Nanopartículas metálicas funcionalizadas con el neuropéptido VIP y procedimiento de preparación.
Sector y objeto de la invención
Sector químico, bioquímico, inmunológico. Producto para aplicaciones biomédicas. Liberación de fármacos de forma selectiva e identificación de tejidos y/o células diana.
Constituye el objeto de la presente invención nanopartículas metálicas funcionalizadas con el neuropéptido VIP, así como el procedimiento de preparación de dichas nanopartículas.
Estado de la técnica
Durante las últimas décadas, se ha progresado mucho en el diseño de biosensores ópticos y su aplicación a medioambiente [Ji, J.; Schanzle, J. A.; Tabacco, M. B. Anal. Chem. (2004) , 76, 1411-1418.], biotecnología [Koh1s, O.; Scheper, T. Sens. Actuators, B (2000) , 70, 121-130.], diagnóstico médico [Yonzon, C. R.; Haynes, C. L.; Zhang, X.; Walsh, J. T.; Van Duyne, R. P. Anal. Chem. (2004) , 76, 78-85], selección de fármacos [Ho, H.; Leclerc, M. J. Am. Chem. Soc. (2004) , 126, 1384-1387.] y seguridad alimentaria [Wiskur, S. L.; Anslyn, E. V. J. Am. Chem. Soc. (2001) , 123, 10109-10110.].
El potencial de los biosensores basados en resonancias de plasmones de superficie se descubrió a principios de los 80s por Liedberg et al., quienes detectaron mediante el uso de anticuerpos interacciones proteína-carbohidrato [MacKenzie, C. R.; Hirama, T.; Deng, S. j.; Bundle, D. R.; Narang, S. R. J. Biol. Chem. (1996) , 271, 1527-1533.], proteína-ADN [Brockman, J. M.; Frutos, A. G.; Corn, R. M. J. Am. Chem. Soc. (1999) , 121, 8044-8051.], ADN-ADN [Gotoh, M.; Hasegawa, Y.; Shinohara, Y.; Shimizu, M.; Tosu, M. DNA Res. (1995) , 2, 285-293.] y adhesión de células [Van Der Merwe, P. A.; Barclay, A. N. Curr. Opin. Immunol. (1996) , 8, 257-261].
El primer biosensor de anticuerpos basado en la respuesta de la extinción de nanopartículas de Au coloidales a perturbaciones locales del índice de refracción, se desarrolló hace menos de una década [Englebienne, P. Analyst (1998) , 123, 1599-1603.]. Desde entonces, los biodetectores basados en las resonancias de plasmones localizados en superficie (LSPR) de nanopartículas se han empleado de forma creciente en detecciones biológicas [Haes, A. J.; Van Duyne, R. P. J. Am. Chem. Soc. (2002) , 124, 10596-10604; C. R. Yonzon, E. Jeoung, S. Zou, G. C. Schatz, M. Mwksich, R. P. Van Duyne J. Am Chem. Soc. (2004) , 126, 12669] y químicas [McFarland, A. D.; Van Duyne, R. P. Nano Lett. (2003) , 3, 1057-1062.].
Gracias al enorme interés de esos nano-bioconjugados se han desarrollado un amplio rango de aplicaciones tales como distribución de fármacos, marcadores moleculares, análisis bioquímicos ultrasensibles, desarrollo de dispositivos "lab-on-a-chip", construcción de nanocomponentes electrónicos, motores nano-moleculares... etc [C. M. Niemeyer, C. A. Mirkin Eds. Nanobiotechnology, Wiley-VCH 2004].
También se han usado como agentes potenciadores de contraste en microscopía electrónica [D. L. Feldheim, C. A. Foss, Jr. Eds. Metal nanoparticles. Synthesis, Characterization and Applications, Marcel-Dekker 2002.].
