(ii) detectar el producto de amplificación mediante el empleo de una sonda marcada, en donde dicha sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su extremo 3' un pigmento quencher y presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 7 [INVAVITONE]. Tal como se ha indicado en párrafos anteriores, en la presente invención se entiende por "preparación de ácidos nucleicos" al conjunto de ácidos nucleicos, es decir, ADN, ARN y/o ADNc presentes en una muestra.
Las diferentes técnicas de extracción de ácido nucleicos, de detección de productos de amplificación, marcaje de sondas, etc. anteriormente descritos para el método 1 de la invención, son aplicables al presente método 2 de la invención.
Al igual que en el método 1 de la invención, la reacción de amplificación puede realizarse en presencia de un ADN exógeno que sirva como control interno de la amplificación. Por tanto, en una realización particular, la amplificación se lleva a cabo en presencia de un ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando pareja de cebadores que comprende las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 [INVAVITONE F/R].
En otra realización todavía más particular, el ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago λ.
Como entiende el experto en la materia, Salmonella sp. es un microorganismo ampliamente distribuido que puede sobrevivir en multitud de ambientes distintos. Así, en la puesta en práctica de los métodos de detección de Salmonella sp. descritos en la presente invención, puede emplearse cualquier tipo de muestra donde se tenga sospecha de contaminación por Salmonella sp. Típicamente, la muestra es una población bacteriana asociada a un procedimiento industrial de producción de bienes de consumo como por ejemplo industrias papeleras, industrias heladeras, industrias petroleras, industrias aceiteras, cerveceras y de tratamiento de aguas residuales o asociada a un procedimiento de manipulación de fluidos biológicos en el entorno sanitario como sistema de perfusión entéricos, sistemas de diálisis, catéteres y similares. Alternativamente, la muestra puede ser de origen biológico y comprender tejidos, células, extractos celulares, homogenados celulares, fracciones proteicas, fluidos biológicos (sangre, suero, plasma, orina, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, heces, sudor, etc.) . Alternativamente, la muestra puede consistir en órganos enteros tales como músculo, ojo, piel, gónadas, nódulos linfáticos, corazón, cerebro, pulmón, hígado, riñón, bazo, tumores.
Por tanto, en una realización particular de la invención, la muestra se selecciona del grupo que comprende una muestra ambiental (como por ejemplo, una muestra de agua o tierra) , una muestra clínica (fluidos biológicos, heces, etc.) y una muestra alimentaria (productos alimentarios perecederos, carne de pollo, huevos, cremas, etc) . De forma preferida, la muestra a analizar será una muestra alimentaria.
Tal como se ha indicado anteriormente, los inventores han desarrollado un conjunto de cebadores y sondas que permiten la detección específica de Salmonella sp.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido cuya secuencia se selecciona del grupo de secuencias SEQ ID NO: 2 [cebador INVAVITWO F], SEQ ID NO: 3 [cebador INVAVITWO R], SEQ ID NO: 4 [sonda INVAVITWO], SEQ ID NO: 7 [sonda INVAVITONE].
Los kits que comprenden los reactivos y agentes necesarios para la puesta en práctica de los métodos descritos en la presente invención constituyen aspectos adicionales de la misma.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un kit (kit 1 de la invención) que comprende una pareja de cebadores capaz de amplificar una región del gen invA de Salmonella sp. que comprende la región de dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1.
En una realización particular del kit, la pareja de cebadores comprende las secuencias SEQ ID NO: 2 y 3 [INVAVITWO F/R].
En otra realización particular, dicho kit comprende, además, una sonda marcada capaz de detectar el producto de amplificación.
En otra realización particular, la sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su extremo 3' un pigmento quencher.
En otra realización particular, la sonda comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 4 [INVAVITWO].
En otra realización particular, el kit comprende, además, un agente intercalante fluorescente, que en una realización todavía más particular, es SYBR Green.
