Procedimiento para la identificación genética de la centolla europea del Atlántico (Maja brachydactyla) .
Sector de la técnica
La centolla es un recurso pesquero muy importante en Europa y, como tal, una exigencia básica de mercado es la autentificación de su origen y su correcto etiquetado. Además, se está explotando de forma intensiva y, de hecho, en el Mediterráneo, la especie más comercializada ya se considera amenazada. Por eso también es fundamental la identificación de estas especies para desarrollar programas de recuperación y repoblación, de modo que se asegure la incorporación correcta de cada especie en su área de distribución geográfica.
Estado de la técnica
La centolla es uno de los crustáceos de mayor importancia económica en las costas europeas. Pertenece al género Maja y en esta región se han definido cuatro especies: M. brachydactyla, M. squinado, M. crispata y M. goltziana (Neumann 1998) , si bien el interés comercial se centra en las dos primeras. M. brachydactyla se distribuye en el Atlántico (desde el sur del Mar del Norte hasta Senegal) mientras que M. squinado es endémica del Mediterráneo. M. crispata y M. goltziana fueron descritas inicialmente tanto en el Atlántico (desde el oeste de Portugal hasta el Golfo de Guinea) como en el Mediterráneo, aunque los registros recientes corresponden al Mediterráneo (Carmona-Suárez 2003, Fürböck y Patzner 2005; Soppelsa et al. 2005, Lelli et al. 2007) .
La diferenciación de estas especies es muy complicada, especialmente en el caso de M. brachydactyla y M. squinado; se basa en una serie de caracteres morfológicos como la forma de los primeros gonópodos, la forma de las espinas del caparazón (y su disposición) y varias medidas morfométricas (Neumann 1998) . Sin embargo, estas diferencias no son definitivas, son apreciables sólo por expertos y tienen el inconveniente añadido de que cambian a lo largo de la vida del individuo (no se observan en estado larvario y varían entre juveniles y adultos) . Por este motivo, las centollas pescadas en el Atlántico (M. brachydactyla, según Neumman) son todavía etiquetadas en los mercados como M. squinado.
Desde el punto de vista comercial, las capturas de centolla superaron las 5000 toneladas en el año 2005 (según los últimos datos disponibles de la FAO) ; y, siendo un producto muy apreciado en el mercado, alcanza además precios elevados. Se pesca casi exclusivamente en el litoral Atlántico, mientras que en el Mediterráneo es cada vez más difícil de encontrar. De hecho, en algunas zonas del Mediterráneo, M. squinado se considera una especie amenazada. Por estos motivos, se está desarrollando el cultivo en cautividad, tanto para abastecer a los mercados y paliar la sobreexplotación de las poblaciones naturales como para repoblar y recuperar las áreas más afectadas.
Para resolver los problemas de identificación, hemos llevado a cabo un estudio genético con marcadores de ADN mitocondrial: un fragmento de 710 pb del gen COI y un fragmento de 560 pb del gen 16S (Sotelo et al. 2008) , confirmando el estatus de especie de cada una de las formas propuestas.
En este estudio concluimos además que el fragmento de 16S es un marcador idóneo para la identificación de estas centollas, por ser invariable dentro de especie y variable entre especies. Conociendo la secuencia nucleotídica de estos fragmentos, es posible asignar una muestra de centolla europea de forma inequívoca a una de las cuatro especies. La ventaja de la identificación genética es su validez en cualquier etapa del desarrollo del individuo, desde larva a adulto, y su aplicación sobre una pequeña cantidad de tejido del individuo analizado, por lo que no es necesario disponer del individuo completo.
Aunque la secuenciación del fragmento del 16S es un buen método de identificación, hemos diseñado un protocolo de asignación molecular más rápido y sencillo, pero igualmente eficaz. El principal objetivo es la identificación de M. brachydactyla frente a M. squinado, ya que estas dos especies de centolla son las más parecidas morfológicamente y de mayor interés comercial. Sin embargo, para evitar cualquier posible confusión con las demás especies del Mediterráneo, éstas también se han incluido a la hora de desarrollar la técnica.
Bibliografía Carmona-Suárez CA (2003) Reproductive biology and relative growth in the spider crab Maja crispata (Crustacea: Brachyura: Majidae) . Scientia Marina 67: 75-80
Fürböck S, Patzner RA (2005) Daily movement patterns of Maja crispata Risso 1827 (Brachyura: Majidae) Acta Adriatica 46: 41-45
Lelli S, Carpentieri P, Colloca F, Ardizzone GD (2007) The spiny spider crab Maja gotziana (Crustacea: Majidae) in south Lebanese waters. JMBA2-Biodiversity Records (Published on-line)
Neumann V (1998) A review of the Maja squinado (Crustacea: Decapoda: Brachyura) species-complex with a key to the eastern Atlantic and Mediterranean species of the genus. Journal of Natural Histor y 32: 1667-1684
Soppelsa N, Zenetos A, Papathanassiou E (2005) Maja goltziana d'Oliveira, 1888 (Decapada, Brachyura, Majidae) in the southern Tyrrhenian Sea. Crustaceana 78: 121-124
Sotelo G, Moran P, Posada D (2008) Genetic identification of the northeastern Atlantic spiny spider crab as Maja brachydactyla Balss, 1922. Journal of Crustacean Biology 28: 76-81.