Existe un creciente interés por los efectos biológicos de las nanopartículas, de su toxicidad y su alcance en función del medio [M. Tsoli et al. Small (2005) ; 1:841], por ejemplo, su uso potencial como herramienta terapéutica en tratamientos de : cáncer [Ivan H. El-Sayed, Xiaohua Huang and Mostafa A. El- Sayed. Nano Letters (2005) Vol.5, N°5. 829-834].
Entre los diferentes tipos de nanopartículas, los metales nobles son de especial relevancia pues gracias a sus propiedades plasmónicas se produce un aumento de la señal, mejorando la sensibilidad de la técnica y haciéndolos idóneos como marcadores moleculares en medidas de transmisión y dispersión de luz [M.A. El-Sayed Acc. Chem. Res. (2001) , 34, 257.], SERS [M. Käll, H. Xu, P. Johansson, Journal of Raman Spectroscopy, (2005) , 36, 510.], infrarrojo (IR) y fluorescencia [S. Schultz, D.R. Smith, J.J.Mock, D.A.Schultz P.N.A.S. (2000) , 97, 996].
Por otro lado, los efectos biológicos del neuropéptido VIP tienen un interés creciente por su capacidad moduladora en patologías en las que hay un componente inflamatorio y/o autoinmunitario [Grimm, M. C. et al. (2003) J. Immunol. 171, 4990-4994; Pozo, D. (2003) Trends Mol. Med. 9, 211-217; Ganea, D., and Delgado, M. (2002) . Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 13, 229-237; Delgado, M. et al. (2003) . Trends Immunol. 24, 221-224]. Asimismo las células de determinados tumores humanos sobreexpresan receptores específicos para VIP en sus membranas plasmáticas. Su toxicidad y efectos adversos son escasos. Sin embargo, una de las limitaciones para el uso clínico de los neuropéptidos en general, y del VIP en particular, es su corta vida media en circulación, lo que haría necesaria la administración crónica del mismo, aumentando los costes económicos y dificultando su posología al paciente.
La funcionalización de nanopartículas se sabe que aumenta en determinados casos la vida media de la molécula unida a la misma, ya que dificulta el ataque proteolítico. En cualquier caso, ya sea como agente terapéutico sobre células dianas o como modo de liberación de otros fármacos sobre tumores que sobreexpresan receptores de VIP, la funcionalización de nanopartículas de VIP se enfrenta al problema de diseñar un método eficaz por el que se pueda funcionalizar de forma que su extremo carboxilo-terminal quede libre, ya que es por éste extremo por donde interacciona con sus receptores específicos de membrana. En general, la funcionalización de un péptido para dejar libre su extremo aminoterminal no presenta dificultades en la actualidad, justo lo opuesto a lo que ocurre cuando se pretende dejar expuesto el extremo carboxilo.
El procedimiento objeto de la presente invención permite la funcionalización de VIP en nanopartículas metálicas dejando intacta su capacidad de interacción con sus receptores específicos, lo que permitirá formular estrategias de detección y liberación selectiva de fármacos sobre células tumorales o el tratamiento de enfermedades con un componente autoinmune y/o inflamatorio.
En resumen, los estudios hasta la fecha descritos mantienen una orientación de nanopartícula/péptido dejando libre el grupo amino de la proteína para participar en las funciones de reconocimiento celular. En las nanopartículas objeto de la presente invención, una de las configuraciones deja libre el grupo amino, mientras que otra permite dejar el extremo ácido del VIP disponible, el grupo funcional realmente encargado de mantener esa recepción específica e intervenir en las funciones celulares. Las nanopartículas así funcionalizadas son estables, no tóxicas, solubles en agua, y compatibles con los sistemas biológicos. Permiten asimismo el estudio y adscripción de efectos dependientes (carboxilo libre) e independientes de receptor (amino libre) .
En cuanto al procedimiento de preparación, no hay técnica actual sobre la funcionalización de nanopartículas con proteínas que tengan libre su extremo ácido. Gracias al procedimiento objeto de la presente invención, se obtienen aquí nanopartículas funcionalizadas con péptidos, que gracias a tener su grupo ácido disponible, pueden participar en otras funciones de reconocimiento celular.