En otra realización particular, el kit de la invención comprende, además, un ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando los mismos cebadores que los usados para amplificar una región del gen invA de Salmonella sp. que comprende la región de dicho gen que corresponde a la región comprendida entre los nucleótidos 1001 y 1069 en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1.
En otra realización todavía más particular de dicho kit, el ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago λ.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit (kit 2 de la invención) que comprende (i) la pareja de cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6 [INVAVITONE F/R] y (ii) una sonda marcada, en donde dicha sonda comprende en su extremo 5' un pigmento reportero y en su extremo 3' un pigmento quencher y presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 7 [INVAVITONE].
En una realización particular, dicho kit comprende, además, un ADN exógeno cuyos extremos contienen secuencias que pueden ser amplificadas usando la pareja de cebadores SEQ ID NO: 5/SEQ ID NO: 6 [INVAVITONE F/R] que, en una realización todavía más particular, dicho ADN exógeno comprende un fragmento del genoma del fago λ.
Por último, el uso de los kits 1 y 2 de la invención constituyen aspectos adicionales de la misma.
Así, en un aspecto, la invención se relaciona con el uso de un kit según se ha descrito e la presente invención para la detección de Salmonella sp. en una muestra.
En una realización particular, la muestra se selecciona del grupo que comprende una muestra ambiental, una muestra clínica y una muestra alimentaria.
El siguientes Ejemplo es ilustrativo de la invención y no pretende ser limitativo de la misma.
Ejemplo
Detección de ADN y ARN de Salmonella sp. en alimentos
A. Protocolo de detección de ADN de Salmonella sp.
1. Extracción con CHELEX® 100-6%
La resina CHELEX 100-6% se preparó mediante resuspensión de 1, 5 gramos de Chelex 100 en 25 ml de agua bidestilada y manteniendo bajo agitación moderada. La solución de Chelex 100-6% se conservó a 4ºC.
Para la extracción del ADN a partir de Salmonella sp., las muestras con 1 ml de cultivo pre-enriquecido se centrifugaron en un tubo eppendorf de 1, 5 ml durante 5 minutos a 13.000 rpm. Se eliminó el sobrenadante con pipeta y se resuspendió el pellet en 300 μl de CHELEX 100-6, utilizando vortex. Las muestras se incubaron a 56ºC durante 15-20 minutos y se agitaron usando un vortex durante 10 segundos. Las muestras se incubaron en un baño a 100ºC durante 5 minutos, se mezclaron usando vortex durante 10 segundos y fueron transferidas de forma inmediata los tubos a hielo. Las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 13.000 rpm. 200 μl del sobrenadante (que contiene DNA) fue transferido a otro tubo en donde se conservó a 4ºC si iba a ser utilizado en pocos días o a -20ºC para su conservación durante periodos más prolongados.
2. Creación del control interno de amplificación de PCR a tiempo real con SYBR Green
Para obtener un control interno, se utilizaron los cebadores invA ICF (SEQ ID NO: 8) e invA ICR (SEQ ID NO: 9) de secuencia:
invA ICF (SEQ ID NO: 8) :
invA ICR (SEQ ID NO: 9) :
Las secuencias subrayadas pertenecen a los cebadores 139 y 141 que amplifican el gen invA de Salmonella (Malorny et al., 2003, Appl. Environ. Microbiol. 69:290-296) , mientras que las secuencias en negrita pertenecen al fago λ que se incorporan para que formen parte de los cebadores y puedan amplificar un fragmento de fago λ para convertirlo en control interno. Con estos cebadores se amplifica un fragmento de 348 pb de fago λ (SEQ ID NO: 10) :
Este fragmento corresponde al control interno, que en la PCR a tiempo real con SYBR-GREEN permite amplificar un fragmento del fago lambda con los mismos cebadores que se utilizan para detectar Salmonella (cebadores 139 y 141) .
