/o terapéuticas para la EA hasta una cierta edad del animal. Además, las aproximaciones in vivo son extremadamente costosas tanto en términos de tiempo como económicos debido al coste del mantenimiento de los animales, la muerte prematura y el número de animales que se necesitan para cada uno de estos estudios, etc por lo que el potencial preventivo y/o terapéutico de distintos tipos de estrategias para la EA que pueden tener enorme valor terapéutico, no pueden ser evaluadas mediante estos métodos.
Descripción de la invención
Breve descripción de la invención
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un modelo celular in vitro para evaluar la eficacia de compuestos y materiales para modificar, tratar o prevenir enfermedades relacionadas con patología tau, beta-amiloide o APP que comprende el empleo de cultivos primarios de neuronas corticales obtenibles a partir de embriones de ratones 3xTgAD cultivados en condiciones despolarizantes.
Por "patologías relacionadas con patología tau, beta-amiloide o APP" se entiende cualquier enfermedad que curse con incremento en los agregados de proteína tau, y/o incremento de los niveles de beta-amiloide o proteína precursora de beta amiloide.
En una realización preferida de la invención los compuestos evaluados se seleccionan del grupo que consiste en péptidos, polipéptidos, proteínas, agentes biológicos o fármacos. En una realización más preferida de la presente invención la enfermedad es la enfermedad de Alzheimer. En una realización aún más preferida de la presente invención la evaluación se lleva a cabo empleando métodos de HTS (high through-put screening) . En aún otra realización de la invención los cultivo primarios de neuronas se obtienen a partir de embriones de ratones 3XTgAD cuya edad está comprendida entre 15-17 días.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición (de aquí en adelante composición de la presente invención) que comprende cultivos primarios de neuronas corticales obtenibles a partir de la corteza cerebral de embriones de ratones 3xTgAD de 15-17 días de gestación y que se mantienen en condiciones despolarizantes.
Los "ratones 3xTgAD" descritos en la presente invención se refieren a ratones triple transgénicos obtenibles mediante el procedimiento detallado en la solicitud internacional WO2003/053136 y proporcionados por los titulares de dicha solicitud.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método de preparación de la composición de la inven- ción.
Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere al uso de la composición de la invención para el estudio de las bases biológicas de enfermedades relacionadas con patología tau, beta-amiloide o APP. En una realización preferida de la presente invención, la composición de la invención se emplea para evaluar la eficacia de compuestos y materiales para modificar, tratar o prevenir enfermedades relacionadas con patología tau, beta-amiloide o APP. En un aspecto aún más preferido de la invención la composición la enfermedad es la enfermedad de Alzheimer.
Descripción las figuras
La Figura 1 muestra una imagen de microscopía confocal en la que se representa la expresión de la proteína precursora de beta-amiloide (APP) en cultivos silvestres (A) y cultivos neocorticales obtenidos de animales triple transgénicos (B) . A los 8 días en cultivo la expresión de APP está incrementada en cultivos primarios obtenidos de animales triple-transgénicos. Barra de escala 20 μm.
La Figura 2 muestra una imagen de microscopía confocal en la que se representa la expresión de beta-amiloide en cultivos silvestres (A) y cultivos neocorticales obtenidos de animales triple transgénicos (B) . A los 8 días en cultivo la expresión de βA está incrementada en cultivos primarios obtenidos de animales triple-transgénicos. Barra de escala 20 μm.
La Figura 3 muestra una imagen de microscopía confocal en la que se representa la expresión de Tau 46 (tau total) en cultivos silvestres (A) y cultivos neocorticales obtenidos de animales triple transgénicos (B) después de 8 div. A los 8 días en cultivo la expresión de Tau total está incrementada en cultivos primarios obtenidos de animales triple-transgénicos. Barra de escala 20 μm.
La Figura 4 muestra una imagen de microscopia confocal en la que se representa la expresión de Tau HT7 (residuos 159-163 de la proteína) en cultivos silvestres (A) y cultivos neocorticales obtenidos de animales triple transgénicos (B) después de 8 div. A los 8 días en cultivo la expresión de Tau está incrementada en cultivos primarios obtenidos de animales triple-transgénicos. Barra de escala 20 μm.
La Figura 5 muestra una imagen de microscopia confocal en la que se representa la expresión de Tau AT8 (Tau fosforilada en Ser 202) en cultivos silvestres (A) y cultivos neocorticales obtenidos de animales triple transgénicos (B) después de 8 div. A los 8 días en cultivo la expresión de Tau fosforilada en Ser 202 está incrementada en cultivos primarios obtenidos de animales triple-transgénicos. Barra de escala 20 μm.