Explicación de la invención
El objetivo de la invención es la identificación genética inequívoca de la especie europea de centolla del Atlántico frente a las del Mediterráneo. La invención se basa en la amplificación de un fragmento de 671 pb del gen 16S del ADN mitocondrial, para el que ya había cebadores disponibles con anterioridad, y en el estudio de las diferencias en la secuencia entre las 4 especies de centolla. Teniendo en cuenta estas diferencias, se han diseñado cebadores específicos para un fragmento interno de 223 pb en M. brachydactyla. Así, ante una muestra de centolla europea, habiendo amplificado el fragmento mayor de referencia, si amplifica también el fragmento menor, podremos identificarla como M. brachydactyla. En caso contrario, sabremos que procede del Mediterráneo.
Descripción detallada de la invención (forma de realización)
El procedimiento para la identificación genética de la especie europea del género Maja (centollas) del Atlántico, M. brachydactyla, frente a las especies del mismo género del Mediterráneo, M. squinado, M. crispata y M. goltziana, consta de las siguientes etapas:
1.Extracción de ADN. 2.Amplificación por PCR de un fragmento de 671 pb del gen mitocondrial 16S. 3. Amplificación por PCR de un fragmento de 223 pb incluido en la región anterior. 1- Extracción de ADN
Para extraer ADN se parte de una muestra de tejido de 0.5 cm3, de músculo preferentemente. Se han descrito muchos protocolos de extracción, pero uno de los más sencillos y rápidos es el que utiliza la resina quelante Chelex [Estoup et al. (1996) Mol Mar Biol Biotech 5: 295-298]. Consiste en homogeneizar el tejido en 400 μL de una solución de Chelex 100 (Bio Rad) al 10%. La solución debe mantenerse caliente y en agitación antes de tratar la muestra. Para potenciar la eliminación de proteínas, se añaden 30 μL de proteasa 20 mg/mL (Pronase, Roche) al homogeneizado. Éste se incuba primero a 60ºC durante 1 hora (en un baño de agua, con agitación) y después a 99ºC durante 15 minutos (en una estufa) . Para que precipiten los restos de tejido, junto con la resina, y el ADN quede en el sobrenadante, se aplica una centrifugación final de 1 minuto.
Si la cantidad de muestra es limitante (si se trata de una larva, por ejemplo) , el kit NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel) es más adecuado porque permite recuperar más ADN y de mejor calidad. En este caso, se siguen las instrucciones del fabricante.
Para comprobar la efectividad de la extracción, una alícuota de 4 μL se somete a electroforesis en un gel de agarosa (Agarose D-1 low EEO-QDT, Pronadisa) al 1% en tampón TBE 1x. El gel lleva incorporado bromuro de etidio, de modo que el ADN se hace visible bajo luz ultravioleta (Figura 1) .
2. Amplificación de un fragmento de 671 pb del gen 16S
Para amplificar por PCR este fragmento se utilizan los cebadores 16L29 y 16HLeu (SEQ ID NO 1 y 2, respectivamente) , que ya habían sido descritos para otros crustáceos decápodos (en el laboratorio de Christoph Schubart) . Hay que indicar que el extremo 3' del fragmento corresponde al inicio del gen tRNALeu. La reacción contiene: 1 μL de extracción (ADN) , 2 μL de tampón 10x (160 mM (NH4) 2SO4, 670 mM Tris-HCl pH 8.8, 0.1% Tween 20) , 1 μL de MgCl2 50 mM, 0.5 μL de cada uno de los cebadores 20 μM, 1 μL de dNTP Mix 10 mM (Applied Biosystems) , 0.2 μL de ADN polimerasa (BIOTAQ 5 U/μL, Bioline) y agua bidestilada estéril hasta completar un volumen de 20 μL. El programa de amplificación consiste en una desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 minutos, 35 ciclos de desnaturalización a 95ºC, templado a 55ºC y extensión a 72ºC, cada paso durante 20 segundos, y una extensión final a 72ºC durante 7 minutos. El resultado se comprueba migrando 4 μL del producto de PCR en un gel de agarosa (Agarose D-1 low EEO-QDT, Pronadisa) al 2%, durante 30 minutos a 100 V. En el mismo gel se co-migran también 3 μL de un marcador de peso molecular (HyperLadder IV, Bioline) para estimar el tamaño del fragmento amplificado. Este marcador resulta en un patrón de 10 bandas, con un rango de 100 a 1000 pb (cada banda es un múltiplo exacto de 100 pb) . En toda muestra de centolla europea debe visualizarse la banda de 671 pb (Figura 2) .