Para obtener el control interno se realizó una PCR convencional usando como molde una preparación de fago λ digerida con EcoRI y HindIII (SIGMA) usando la siguiente mezcla de reacción
y las siguientes condiciones de PCR:f7
Una vez realizada la PCR, se comprobó que hubo amplificación de los productos. Para eso se realizó una electroforesis en un gel de agarosa al 2%. Se cargó parte de las muestras en los pocillos del gel, por ejemplo: 5 μl muestra + 5 μl de tampón de carga. Se tiñó el gel con bromuro de etidio y se comprobó que apareciera la banda del tamaño deseado.
Posteriormente se realizó una purificación del ADN obtenido en la PCR utilizando el resto de la muestra que no se había cargado en el gel. La purificación se hizo con kit específico para ello, como el kit QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) , siguiendo el protocolo establecido por la casa comercial.
El producto obtenido fue el control interno, que se guardó a -20ºC como stock. Partiendo del stock se utilizó la dilución 10- 5 en la PCR a tiempo real con SYBR-GREEN.
3. Detección de Salmonella sp. con SYBR-Green PREMIX EX TAQ® (TAKARA)
La detección de Salmonella mediante PCR en tiempo real usando SYBR-Green se llevó a cabo usando la mezcla de reacción:
y las siguientes condiciones de amplificación
4. Detección del gen invA de Salmonella sp. mediante PCR a tiempo real y SYBR-GREEN
Durante la primera parte de la invención se llevó a cabo un estudio genómico del género Salmonella sp. para la selección de dianas adecuadas para detección de este patógeno en muestras alimentarias. La diana genómica elegida fue el gen invA, ya propuesto por varios autores (Malorny et al., supra) . Este gen desempeña un papel imprescindible en los mecanismos de invasión y supervivencia de Salmonella sp., por lo que la secuencia de dicho gen tenía que encontrarse transcrita en el ARN mensajero en la mayoría de los serotipos del género. A continuación se puso a punto la metodología de PCR convencional (ya publicada, cebadores 139 y 141) (Malorny et al., supra.) en base al gen invA de Salmonella sp. Así mismo, se puso a punto la metodología de extracción de ADN basado en la resina de sílice comercial CHELEX 100 (ver apartado 1) .
La amplificación se realizó utilizando un equipo ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) de PCR a tiempo real. Esta técnica permitió la detección específica y rápida de ADN de Salmonella sp. (véase Tabla 1) .
TABLA 1 Detección de ADN en serotipos de Salmonella sp. mediante PCR a tiempo real utilizando SYBR-GREEN y cebadores 139 y 141 
B. Protocolo de detección de ARN de Salmonella sp
1. Desarrollo de la sonda INVAVITONE
En la segunda parte de la invención se extrapoló la metodología desarrollada para el ADN para la detección de ARN mensajero, con el fin de que el ensayo permitiera discernir entre la detección de células vivas y muertas de Salmonella y por lo tanto, dar un valor añadido al sistema de detección desarrollado en la presente invención. Para ello, se diseñaron cebadores y una sonda teniendo en cuenta su inclusión en el gen invA. En el diseño de la sonda y de los cebadores que la flanquean, se analizaron las bases genéticas donde existe la información conocida de Salmonella sp. y así generar unas secuencias específicas que estuvieran presentes en todos los serotipos de Salmonella sp. Finalmente y mediante el programa Primer Express® se diseñó una sonda que se denominó INVAVITONE.
El ensayo de detección de Salmonella sp. mediante la utilización de sonda TagMan-MGB® (INVAVITONE) y los cebadores que la flanquean (INVAVITONE-F e INVAVITONE-R) se realizó utilizando el equipo ABI PRISM® 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) , de PCR a tiempo real. La sonda TaqMan-MGB®, sintetizada por Applied Biosystems, presenta el fluoróforo VIC en su extremo 5' que actúa como "reporter" y en su extremo 3' un extinguidor no fluorescente (NFQ) y una cola terminal MGB (minor groove-binder) .