La Figura 6 muestra una imagen de microscopia confocal en la que se representa la expresión de Tau AT100 (tau phosphorilada en Thr 212 y Ser 214) en cultivos silvestres (A) y cultivos neocorticales obtenidos de animales triple transgénicos (B) después de 8 div. A los 8 días en cultivo la expresión de esta isoforma proteica está incrementada en cultivos primarios obtenidos de animales triple-transgénicos. Barra de escala 20 μm.
La Figura 7 muestra una imagen de microscopia confocal en la que se representa la expresión de Tau AT270 (Tau phosphorilada en Thr 181) en cultivos silvestres (A) y cultivos neocorticales obtenidos de animales triple transgénicos (B) después de 8 div. A los 8 días en cultivo la expresión de esta isoforma de la proteína está incrementada en cultivos primarios obtenidos de animales triple-transgénicos. Barra de escala 20 μm.
La Figura 8 muestra una imagen de microscopía confocal en la que se representa la expresión de Tau 46 (tau total) en cultivos silvestres (A) y cultivos neocorticales obtenidos de embriones de animales triple transgénicos (B) después de 14 div. A los 14 días en cultivo la expresión de Tau total está incrementada en cultivos primarios obtenidos de animales triple-transgénicos. Barra de escala 20 μm.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se enfrenta al problema técnico de encontrar una solución que solvente los problemas asociados a los modelos transgénicos in vivo para la EA que existen hoy en día.
En este sentido, la presente invención proporciona un modelo in vitro nuevo, rápido, eficaz y reproducible para estudiar las bases biológicas y evaluar terapias y compuestos para el tratamiento y prevención de la enfermedad de Alzheimer y/o enfemedades asociadas a Tau y βA basado en el empleo de una composición que comprende cultivos primarios de neuronas corticales obtenibles a partir de embriones de ratones 3xTgAD que se mantienen in vitro en condiciones despolarizantes.
Para explorar en profundidad las funciones celulares y propiedades de los productos génicos relacionados con la EA, los modelos celulares son indispensables. Por otra parte, aunque tanto astrocitos como neuronas producen niveles elevados de beta-amiloide, las neuronas son más drásticamente afectadas por la enfermedad. Por consiguiente el estudio de las células neuronales parece más relevante para comprender los aspectos moleculares o las cascadas patológicas causantes de la EA así como para iniciar el estudio de terapias preventivas y/o terapéuticas para la misma.
En el caso del los ratones 3xTgAD, los transgenes humanos PS1M146V, APPSwe y tauP301L son expresados bajo el control del promotor Thy1.2 que dirige la expresión de los mismos predominantemente al sistema nervioso central, y se expresan ya en estadios embrionarios.
A pesar de que en embriones de ratones 3xTgAD la sobreexpresión de los transgenes humanos para PS1M146V, APPSwe y tauP301L es 3 veces mayor que en embriones de ratones control, hasta el momento no se ha podido establecer un modelo in vitro con sobreexpresión de estos transgenes ya que la expresión del promotor Thy1.2 es demasiado baja en el embrión lo cual impide obtener sobreexpresión de los transgenes en condiciones habituales de cultivo de neuronas corticales. De hecho, hasta el momento la baja expresión del promotor Thy1.2 en el embrión, ha imposibilitado la obtención de un modelo neuronal in vitro obtenido a partir de células embrionarias. En el modelo descrito en la presente invención y en las condiciones de cultivo descritas, los transgenes humanos están activados en cultivos neuronales in vitro tal como se demuestra en la presente invención y además se sobreexpresan de forma dependiente del tiempo en cultivo, por lo tanto los cultivos neuronales primarios obtenidos de embriones de ratones 3xTgAD constituyen un modelo singular para la EA.
Las condiciones de cultivo indispensables para conseguir una expresión génica dependiente del tiempo son condiciones despolarizantes (KCl 10-25 mM) y elevada densidad de siembra (más de 2.800.000 células por ml) .
Por ello, este modelo in vitro proporciona un modelo multidimensional único para estudiar las bases biológicas de la enfermedad y evaluar estrategias preventivas y/o terapéuticas para la EA ya que se ha demostrado que algunos tratamientos en modelos que sobreexpresan únicamente beta-amiloide o tau pueden mejorar una de las patologías y empeorar la otra (por ejemplo los tratamientos crónicos con nicotina mejoran los depósitos de β-amiloide pero empeoran las marañas neurofibrilares) . Hasta la fecha no existe ningún modelo in vitro que reproduzca a nivel celular, molecular y funcional el espectro neuropatológico de la enfermedad de alzheimer que muestran los pacientes humanos.