3.- Amplificación de un fragmento de 223 pb específico de M. brachydactyla
Teniendo en cuenta la secuencia nucleotídica del fragmento de 671 pb en cada una de las especies (SEQ ID NO 3-6) y las posiciones que varían entre ellas (Figura 3) , se diseñaron dos cebadores específicos (16Lbr y 16Hbr, SEQ ID NO 7 y 8, respectivamente) para amplificar un fragmento interno de 223 pb en M. brachydactyla (Figura 4) . La reacción de amplificación tiene la misma composición que la indicada anteriormente, y el programa consta de una desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 minutos, 35 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 20 segundos, templado a 45ºC durante 20 segundos y extensión a 72ºC durante 15 segundos, y una extensión final a 72ºC durante 7 minutos. El resultado se comprueba del mismo modo que en el paso anterior. Si se observa una banda de 223 pb podemos identificar la muestra de centolla que se está analizando como M. brachydactyla, procedente del Atlántico (Figura 5) . En caso contrario, si no se observa ninguna banda, podemos afirmar que la muestra de centolla procede del Mediterráneo, pero no podemos identificar la especie a la que pertenece (puede ser M. squinado, M. crispata o M. goltziana) (Figura 5) .
Se trata de un método sencillo y rápido. Los equipos que se requieren son básicos en cualquier laboratorio de análisis molecular y es posible analizar simultáneamente un número elevado de muestras y obtener los resultados en horas. La gran ventaja de la identificación genética frente a la morfológica (la única disponible hasta el momento) es su aplicación a cualquier individuo independientemente de la fase vital en que se encuentre, porque no se ve afectada por cambios ontogénicos, y su aplicación a muestras pequeñas de tejido, sin necesidad de tener individuos completos e intactos.
La aportación de este procedimiento es la diferenciación de la centolla del Atlántico, M. brachydactyla, frente a las centollas del Mediterráneo, que se verifica amplificando el fragmento mayor de 671 pb y el fragmento menor de 223 pb. Actualmente, esta especie es la más importante para el comercio y se está evaluando su cultivo en cautividad, por lo que es fundamental asegurar su autenticidad en todo momento.
Descripción de las figuras
Figura 1. Fotografía de un gel de agarosa al 1% en el que se ha comprobado una extracción de ADN a partir de muestras de músculo de centolla. La primera calle de la izquierda corresponde al marcador de peso molecular HyperLadder IV, y las siguientes (de izquierda a derecha) a Maja brachydactyla (br) , M. squinado (sq) , M. crispata (cr) y M. goltziana (go) . Se observa una banda de varios Kpb, resultado de la rotura mecánica del ADN durante el proceso de extracción, pero no se detectan fragmentos pequeños (de cientos de bases) que indicarían que el ADN estaba dañado de antemano. Además, la intensidad de la banda indica que la cantidad de ADN es suficiente para poder realizar el análisis molecular.
Figura 2. Fotografía de un gel de agarosa al 2% en el que se ha comprobado la amplificación por PCR del fragmento de 671 pb del gen 16S, a partir de muestras de centolla procedentes de la costa europea. La primera calle de la izquierda corresponde al marcador de peso molecular HyperLadder IV, y las siguientes (de izquierda a derecha) a M. brachydactyla (br) , M. squinado (sq) , M. crispata (cr) y M. goltziana (go) . En las cuatro calles se observa la banda de 671 pb.
Figura 3. Alineamiento de la secuencia nucleotídica del fragmento de 671 pb del gen 16S de las cuatro especies de centolla, M. brachydactyla, M. squinado, M. crispata y M. goltziana (SEQ ID NO 3-6) . En el margen izquierdo se indica la especie a la que pertenece cada línea de la secuencia, que aparece separada en bloques consecutivos de 60 pb, tal como se indica en el margen derecho. Las columnas con un asterisco en la base se corresponden con las posiciones de la secuencia que no varían entre las especies; mientras que la ausencia de asterisco marca las posiciones variables. Las posiciones indicadas en minúscula, las 20 primeras y las 20 últimas, corresponden a los cebadores 16L29 y 16HLeu (SEQ ID NO 1 y 2) .
Figura 4. Localización de los cebadores específicos de M. brachydactyla, 16Lbr y 16Hbr (SEQ ID NO 7 y 8) , sobre el alineamiento del fragmento de 671 pb de las cuatro especies de centolla. Se indican en negrita y subrayados, y, como se puede observar, amplifican una región interna de 223 pb.
Figura 5. Fotografía de un gel de agarosa en el que se ha comprobado la amplificación específica por PCR del fragmento de 223 pb en M. brachydactyla. La primera calle de la izquierda corresponde al marcador de peso molecular HyperLadder IV, y las siguientes (de izquierda a derecha) a M. brachydactyla (br) , M. squinado (sq) , M. crispata (cr) y M. goitziana (go) . Sólo se observa la banda de 223 pb en la calle que corresponde a M. brachydactyla.
Texto libre de la lista de secuencias
SEQ ID NO 1 corresponde al cebador directo diseñado en el laboratorio de Christoph Schubart para amplificar un fragmento del gen 16S en varios crustáceos decápodos.
SEQ ID NO 2 corresponde al cebador reverso diseñado en el laboratorio de Christoph Schubart para amplificar un fragmento del gen 16S en varios crustáceos decápodos; localizado en el extremo 5' del gen tRNALeu.