Se analizaron diferentes serotipos de Salmonella sp., además de otra serie de microorganismos relacionados que se utilizaron como controles negativos de detección. La inclusión de estos controles negativos sirvió también para comprobar la especificidad de la sonda. Todos los aislamientos se analizaron en repetidas ocasiones para comprobar la reproducibilidad de la técnica. Estos microorganismos y sus valores Ct (Cycle threshold) aparecen reflejados en la Tabla 2. Este valor de Ct es el ciclo en el que la muestra atraviesa o supera un nivel de fluorescencia que separa la fluorescencia de fondo o "background" de la fluorescencia propia de la amplificación. Cuando se trabaja con extracciones de ADN reales, en las que se desconoce la cantidad de moléculas de partida, el valor de Ct varía en función de esta cantidad (Figura 1) . Los resultados de la detección se muestran en la Tabla 2.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 Detección de ADN en serotipos de Salmonella mediante PCR a tiempo real utilizando la sonda INVAVITONE 
Como se observa en la Tabla 2, la sonda diseñada fue capaz de detectar los serotipos de Salmonella sp. más comunes en nuestro entorno. No obstante, algún ensayo con serotipos foráneos no comunes en nuestra zona no dieron el resultado positivo esperado. Con el fin de asegurar un resultado óptimo en la detección de Salmonella sp., se propuso el diseño de una nueva sonda de las mismas características que la testada, pero con la capacidad de detectar un mayor número de serotipos.
La sonda INVAVITONE también se utilizó para detectar Salmonella sp. en muestras reales de alimentos procedentes de Laboratorios Bromatológicos Araba. Las muestras se obtuvieron de diversas matrices alimentarias reales. El ADN fue extraído mediante el protocolo de extracción con Chelex y se realizó la hibridación en el termociclador. Se analizó en paralelo la detección mediante inmunoconcentración con el equipo MiniVidas® de la empresa Biomerieux. El número de muestras analizado fue de 170, incluyendo en algunas ocasiones réplicas del mismo alimento o colonias pertenecientes a la misma muestra.
Así mismo, la sonda INVAVITONE se utilizó para comprobar la detección de ARN mensajero en matrices alimentarias inoculadas con serotipos de Salmonella sp. Tras su incubación en caldos de enriquecimiento durante 24 horas a 37ºC, el ARN fue extraído mediante un kit comercial (Nalger y -Machiner y ®) . La aplicación de la retrotranscripción del ARN procedente de las diferentes pruebas de extracción a ADNc, mediante el uso del kit comercial de Applied-Biosystems, permitió su detección a tiempo real tras la amplificación e hibridación con la sonda INVAVITONE en el termociclador ABI-PRISM 7000 SDS® (Applied Biosystems) .
Durante esta fase de la invención se ha abordado la mejora de la sonda específica de Salmonella sp. INVAVITONE, controles internos de amplificación así como el desarrollo de otra sonda con capacidad para detectar al control interno, con el objetivo de obtener los reactivos necesarios y suficientes para el desarrollo de un kit comercial de detección de este patógeno. Tomando como base la secuencia genética invA, se diseñaron cebadores flanqueadores de la región correspondiente a la amplificación e hibridación de la sonda INVAVITONE, que generarian un fragmento de aproximadamente 300 pares de bases que podría ser secuenciado por procesos automáticos. Una vez sintetizados los cebadores por la empresa Qiagen-Izasa, se utilizaron para amplificar por PCR la citada secuencia en los serotipos de Salmonella sp. con hibridación negativa a la sonda INVAVITONE, junto con controles positivos. Se obtuvieron bandas de ADN de los tamaños esperados qué, tras su purificación mediante kit comercial, fueron enviados para su secuenciación a la empresa Sistemas Genómicos. Las secuencias genéticas obtenidas fueron analizadas mediante el programa de alineamiento ClustalW con el objetivo de determinar los motivos que provocaban la falta de amplificación e hibridación con la sonda INVAVITONE. Se encontraron polimorfismos genéticos a nivel de nucleótido que justificaban con claridad la ausencia de reactividad. Es decir, aunque el gen esté presente en la mayoría de los serotipos, no es posible su detección debido a mutaciones silentes que pudieran invalidar esta secuencia para su utilización diagnóstica por su falta de hibridación con la sonda. Un problema añadido es la existencia de varios miles de serotipos distintos de este microorganismo, de los cuales solo unos pocos están completamente secuenciados y sus secuencias depositadas en bases de datos internacionales a disposición de la comunidad científica.