Así, la invención propuesta describe un modelo in vitro para estudiar las bases biológicas de la EA y evaluar la eficacia de compuestos y materiales, tales como productos biológicos, fármacos y productos químicos o interacciones neuroquímicas resultantes de cultivos obtenidos a partir de animales híbridos, en modificar, tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades relacionadas con patología tau, beta-amiloide o APP.
De acuerdo con esta invención, el método implica el empleo de cultivos primarios de neuronas corticales obtenidos a partir de un modelo animal para la enfermedad de Alzheimer, los ratones triple transgénicos 3xTgAD. Los cultivos celulares se obtienen a partir de fetos de ratones 3xTgAD y se comparan con cultivos no tratados o con cultivos obtenidos de ratones control non-3xTgAD proporcionando así un sistema in vitro para evaluar los efectos de diferentes compuestos en las propiedades bioquímicas y funcionales de neuronas control y neuronas con neuropatología característica de la EA y/o enfermedades relacionadas. Este método proporciona un modelo económico, fiable y rápido y permite el empleo de técnicas de análisis que no requieran esperar a alcanzar un determinado estado de desarrollo del animal tal como se emplea en modelos in vivo para la enfermedad de alzheimer. La utilización de cultivos celulares primarios, preferentemente cultivos corticales, obtenidos a partir de animales triple transgénicos 3xTgAD es una nueva aproximación para identificar y descubrir terapias (farmacológicas o no) relacionados con la prevención o tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Los cultivos celulares primarios obtenidos a partir de ratones 3xTgAD presentan numerosas ventajas sobre otras preparaciones tales como cultivos neuronales primarios obtenidos de ratones transgénicos para la EA que sobreexpresan solamente beta-amiloide o tau, rodajas de cerebro o experimentos in vivo para evaluar la eficacia de compuestos en el tratamiento o prevención de la enfermedad de alzheimer. Entre estas ventajas destacan: facilidad de acceso de sustancias aplicadas extracelularmente, capacidad para evaluar la eficacia de un compuesto después de un corto período de tiempo, fácil visualización de células y sinapsis para medidas ópticas y electrofisiológícas, capacidad para mantener acceso a las células en un entorno controlado para manipulaciones genéticas y bioquímicas, y la simplicidad de los protocolos de ensayo, diagnóstico o evaluación debido a la exclusión de diferentes tipos de células no neuronales, así como la sobreexpresión simultánea de APP, βA y Tau.
La invención propuesta describe varias utilidades basadas en el descubrimiento de que este modelo presenta sobreexpresión de β-amiloide, APP y Tau.
A lo largo de toda la descripción y reivindicaciones de la especificación, la palabra "comprende" y las variaciones de la misma, no pretenden excluir otros aspectos de la presente invención, que resultarán evidentes para un experto en la materia a la vista de la descripción.
La exposición detallada de los modos de realización (ejemplos) y de las figuras que siguen se proporciona a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.
Ejemplos de realización de la invención
Ejemplo 1
Obtención de los cultivos neuronales primarios
De acuerdo con esta invención, los cultivos neuronales primarios obtenidos de fetos de 15-17 días de gestación de animales triple transgénicos 3xTgAD constituyen un modelo celular con sobreexpresión simultánea de APP, tau y Beta-amiloide lo que permite el estudio in vitro de las bases biológicas de la enfermedad de alzheimer, incluyendo expresión génica y proteica, actividades enzimáticas, sistemas de neurotransmisión, propiedades funcionales de las neuronas afectadas por la EA y de los elementos involucrados en la cascada de beta-amiloide así como los procesos inflamatorios y excitotóxicos o de estrés oxidativo asociados a la patología de la EA.