Para que el VIP [Grimm, M. C. et al. (2003) J. Immunol. 171, 4990-4994; Pozo, D. (2003) Trends Mol. Med. 9, 211-217; M; Ganea, D., and Delgado, M. (2002) . Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 13, 229-237; Delgado, M. et al. (2003) . Trends Immunol. 24, 221-224; D. Pozo, M. Delgado. FASEB Journal. (2004) ; 18: 1325] sea reconocido a nivel celular, necesita de esta segunda orientación (grupo ácido disponible) y así poder transducir éstas funciones de reconocimiento celular en una respuesta biológica.
Por tanto, el procedimiento objeto de la presente invención permite sintetizar nanopartículas que puedan ser usadas como sensores distintos grupos orgánicos y más específicamente nanopartículas con proteínas con grupos ácidos disponibles que puedan intervenir en funciones de reconocimiento celular.
Explicación de la invención
Constituye un objeto de la presente invención las nanopartículas metálicas funcionalizadas, compuestas por un núcleo metálico unido a un mercaptoderivado, el cual a su vez se une a través de al menos uno de sus grupos ácidos a un polímero derivado del polietilénglicol (PEG) bis-amino terminado, estando dichas nanopartículas funcionalizadas con un neuro-péptido, particularmente el péptido intestinal vasoactivo (VIP) .
En una posible configuración, el neuropéptido se une a través de su grupo carboxilo a uno de los grupos amino del PEG bis-amino terminado, quedando el grupo amino del péptido libre para interaccionar con receptores específicos.
En otra posible configuración, las nanopartículas están conjugadas con un diácido a través de uno de los grupos amino del PEG bis-amino terminado, estando dicho diácido a su vez enlazado a través de uno de los grupos ácido con el grupo amino del neuropéptido, quedando expuesto el grupo carboxilo del neuropéptido para interaccionar con receptores específicos.
En una de las realizaciones preferidas de las nanopartículas objeto de la presente invención, el material metálico del núcleo es plata y el mercapto-derivado es tiopronina, encontrándose la tiopronina y la plata en proporción 3:1 en las nanopartículas.
En una realización preferida de la configuración que deja expuesto el grupo carboxilo del neuropéptido, el diácido es ácido succínico.
Las nanopartículas metálicas funcionalizadas objeto de la invención presentan geometría esférica y tienen un diámetro medio de 5 nm.
Constituye igualmente un objeto de la presente invención un procedimiento de preparación de nanopartículas funcionalizadas con un neuropéptido que incluye las siguientes etapas:
a) formación de nanopartículas con un núcleo de material metálico unido a un mercaptoderivado, mediante adición de una disolución del mercapto-derivado a una disolución acuosa de una sal del material metálico, posterior reducción con un agente reductor, particularmente borohidruro de sodio, precipitación de las nanopartículas formadas mediante adición de metanol y recogida por centrifugación, terminando esta etapa con un lavado de las nanopartículas precipitadas y separadas con etanol, metanol y acetona.
b) dialización frente a agua de las nanopartículas separadas en la etapa anterior, así como eliminación del disolvente utilizado para el lavado hasta conseguir una concentración inferior a 2.10- 7 moles/ml y disolución en ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) 50 mM.
c) conjugación de las nanopartículas núcleo metálico/mercaptoderivado preparadas y dializadas en las etapas anteriores con polietilénglicol bis-amino terminado, mediante adición inicial de EDC [N- (3-dimetilaminopropil) -N'-etilcarbodiimida] 0, 1 mM y NHS [N-hidroxisuccinimida] 0, 25 mM y ulterior adición de PEG bis-amino terminado, manteniendo agitación durante 24 h.
d) dialización en agua de la disolución de nanopartículas núcleo metálico/mercaptoderivado/PEG bis-amino terminado de la etapa anterior y eliminación del disolvente hasta conseguir una concentración inferior a 2.10- 7 moles/ml y disolución en MES 50 mM.