2. Desarrollo de la sonda INVAVITWO
Partiendo de la información obtenida mediante la secuenciación de los serotipos que no reaccionaban con la sonda INVAVITONE más la información disponible en aquel momento en las bases genéticas, se desarrolló una nueva versión de sonda específica de Salmonella sp., buscando un lugar dentro del gen invA más estable y con menor alteración a nivel de nucleótido.
Para el desarrollo de la segunda sonda, se adquirió un equipo de PCR a tiempo real denominado iQcycler® de la casa comercial Bio-Rad que no presentaba el filtro necesario para la lectura con el fluoróforo VIC (empleado en la sonda INVAVITONE) , lo que determinó la selección de fluoróforos para el marcaje de la segunda sonda. Ésta se diseñó mediante el programa Primer Express® y se solicitó a la empresa Applied Biosystems su marcaje en 5' con el fluoróforo 6-FAM, compatible para su detección en ambos equipos de PCR a tiempo real.
La segunda sonda desarrollada por nuestro equipo fue denominada INVAVTTWO. La secuencia de los nuevos cebadores y de la nueva sonda TaqMan-MGB® es la siguiente:
Así mismo, se optimizaron las concentraciones de nueva sonda TagMan-MGB® así como la concentración de los dos cebadores. Las concentraciones óptimas de los cebadores y de la sonda TaqMan-MGB® por reacción aparecen en la Tabla 3.
TABLA 3 Concentraciones óptimas de los cebadores y de la sonda INVAVITWO 
Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo usando la siguiente mezcla de reacción
y las siguientes condiciones de la amplificación:
Se eligió una master de amplificación que tuviera AmpErase® uracil-N-glicosilasa (UNG) . UNG es un enzima recombinante de 26-kDa, que permite eliminar la contaminación con amplificados provenientes de anteriores ciclos de amplificación el enzima degrada el ADN que lleva dUTPs incorporados en lugar de los dTTPs del "ADN natural". Esto va a impedir la aparición de falsos positivos por la mencionada contaminación.
La sonda INVAVITWO fue evaluada en cuanto a los test de inclusividad como de exclusividad con una amplia colección de ADNs procedentes de la colección de serotipos de Salmonella sp. disponibles en la Facultad de Farmacia de la UPV/EHU, junto con cepas de otros microorganismos pertenecientes a otras especies. Como puede observarse en la tabla adjunta (Tabla 4) , los resultados mejoraron notablemente con respecto a la sonda INVAVITONE, ya que detectó la práctica totalidad de los serotipos probados (inclusividad) , junto con una gran exclusividad, ya que no se detectaba ningún falso positivo en otros microorganismos estudiados (Tabla 4) .
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 4 Resultados de la detección de serotipos de Salmonella sp. mediante la sonda INVAVITWO 
La sonda INVAVITWO fue probada con muestras reales en Laboratorios Bromatológicos Araba mediante la extracción de ADN utilizando el protocolo de Chelex y en paralelo con la técnica de inmunoconcentración con el equipamiento MiniVidas de la casa Biomerieux, y utilizando el equipo iQcycler de la casa Bio-Rad. El número de muestras alimentarias analizado con ambos procedimientos supera las 200.
