Anticuerpos policlonales anti ácido (+) -2cis- 4trans- abscísico ( (+) ABA) .
Esta invención se refiere a anticuerpos policlonales anti ácido (+) -2cis, 4trans-abscísico ( (+) ABA) para cuya elaboración se utiliza un complejo inmunogénico en el que la proteína transportadora, hemocianina de lapa, se conjuga a (+) ABA o también a ácido (±) -2cis, 4trans- abscísico ( (±) ABA o ABA) mediante el método de acoplamiento de p- aminobenzoil hidracida, y al uso de estos anticuerpos en la detección y cuantificación de (+) ABA en muestras biológicas.
Estado de la técnica anterior
El ácido abscisico (ácido (+) -2cis, 4trans- abscísico o ABA) es una hormona vegetal presente en plantas vasculares, musgos y algunos hongos. Su molécula consta de 15 átomos de carbono que forman un anillo alifático con un único doble enlace, un grupo carbonilo en C4' y varios sustituyentes, entre ellos una cadena lateral unida al C1'. Esta cadena tiene un grupo carboxilo en la posición terminal C1 y dos dobles enlaces, uno de los cuales (C2 = C3) determina la existencia de los isómeros 2cis y 2trans del ABA, formas químicas que se convierten entre si. Además, y debido a que el C1' del ABA es un carbono asimétrico, hay 2 enantiómeros de la molécula no convertibles entre si que son ácido (+) -2cis, 4trans- abscísico ( (+) ABA) y ácido (-) -2cis, 4trans- abscísico ( (-) ABA) . Mientras que la forma de ácido abscísico disponible en el mercado es una mezcla racémica de (+) y (-) ABA, su forma natural y activa en las. plantas es (+) ABA. También en plantas, el ácido abscisico puede estar conjugado con glucosa formando ABA-β-D-glucosil éster. Este compuesto es inactivo y puede liberar de nuevo ABA por acción de β-D-glucosidasas existentes en determinadas células.
El ABA es esencial para el correcto desarrollo de las plantas y, además, regula sus respuestas al estrés ambiental causado por salinidad, bajas temperaturas y sequía. Concretamente, el descenso del potencial hídrico que provoca la sequía en el suelo y en las plantas promueve en éstas la acumulación de ABA. La hormona estimula entonces respuestas adaptativas que permiten la supervivencia de las plantas bajo las condiciones estresantes. Por tanto, el análisis de ABA en muestras resulta interesante en cualquier investigación referida a estos y otros procesos biológicos en los que interviene.
El análisis de (+) ABA resulta complejo debido a su baja concentración en los tejidos, a la existencia de isómeros y conjugados inactivos de la molécula, y a la complejidad de las muestras vegetales. Generalmente incluye varios pasos de purificación y concentración previos a la cuantificación de la hormona, así como el uso de técnicas físico-químicas de análisis. Esto supone bajas recuperaciones finales del compuesto, eleva los costes y el tiempo de análisis, y lo hace tedioso e inviable cuando se precisa valorar (+) ABA en muchas muestras de forma rutinaria. Una solución es la incorporación de técnicas inmunológicas basadas en el empleo de anticuerpos que reaccionen específicamente con (+) ABA. La sensibilidad y la especificidad de los anticuerpos anti-ABA permiten valorar cantidades mínimas del isómero activo de la hormona en extractos relativamente crudos empleando métodos de análisis rápidos, sencillos, de bajo coste y que no requieren el uso de grandes equipos de difícil manejo.
Para que un animal produzca anticuerpos frente a ABA es necesario inyectarle la molécula conjugada con una proteína transportadora, puesto que el ABA per se es incapaz de inducir una respuesta inmune debido a su reducido tamaño, es lo que se conoce como un "hapteno". Existen dos posibilidades de unir (±) ABA o (+) ABA a una proteína transportadora: 1) a través del grupo carboxilo en C1 de ABA y, 2) a través del grupo carbonilo en C4'. Si se utiliza el primer tipo de conjugado en la inmunización los anticuerpos producidos reconocen como epítopo el anillo de la molécula de ABA por lo que reaccionan tanto con ABA libre como con sus conjugados éster inactivos. Si se utiliza el segundo tipo de conjugado hapteno-proteína, el epítopo reconocido es la cadena lateral del ABA, luego los anticuerpos son específicos de la forma libre y activa del ABA. La presente invención se refiere al segundo tipo de anticuerpos denominados C4'-ABA.
Por otro lado, existen dos estrategias de obtención de anticuerpos C4'-ABA que dan lugar a anticuerpos monoclonales y policlonales. A pesar de que los primeros son más específicos en el reconocimiento del antígeno que los segundos, su producción resulta más laboriosa y supone un mayor gasto de tiempo, personal y dinero. Además, para determinadas aplicaciones resultan más útiles los anticuerpos policlonales.
Se han elaborado anticuerpos monoclonales C4'-ABA (S.A. Quarrie y G. Galfre, Anal. Biochem. 1985, vol. 151, pp. 389-399; G.M. Banowetz et al, Hybridoma 1994, vol. 13, pp. 537-541) mediante inmunización de ratones con un conjugado en el que (±) ABA o (+) ABA se unen a hemocianina de lapa (KLH, de keyhole limpet hemocianin en inglés) mediante el método de acoplamiento de p- aminobenzoil hidracida. También existen anticuerpos policlonales C4'-ABA obtenidos por inmunización de conejos con un complejo similar pero en el que la proteína transportadora es seroalbúmina bovina (BSA, de albumin from bovine serum en inglés) (A. N. Blintsov y M. A. Gusakovskaya, Russian J. Plant Physiol. 2006, vol 53, pp. 407-412) , la cual resulta menos eficiente para inducir respuestas inmunes. Otros anticuerpos policlonales C4'-ABA se han obtenido inmunizando conejos con un conjugado de (±) ABA y BSA pero unidos mediante el método de acoplamiento de L-tirosin hidracida y ácido p- aminohipúrico (E. W. Weiler, Planta 1980, vol. 148, pp. 262-272) , lo que dificulta su síntesis y conlleva problemas de precipitación de la proteína y de baja recuperación del conjugado.