En la presente invención los cultivos primarios se establecen a partir de embriones de 15-17 días de gestación obtenidos de ratones 3xTgAD y ratones control non-3xTgAD. El procedimiento empleado para obtener cultivos corticales primarios de acuerdo con la presente invención es el siguiente:
Los cultivos celulares, preferentemente corticales se obtienen a partir de la corteza cerebral de embriones de ratones 3xTgAD y non-3xTgAD de entre 15 y 17 días de gestación. Las hembras gestantes se sacrifican mediante anestesia con éter, se desinfecta el abdomen con etanol al 70% y se extraen los fetos. El útero, conteniendo los fetos se transfiere a una campana de flujo laminar en una placa de Petri y a continuación se extraen los fetos. La corteza cerebral se separa del resto del cerebro y las células se diseccionan empleando tratamiento enzimático y disgregación mecánica. La corteza cerebral fetal se extrae, se corta y se disocia mediante tratamiento con tripsina y posterior tratamiento con solución conteniendo inhibidor de tripsina y DNAsa. Las células disociadas se centrifugan (5 minutos a 1000 rpm) y se resuspenden en medio de cultivo de Dulbecco que contiene 10% v/v de suero fetal bovino, 10-25 mM KCl, 0.2 mM glutamina, 10 unidades/l de penicillin G, 0.1 I.U./I de insulina y 7.3 μM de ácido p-aminobenzoico. Las células se siembran en placas de cultivo pretratadas con poly-D-lysine (entre 10 y 60 mg/l) y se mantienen a 37ºC en una atmósfera húmeda con 5% CO2 /95% aire. Entre 36 y 48 horas en cultivo se añade arabinósido de citosina (20 μM) para prevenir la proliferación de células no neuronales en el caso de que se deseen obtener cultivos de neuronas corticales puros. Este último paso puede obviarse cuando sea necesario obtener cultivos mixtos de neuronas y glia. A partir de los 6 días en cultivo se ha caracterizado la sobreexpresión de la APP, tau y beta-amiloide en los cultivos neuronales primarios obtenidos de ratones 3xTgAD en comparación con los cultivos neuronales primarios obtenidos de ratones silvestres sometidos al mismo procedimiento (non-3xTgAD) .
Ejemplo 2
Evaluación de la eficacia de compuestos y materiales utilizando la composición de la presente invención
De acuerdo con esta invención cultivos neuronales primarios de animales triple transgénicos 3xTg-AD para la enfermedad de Alzheimer han sido caracterizados para evaluar la eficacia de compuestos y materiales (ejemplo, fármacos y otros agentes y sustancias biológicos o sintéticos) en el tratamiento o prevención de la enfermedad de Alzheimer o enfermedades asociadas a beta-amiloide y/o tau y APP. Los compuestos que pueden ser evaluados en este modelo incluyen pequeñas moléculas tales como péptidos y proteínas, agentes biológicos, compuestos químicos y fármacos. Preferentemente, serán compuestos no tóxicos y bien tolerados para ser empleados en el tratamiento, terapia y prevención de la EA o enfermedades asociadas a beta-amiloide y/o tau. Las respuestas de las células en este modelo celular pueden ser determinadas de manera cuantitativa, permitiendo por lo tanto determinar la actividad o efecto de un compuesto en los mecanismos moleculares, bioquímicos y fisiológicos que tengan lugar en la célula y que estén asociados con EA o enfermedades relacionadas con beta-amiloide y/o tau. Para la determinación inmunocitóquímica de la sobreexpresión proteica presente en este modelo in vitro, los cultivos neuronales obtenidos de animales 3xTgAD y non-3xTgAD se fijan en paraformaldehido al 4% y posteriormente se marcan con anticuerpos primarios frente a APP/βA (NAB228: 1:50) , β-amiloide 6E10 (1:500) , Tau 46 (Tau Total 1:500) , Tau HT7 (1:200, residuos 159-163) , Tau AT8 (Tau fosforilada en Ser 202, 1:100) , Tau AT100 (1:100, tau phosphorilada en Thr 212 y Ser 214) y Tau AT270 (1:100, Tau phosphorilada en Thr 181) . La inmunoreactividad se visualiza empleando un anticuerpo secundario fluorescente en microscopio confocal (Nikon, Mellville, NY, USA) , con una cámara ORCA-ER Hamamatsu (Hamamatsu Photonics KK, Hamamatsu, Japón) . Los controles para la especificidad de los métodos de detección se realizaron omitiendo la incubación con el anticuerpo primario en uno de cada cuatro pocillos consecutivos. Ninguno de los pocillos sin anticuerpo primario mostró ninguna señal comparable a la señal obtenida con los anticuerpos primarios.
Este proceso se puede automatizar para HTS (high throughput screening) utilizando placas de cultivo a las que previamente se añadieron las células, que fueron cultivadas durante al menos 6 días. Estas placas son suceptibles de ser incorporadas a sistemas automáticos de medición de los marcadores que interesen, mediante distintos métodos de medida (absorbancia, luminiscencia, flurescencia) . De la misma forma, el efecto de diferentes terapias en dianas celulares, moleculares y bioquímicas de relevancia para la enfermedad de Alzheimer es susceptible de ser investigado en este modelo in vitro mediante métodos de HTS empleando kits comerciales de interés para la evaluación del efecto de un tratamiento de cualquier naturaleza en la evolución de la EA o enfermedades asociadas a tau y beta-amiloide, después de que las células hayan sido sometidas al tratamiento en cuestión.