El procedimiento incluye adicionalmente las siguientes etapas:
e) funcionalización de las nanopartículas núcleo metálico/mercaptoderivado/PEG bis-amino terminado obtenidas en las etapas anteriores con un neuropéptido, mediante adición de EDC 0, 1 mM y NHS 0, 25 mM y ulterior adición del neuropéptido manteniendo en agitación durante 24 h.
f) purificación de las nanopartículas funcionalizadas núcleo metálico/mercaptoderivado/PEG bis-amino terminado/neuropéptido mediante diálisis frente a agua desionizada durante 24 horas.
Las nanopartículas obtenidas mediante este procedimiento dejarían disponible el grupo amino del péptido funcionalizado para interaccionar con las membranas celulares.
Para conseguir la recepción celular específica buscada, la proteína unida a la nanopartícula debe tener disponible su grupo ácido. Para conseguir ésta orientación, se amplia el procedimiento de preparación, incorporando un nuevo ligando de unión entre el PEG y la proteína.
Se ha elegido un diácido como intermediario entre el polietilenglicol (bis-aminoterminado) y el VIP. El diácido, particularmente el succínico, emplea uno de sus carboxilos para enlazar con el amino del PEG procedente de la etapa anterior, dejando el otro grupo ácido disponible para su siguiente funcionalización. En este nuevo procedimiento se obtiene, gracias a la incorporación del diácido tras el polietilenglicol, una nanopartícula estabilizada, funcionalizada, de forma que posee un grupo ácido disponible donde posteriormente se unirá el grupo amino de una proteína, y así poder participar en las funciones de reconocimiento celular.
En este caso, el procedimiento de preparación incluye las siguientes etapas:
a) Formación de nanopartículas con un núcleo de material metálico unido a un mercaptoderivado, mediante adición de una disolución del mercaptoderivado a una disolución acuosa de una sal del material metálico, posterior reducción con un agente reductor, particularmente borohidruro de sodio, precipitación de las nanopartículas formadas mediante adición de metanol y recogida por centrifugación, terminando esta etapa con un lavado de las nanopartículas precipitadas y separadas con etanol, metanol y acetona.
b) Dialización frente a agua de las nanopartículas separadas en la etapa anterior, así como eliminación del disolvente utilizado para el lavado hasta conseguir una concentración inferior a 2.10- 7 moles/ml y disolución en ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) 50 mM.
c) Conjugación de las nanopartículas núcleo metálico/mercaptoderivado preparadas y dializadas en las etapas anteriores con polietilénglicol bis-amino terminado, mediante adición inicial de EDC [N- (3-dimetilaminopropil) -N'-etilcarbodiimida] 0, 1 mM y NHS [N-hidroxisuccinimida] 0, 25 mM y ulterior adición de PEG bis-amino terminado, manteniendo agitación durante 24 h.
d) Dialización en agua de la disolución de nanopartículas núcleo metálico/mercaptoderivado/PEG bis-amino terminado de la etapa anterior y eliminación del disolvente hasta conseguir una concentración inferior a 2.10- 7 moles/ml y disolución en MES 50 mM.
y adicionalmente:
e) Conjugación de las nanopartículas núcleometálico/mercaptoderivado/PEG bis-amino terminado precedentes de las etapas anteriores con un diácido mediante adición de EDC y NHS en cantidades equimolares y ulterior adición del diácido, manteniendo en agitación durante 24 horas.
f) Purificación de las nanopartículas núcleo metálico/mercaptoderivado/PEG bis-amino terminado/diácido mediante dialización frente a agua desionizada y disolución de las mismas en MES.
g) Funcionalización de las nanopartículas procedentes de la etapa anterior con un neuropéptido mediante adición inicial de EDC y NHS manteniendo en agitación durante 30 min y ulterior adición del neuropéptido manteniendo la reacción durante 24 h.
h) Purificación de las nanopartículas núcleo metálico/mercaptoderivado/PEG bis-amino terminado/diácido/ neuropéptido mediante diálisis frente a agua desionizada.