3. Desarrollo del control interno de amplificación para la sonda INVAVITWO
El estudio de la PCR para la detección de patógenos en alimentos puede verse afectada por la presencia de sustancias presentes en las matrices alimentarias con capacidad para la inhibición de la enzima Taq polimerasa presente en la reacción. Por este motivo se diseñó un ADN control que pueda co-amplificarse, de tal manera que se pueda asegurar que un resultado negativo con la sonda específica del microorganismo no se debe a inhibición de la Taq polimerasa, si no a falta de complementariedad entre la sonda y la secuencia o a ausencia de amplificación por ausencia de anillamiento de los cebadores.
Se diseñó una estrategia de obtención mediante PCR de un ADN quimérico generado por amplificación de un fragmento específico del bacteriófago λ modificado mediante la adición de extremos complementarios a los cebadores INVAVITWO-F e INVAVITWO-R. Tras su detección mediante electroforesis y purificación mediante kit comercial, el control interno se diluyó hasta 1/10.000 para su incorporación como ADN control positivo en las muestras.
Posteriormente se realizó una purificación del ADN que se había obtenido en la PCR utilizando el resto de la muestra que no se ha cargado en el gel. La purificación se hizo con un kit específico para ello [kit QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) ] siguiendo las instrucciones del fabricante.
El producto obtenido es el control interno, que se guardó a -20ºC como stock.
La amplificación del ADN del fago lambda se llevó a cabo con la pareja de cebadores CI INVAVITWO-F (SEQ ID NO: 11) y CI INVAVITWO-R (SEQ ID NO: 12) de secuencia:
CI INVAVITWO-F (SEQ ID NO: 11) :
CI INVAVITWO-R (SEQ ID NO: 12) :
Las secuencias subrayadas pertenecen a los cebadores INVAVITWO-F e INVAVITWO-R que amplifican el gen invA de Salmonella, mientras que las secuencias en negrita pertenecen al fago λ que se incorporan para que formen parte de los cebadores y puedan amplificar un fragmento de fago λ convirtiéndolo en control interno.
La reacción de PCR para la generación del control interno se lleva a cabo mediante amplificación de una muestra de ADN del fago lambda digerido con EcoRI y HindIII (SIGMA) usando la siguiente mezcla de reacción:
y las siguientes condiciones de PCR
Una vez realizada la PCR, se comprobó que había habido amplificación de los productos. Para eso se realizó una electroforesis en un gel de agarosa al 2%. Se cargó parte de las muestras en los pocillos del gel (5 μl muestra + 5 μl de tampón de carga.) y se tiñó el gel con bromuro de etidio para comprobar que aparecía la banda del tamaño deseado. Con estos cebadores se amplificó un fragmento de 150 pb de fago λ (SEQ ID NO: 13) :
Este fragmento será el control interno, que en la PCR a tiempo real amplificará con los mismos cebadores que se utilizan para detectar Salmonella (INVAVITWO-F e INVAVITWO-R) . El producto de amplificación del control interno se detecta mediante el uso de una sonda específica de secuencia TGCGGTTATAGCGGTCCGGCTG (SEQ ID NO:14) marcada en 5' con el fluoróforo TAMRA y en 3' con DDQI (Deep Dark Quencher I) de forma que la sonda tiene la secuencia
5'TAMRA-TGCGGTTATAGCGGTCCGGCTG-DDQI 3'
en donde la zona del control interno donde hibridará la sonda se muestra en negrita y subrayado.
4. Aislamiento del ARNy retrotranscripción del mismo
El ADN bacteriano tras ser sometido a tratamientos de pasteurización, esterilización o radiación puede ser detectado por PCR. Esto es un hecho constatado que ha sido observado al someter diferentes extracciones de ADN a diferentes tratamientos de pasteurización y esterilización. Esto implica, que una bacteria muerta, podría ser detectada (su ADN) y considerarse, como un resultado positivo, dando lugar a un falso positivo. Parece entonces claro que la estrategia para detectar células vivas, o en fase de replicación, puede pasar por la detección del ARNm.