En una forma de realización preferente, el material metálico del núcleo de las nanopartículas es plata, el mercaptoderivado es tiopronina y el neuropéptido es el péptido intestinal vasoactivo. Preferentemente, en el procedimiento para preparar las nanopartículas cuya configuración deja libre el grupo carboxilo, el diácido utilizado es ácido succínico.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Esquema de funcionalización de nanopartículas metálicas desde la tiopronina al VIP.
Figura 2: Estructura del VIP. Péptido Intestinal Vasoactivo.
Figura 3: Imágenes tomadas con microscopía óptica de la línea celular macrofágica Raw 264.7. Izquierda: imagen de control. Derecha: células incubadas con nanopartículas Ag/tiopronina.
Figura 4: Imagen TEM de las nanopartículas Ag/tiopronina.
Figura 5: Esquema de una molécula de tiopronina adsorbida en una nanopartícula de Ag (no está a escala) numerada para la interpretación del espectro RMN.
Figura 6: Espectro a 500 MHz de Ag-tiopronina en D2O a 298 K. De arriba a abajo: Espectro ID TOCSY (3.9 ppm) , espectro ID TOCSY (4.2 ppm) , y espectro 1H.
Figura 7: Espectro a 500 MHz 2D HMBC de Ag-tiopronina en D2O a 298 K.
Figura 8. Espectro de absorción UV-Vis de nanopartículas de Ag/tiopronina, Ag/tiopronina/PEG, Ag/tiopronina/ PEG/VIP, Ag/tiopronina/PEG/ácido succínico y Ag/tiopronina/PEG/ácido succínico/VIP en disolución acuosa.
Figura 9: Espectro FTIR de nanopartículas de Ag/tiopronina, Ag/tiopronina/PEG y Ag/tiopronina/PEG/succinico en KBr. Izquierda: Región del espectro entre 2500-3500 cm- 1. Derecha: región entre 1000-2000 cm- 1.
Descripción detallada de la invención
Constituye un objeto de la presente invención la preparación de nanopartículas metálicas estables, solubles en agua, protegidas con polímeros biocompatibles y funcionalizadas con péptidos. Se aportan datos que permiten caracterizar dichas nanopartículas. Los péptidos son neuropéptidos y específicamente el péptido intestinal vasoactivo (VIP) , cuya estructura se muestra en la figura 2.
Con el VIP se obtiene un amplio espectro de funciones biológicas, incluida inmunomodulación, actuando predominantemente como un potente anti inflamatorio y un agente inhibidor de la respuesta del Th1 en el sistema inmunitario. Por lo tanto, el VIP emerge como un importante factor terapéutico para el tratamiento de enfermedades con componentes inflamatorias y autoinmunes [Grimm, M. C. et al. (2003) J. Immunol. 171, 4990-4994; Pozo, D. (2003) Trends Mol. Med. 9, 211-217; M; Ganea, D., and Delgado, M. (2002) . Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 13, 229-237; Delgado, M. et al. (2003) . Trends Immunol. 24, 221-224; D. Pozo, M. Delgado. FASEB Journal. (2004) ; 18: 1325].
Preparación de nanopartículas Ag/tiopronina
Para la síntesis de nanopartículas de plata se ha seguido el método publicado por Hyang and Murray [T. Huang, R. W. Murray. J. Phys. Chem. B. (2003) ; 107: 7434.], en el cual los iones de plata en disolución acuosa procedentes de la disolución AgNO3 y tiopronina N- (2-mercaptopropionil) glicina, son reducidos con borohidruro sódico. Para una relación tiopronina:plata 3:1, se adiciona la disolución de tiopronina sobre la plata, reduciendo inmediatamente con NaBH4. De la disolución negra resultante se precipitarán las nanopartículas Ag-Tiopronina con la adición de metanol. Las partículas se recogen por centrifugación, lavadas sucesivas veces con etanol, metanol y acetona, dializadas frente a agua y finalmente se elimina su disolvente a presión reducida para asegurar la concentración en cada una de las etapas de funcionalización.
A pesar de los estudios que existen sobre la reducción de amidas a aminas por la acción del NaBH4 en la presencia de metales de transición [Y. Suzuky Y. Miyaji, Z. Imai. Tetrahedron Letters. (1969) ; 52: 4555], los resultados obtenidos demuestran que la molécula de tiopronina no se ve afecta por el NaBH4, sino que se produce un cambio químico en el que la molécula de tiopronina sufre la pérdida del H de su grupo tiol mediante su adsorción en la superficie de la partícula metálica.
Preparación de nanopartículas Ag/tiopronina/PEG
De la Fuente et al [J. M. de la Fuente, C. C. Berr y , M. O. Riehle, A. S. G. Curtis. Langmuir. (2006) ; 22: 3286]. han funcionalizado nanopartículas metálicas de oro con PEG. demostrando que el uso del polietilenglicol tras la nanopartícula estabilizada, disminuye las interacciones inespecíficas de las mismas sobre la superficie celular.
Para la conjugación de las nanopartículas de Ag/tiopronina con polietilen-glicol se siguió un método paralelo al propuesto por de la Fuente et al [J. M. de la Fuente, C. C. Berr y , M. O. Riehle, A. S. G. Curtis. Langmuir. (2006) ; 22: 3286] adaptado para nanopartículas de plata.
El producto anterior (Ag/tiopronina) dializado y rotado se disuelve en una disolución de MES (ácido 2-morfolinoetanosulfónico) 50 mM. Se añade EDC (N- (3-dimetilaminopropil) -N'-etilcarbodiimida) (0.1 mmol) y NHS N-hidroxisuccinimida (0.25 mmol) . Se deja reaccionar brevemente, se añade el PEG (Polietilenglicol bis-aminoterminado) manteniendo la agitación durante 24 horas. La disolución resultante Ag/tiopronina/PEG se dializa en agua y finalmente, se elimina su disolvente para asegurar la concentración en la siguiente etapa. Este procedimiento conduce a la primera orientación, dónde el grupo amino del PEG está expuesto a la disolución y disponible para su unión con el grupo ácido de un péptido.
Preparación de nanopartículas Ag/tiopronina/PEG funcionalizadas con VIP
Se han descrito [J. M. de la Fuente, C. C. Berr y , M. O. Riehle, A. S. G. Curtis. Langmuir. (2006) ; 22: 3286]. nanopartículas de oro protegidas con tiopronina y estabilizadas con PEG. Posteriormente, se hizo reaccionar tras el PEG, la secuencia de péptidos GRGDSP. Las nanopartículas así obtenidas son estables, solubles en condiciones fisiológicas y exhiben baja toxicidad. Se demuestra que las nanopartículas de oro protegidas con tiopronina inducen o endocitosis o adhesión a la membrana celular dependiendo de la composición química de la superficie de la partícula.
En la presente invención, el péptido empleado ha sido el VIP. Con el VIP se obtiene un amplio espectro de funciones biológicas, incluida inmunomodulación, actuando predominantemente como un potente anti inflamatorio y un agente inhibidor de la respuesta del Th1 en el sistema inmunitario. Para preparar las nanopartículas funcionalizadas con VIP, se disuelven en MES las nanopartículas Ag/tiopronina/PEG en análogas proporciones, posteriormente se añaden EDC y NHS en la misma relación que en el apartado anterior para preparar las Ag/tiopronina/PEG. Finalmente se adiciona el VIP en relación al PEG añadido. Se permite la reacción durante 24 horas. Para su purificación final se dializa frente a agua miliQ durante 24. Este procedimiento conduce a la primera orientación, dónde el grupo amino del VIP está expuesto a la disolución.