Una vez aislado el ARNm, éste se transformó en ADNc mediante la enzima transcriptasa inversa en el proceso denominado retrotranscripción mediante PCR (RT-PCR) . Una vez transformado en ADNc se detectó por PCR a tiempo real mediante la sonda INVAVITWO (SEQ ID NO: 4) marcada con fluorescencia.
A continuación, se procedió a extraer ARN de Salmonella con métodos comerciales (NucleoSpin® Macher y -Nagel for ARN) (ver protocolo en la sección 4.1) tras lo cual se trató con DNsa para eliminar el posible ADN contaminante que puediese dar origen a un falso positivo. El ARN se almacenó a -80ºC para su conservación o a - 20ºC si el análisis posterior va a ser realizado inmediatamente.
Las extracciones de ARN se midieron en un espectrofotómetro NanoDrop® ND-100 y se obtuvieron buenas medidas. Los ratios obtenidos 260/280 fueron 2 o valores cercanos a 2. La cantidad de ARN extraído fue baja por lo que no se pudo visualizar ARN al hacer geles de agarosa desnaturalizantes con formaldehído. Sin embargo la cantidad de ARN fue suficiente para ser utilizado como diana en una RT-PCR. En las RT-PCRs la eficacia de transferencia desde ARN a cADN, no es alta, aun así, la posterior detección con sondas TaqMan-MGB® fue lo suficientemente sensible como para solventar este inconveniente. Se utilizó un protocolo de RT-PCR de la casa comercial Applied Biosystems con 5 μl de muestra inicial de ARN (ver protocolo en la sección 4.1) .
La extracción del ADN se llevó a cabo mediante el kit NUCLEOSPIN®. Para ello, se centrifugaron muestras de 1 ml de cultivo en un tupo de 1.5 ml durante 5 min a 13000 rpm. El pellet se resuspendió en 50 μl de TEL (TE buffer que contiene 0, 2 mg/ml de lisozima) y se incubó 10 minutos a 37ºC. A continuación se añadieron 350 μl de buffer RA1 y 3, 5 μl de β-mercaptoetanol. El contenido se transfirió a las unidades NucleoSpin® Filter que fueron centrifugadas durante 1 minuto a 11.000 r.p.m. Se añadieron 350 μl de etanol (70%) al filtrado y se transfirió a las columnas NucleoSpin® RNA II column, se centrifugó durante breves segundos a 8.000 rpm. y se transfirió la columna a un nuevo colector. A continuación se añadieron 350 μl de MDB (Membrane Desalting Buffer) , se centrifugaron las columnas durante 1 minuto a 11000 rpm.
A continuación, se añadió a cada columna 95 μl de una solución patrón de DNase formada por 10 μl de DNasa I y 90 μl de tampón de reacción de DNasa. Las columnas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron a cada columna 200 μl de buffer RA2 y se dio un pulso con la la centrifuga a 8.000 rpm. Las columnas fueron transferidas a un nuevo colector. A continuación, se añadieron 600 μl de buffer RA3, se dio un pulso en la centrifuga a 8000 rpm, se descartó el líquido filtrado y se volvió a poner la columna en ese mismo colector. A continuación se añadieron 250 pl de buffer RA3. Se centrifugaron las columnas durante 2 minutos a 11.000 rpm para secar el filtro por completo. La columna se transfirió a un tubo de 1, 5 ml y, a continuación, se añadieron 60 μl de H2O (RNase-free) y se centrifugaron las columnas durante 1 minuto a 11.000 rpm. Se recogió el contenido del tubo.
La reacción de retrotranscripción se llevó a cabo usando la siguiente mezcla de reacción:
usando las siguientes condiciones:
Las extracciones de ARN se guardaron congeladas, aunque si se iban a utilizar en breve se guardaron a -20ºC y si se iban a utilizar más tarde a -80ºC.