Preparación de nanopartículas Ag/tiopronina/PEG/succínico
Para diseñar nanopartículas que sean capaces de reaccionar con péptidos a través de su grupo amino se emplea un diácido, preferentemente el ácido succínico, como intermediario entre el PEG y el VIP.
Se toman cantidades equivalentes del producto anterior Ag/tiopronina/PEG dializado y rotado y se disuelven en MES (ácido 2-morfolinoetanosulfónico) 50 mM. Posteriormente y sin esperar, se añaden EDC (N- (3-dimetilaminopropil) -N'-etilcarbodiimida) y NHS N-hidroxisuccinimida en cantidades equimolares. Finalmente se añade el ácido succínico en función de la funcionalización con PEG conseguida en la etapa anterior y se permite la reacción con agitación suave durante 24 horas. Se dializa frente a agua miliQ hasta su total purificación. Se obtienen así nanopartículas con grupos ácidos disponibles para funcionalizar con proteínas.
Preparación de nanopartículas Ag/tiopronina/PEG/succínico/VIP
El diácido (particularmente el succínico) dejó disponible en la etapa anterior su otro grupo ácido por donde reaccionará el VIP: El VIP así funcionalizado mantiene libre su resto ácido que es el grupo que realmente interviene en las funciones de reconocimiento celular, en concreto el VIP ejerce importantes beneficios activando funciones del sistema inmune.
Para funcionalizar nanopartículas Ag/PEG/Succínico con VIP, se disuelven en MES las nanopartículas Ag/tiopro- nina/PEG/succínico, posteriormente se añaden EDC y de NHS en las proporciones anteriormente empleadas y se deja en agitación suave durante 30 minutos.
Se añade el VIP correspondiente a la cantidad de succínico añadida, disueltos en agua miliQ y se permite la reacción durante 24 horas. Para su purificación final se dializa frente a agua miliQ para conseguir alta pureza en el producto. En esta segunda orientación propuesta, se consigue dejar libre el extremo ácido del péptido que es el grupo funcional que realmente interviene en las funciones de reconocimiento celular.
En la figura 1 se esquematiza todo el procedimiento de funcionalización de nanopartículas metálicas desde la tiopronina al VIP.
En la figura 8 se muestran las variaciones en el plasmón superficial en todas las etapas de las nanopartículas tras su funcionalización. Los espectros IR (FTIR) de las nanopartículas descritas, preparadas en KBr se muestran \hbox{en la Fig. 9.}
Modo de realización de la invención
Nanopartículas 3:1:Ag/tiopronina
Tal y como se ha explicado en la descripción detallada, para la preparación de nanopartículas de plata se ha seguido el método publicado por Hyang and Murray [T. Huang, R. W. Murray. J. Phys. Chem. B. 2003; 107: 7434.] siguiendo la proporción 3:1, en el cual los iones de plata en disolución acuosa procedentes de la disolución AgNO3 y tiopronina, son reducidos con borohidruro sódico.
El análisis de las nanopartículas de Ag/tiopronina proporciona los datos necesarios para calcular su recubrimiento durante la funcionalización en las etapas posteriores.
Las nanopartículas son esféricas y tienen un diámetro medio de 5 nm, determinado por TEM (Transmission Electron Microscopy) . Las imágenes se tomaron con el microscopio de alta resolución Philips CM200. Las muestras se prepararon secando las nanopartículas sobre una gradilla de cobre (ver Fig. 4) .
Los desplazamientos químicos correspondientes al espectro de 1H-RMN de las nanopartículas de Ag/tiopronina, se muestran en la tabla 1 y en la figura 7. El espectro RMN se realizó a 500 MHz con un espectrómetro Bruker AMX-500 en D2O. El estándar HMBC se optimizó a JH, C=8 Hz. El número asignado a cada protón en la molécula se muestra en la figura 5, y los desplazamientos químicos se muestran en la tabla 1. También se comparan las asignaciones de las bandas con las aportadas por Kohlmann et al. J. Phys. Chem. B. 2001; 105: 8801.
En la figura 6 se muestran dos espectros 1D TOCSY. Los experimentos TOCSY se realizaron con la secuencia DPFGSE, a pulsos selectivos de 50 ms (Gaussian) , con un tiempo de mezcla de 120 ms. En la figura 9 se muestra la correlación entre los grupos metil y carbonilamida (177.6 ppm) con una correlación de 3 enlaces, así como la correlación a 2 enlaces que existe entre los protones del metileno y los del grupo carbonilamida a 178 ppm.
El espectro UVA-VIS de las nanopartículas de Ag/tiopronina en disolución acuosa muestra claramente una banda con un máximo a λ\approx380 nm que pertenece a la absorción característica del plasmón superficial de las nanopartículas de plata. (ver Fig. 8) y cuyas variaciones demostrarán la funcionalización de las nanopartículas. - Los espectros UV-Vis fueron recogidos con un espectrómetro Ocean optics equipado con un detector HR4000.
Nanopartículas 3:1 funcionalizadas con PEG: Ag/tiopronina/PEG
El producto anterior dializado y rotado se disuelve en una disolución de MES (ácido morfolino etano sulfónico) 50 mM. A la muestra disuelta se le añaden EDC N- (3-dimetil-aminopropil) -N'-etilcarboimida hidroclorhídrico) (0.1 mmol) y NHS N-Hidroxisucciniimida (0.25 mmol) . Se deja reaccionar con agitación suave durante 30 min y se añade el PEG en proporción a la tiopronina reaccionada. Se deja agitando 24 horas, se dializa en agua Ag/tiopronina/PEG y se elimina el disolvente para asegurar la concentración en la siguiente etapa.
Nanopartículas 3:1 PEG funcionalizadas con VIP:Ag/tiopronina/PEG/VIP
A las nanopartículas de Ag/tiopronina/PEG disueltas en MES, se les añaden las cantidades de EDC y NHS que se muestran en las relaciones anteriores. Se adiciona el VIP correspondiente en relación al PEG reaccionado y disuelto en agua miliQ. Se permite la reacción durante 24 horas con suave agitación. Para su purificación final se dializa frente a agua miliQ durante 24 horas.
Este procedimiento conduce a la primera orientación, dónde el grupo amino del PEG está expuesto a la disolución y disponible para su unión con el grupo ácido de un péptido.
Nanopartículas 3:1 PEG funcionalizadas con ácido succínico: Ag/tiopronina/PEG/Succínico
Para diseñar nanopartículas que sean capaces de reaccionar con péptidos a través de su grupo amino y así dejar el extremo ácido del péptido libre en disolución, se ha empleado un diácido, el ácido succínico, como intermediario entre el PEG y del VIP. A nanopartículas de Ag/tiopronina/PEG disueltas en MES, se adicionan cantidades equimolares de EDC, NHS según los procedimientos anteriores. Se añade el succínico necesario según el PEG funcionalizado. Se permite la reacción con agitación suave durante 24 horas. Se dializa frente a agua miliQ durante 48 horas, renovando el agua cada 10 horas.
Nanopartículas 3:1 PEG ácido succínico funcionalizadas con VIP: Ag/tiopronina/PEG/Succínico/VIP
Para funcionalizar el VIP a nanopartículas Ag/PEG/Succínico, se disolverán previamente en MES y se activarán con EDC y NHS las cantidades necesarias de nanopartícula respecto a la funcionalización conseguida en las etapas anteriores. Se deja reaccionar brevemente previo a la adición del VIP y se permite la reacción durante 24 horas. Para su purificación final se dializa frente a agua miliQ durante 24 horas, renovando el agua cada 10 horas. Así se ha conseguido dejar libre el extremo ácido del péptido que es grupo funcional que realmente interviene en las funciones de reconocimiento celular.
TABLA 1 Asignación de Desplazamientos Químicos (500 MHz) para el espectro 1H-NMR obtenidos y comparados con Kohlmann et al. J. Phys. Chem. B. 2001; 105: 8801 