Los resultados obtenidos fueron válidos, detectando ADNc en todos los ensayos realizados y no se detectó ningún tipo de ADN contaminante en las extracciones de ARN. Esto implicó que el ADNc detectado era copia del ARN extraído, que a su vez es indicador de la actividad bacteriana. Se han realizaron ensayos de RT-PCR a tiempo real en el que se han empleando cultivos puros de varias especies bacterianas diferentes del genero Salmonella procedentes del archivo de aislamiento del Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología de la UPV/EHU. Paralelamente, se realizaron pruebas con muestras de cultivo puro de varias cepas de Salmonella hervidas, esterilizadas y pasteurizadas. Como controles negativos se emplearon muestras de E. coli cepa CECT 679 y Shigella sp cepa CECT 583. Los resultados obtenidos fueron muy satisfactorios, de forma que las diferentes muestras de Salmonella testadas fueron detectadas. Los controles negativos y las muestras pasteurizadas y hervidas dieron también el resultado esperado. La especificidad y la resolución de la tecnología TaqMan MGB demostró ser capaz de detectar cantidades muy bajas de ARNm, por lo que la técnica de RT-PCR a tiempo real testada es válida para la detección de células viables de Salmonella sp.
C. Detección de ARNm de Salmonella sp. en alimentos
La finalidad del ensayo fue comprobar los métodos de detección de ADN y ARN mensajero, la retrotranscripción, la hibridación con sondas a tiempo real y la detección de los controles internos de amplificación en distintas matrices alimentarias, inoculando todas ellas de manera artificial con la cepa control Salmonella enterica serotipo Typhimurium nº 75 del cepario de la UPV/EHU.
Las matrices alimentarias que se utilizaron en este ensayo, numeradas de esta misma forma, fueron las siguientes:
1. Pollo autoclavado e inoculado posteriormente con la cepa control en agua de peptona tamponada, incubado a 37ºC, durante 24 horas. 2. Pescado autoclavado e inoculado posteriormente con la cepa control en agua de peptona tamponada, incubado a 37ºC, durante 24 horas. 3. Bollo autoclavado e inoculado posteriormente con la cepa control en agua de peptona tamponada, incubado a 37ºC, durante 24 horas. 4. Medio TSB inoculado con la cepa control, incubado a 37ºC, durante 24 horas. Se utilizaron dos métodos para extraer el material genético:
- Extracción de ADN con el protocolo Chelex. - Extracción de ARN con el kit comercial NucleoSpin. Una vez obtenidas las extracciones de ADN de cada una de esas muestras, se guardaron a 4ºC para su uso posterior. En el caso del ARN, una vez realizados los protocolos de extracción, se realizó la retrotranscripción para convertir así el ARN en ADNc. Una vez conseguidas las muestras de ADN y cADN, se realizó la amplificación/detección con la sonda INVAVITWO en una PCR a tiempo real. Esta sonda está marcada con el fluoróforo FAM y se encarga de detectar la presencia de Salmonella. También se añadió en cada muestra un Control Interno de Amplificación que es detectado por una sonda marcada en TAMRA, que sirve como indicador de que no se ha producido inhibición en la amplificación.
Además de las muestras de ADN y ADNc procedentes de las distintas matrices alimentarias también se amplificó un Control Positivo que se trataba de una muestra de ADN de la Salmonella serotipo Typhimurium nº 75 obtenida por hervido y un Control Negativo (NTC) en el que en vez de ADN se añade agua estéril.
Resultado Tanto los controles positivos como los negativos dieron resultados esperados: el Control Positivo dio un resultado positivo y en el Control Negativo el resultado fue negativo. No se produjo inhibición de la PCR ya que se obtuvo amplificación del Control Interno de Amplificación.
Los resultados que se obtuvieron tras la PCR a tiempo real con las matrices alimentarias se muestran en la Tabla 5.
TABLA 5 Detección de ADN y ARN de Salmonella sp. mediante PCR a tiempo real y sonda INVAVITWO en matrices alimentarias artificialmente contaminadas 