Sin embargo, no hay anticuerpos policlonales C4'-ABA útiles en la detección y valoración de la forma activa y libre de ABA que hayan sido elaborados por inmunización de conejos con un conjugado de KLH con (±) ABA o (+) ABA unidos mediante el método de acoplamiento de p- aminobenzoil hidracida. Estos resolverían los distintos problemas planteados en la elaboración de los anticuerpos citados en el párrafo anterior.
Explicación de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos policlonales C4'-ABA obtenidos por inmunización de mamíferos -preferentemente conejos- con una proteína conjugada con un derivado de (±) ABA o de su isómero (+) ABA. En una realización particular, la proteína utilizada es KLH y el método de conjugación es el de acoplamiento de p- aminobenzoil hidracida. Especialmente preferidos son los anticuerpos obtenidos utilizando el producto de la conjugación de KLH con (+) ABA.
Esta invención proporciona también un método para la obtención de los anticuerpos policlonales antes mencionados por inmunización de mamíferos, preferiblemente conejos, con un conjugado de KLH con (±) ABA o su isómero (+) ABA obtenido por el método de acoplamiento de p- aminobenzoil hidracida.
El método de obtención de los anticuerpos policlonales C4'-ABA de la presente invención mejora los métodos de obtención de anticuerpos policlonales de mismo tipo que se citan en el estado de la técnica. Comparado con el método de A. N. Blintsov y M. A. Gusakovskaya (Russian J. Plant Physiol. 2006, vol 53, pp. 407-412) , el uso de KLH en lugar de BSA en la elaboración del complejo antigénico debe aumentar la producción de anticuerpos C4'-ABA en los conejos inmunizados, puesto que la KLH es una proteína de mayor tamaño y por ello tiene mayor número de aminoácidos a los que se pueden unir (±) ABA-4'-aminobenzoilhidrazona o (+) ABA-4'-aminobenzoilhidrazona. Comparando el método de la invención con el de E. W. Weiler (Planta 1980, vol. 148, pp. 262-272) , el empleo de p- aminobenzoil hidracida como única molécula puente entre (+) ABA o (±) ABA y la proteína transportadora en el complejo antigénico, en lugar de L-tirosin hidracida y ácido p- aminohipúrico, evita los problemas de precipitación del conjugado y simplifica la obtención de los anticuerpos.
Esta invención también proporciona un método de detección y cuantificación de (+) ABA en una muestra mediante radioinmunoensayo (RIA) , que comprende poner en contacto la muestra con los citados anticuerpos policlonales C4'-ABA y con una cantidad conocida de ABA marcado radiactivamente al que llamamos ABA-trazador, de manera que el ABA de la muestra y el ABA-trazador compiten por unirse a dichos anticuerpos. La detección y cuantificación del ABA en la muestra se realizan indirectamente a partir de la detección y medida de la cantidad de complejos formados por el ABA-trazador y dicho anticuerpo, y mediante la utilización de una curva de calibración.
Los anticuerpos policlonales de la presente invención tienen la característica positiva de ser altamente específicos para (+) ABA. La especificidad se comprueba comparando la reactividad de los anticuerpos con (+) ABA respecto a su reactividad con otros isómeros y conjugados del compuesto, mediante un RIA similar al descrito en el párrafo anterior. Los resultados de estas pruebas indican que la reactividad de los citados anticuerpos con (+) ABA es 100%, mientras que la reacción cruzada con el isómero (-) ABA y con los conjugados ABA metil éster y ABA-β-D-glucosil éster es siempre menor de 4% y, en algunos casos 0%. Por lo tanto, son anticuerpos capaces de discernir entre la forma libre y activa de ABA en plantas y los conjugados éster de ABA también presentes en plantas.
Otra de las características positivas de los anticuerpos de la presente invención es su sensibilidad, que queda reflejada en el valor de la inversa de la constante de afinidad de los citados anticuerpos por (+) ABA, situándose entorno a 0, 5 nmol/L. Esta característica hace a los anticuerpos útiles para detectar (+) ABA en muestras donde su concentración es tan baja como 0, 5 nM. Los anticuerpos también son útiles para cuantificar cantidades de (+) ABA en muestras donde la concentración del compuesto se sitúa por encima de 2 nM mediante el RIA que se describe en la invención.
El hecho de que los anticuerpos de la presente invención tengan una buena especificidad y sensibilidad, los hace útiles para detectar y cuantificar cantidades muy bajas de (+) ABA en muestras sin necesidad de que éstas sean sometidas a procesos de purificación muy exhaustivos, lo que simplifica en gran medida el análisis de (+) ABA.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la curva de reacción de los anticuerpos con el trazador ( (±) ABA marcado radiactivamente) en presencia de cantidades crecientes de (+) ABA estándar. Los valores son media de 10 ensayos independientes y las barras de error muestran la desviación estándar.
La figura 2 muestra las curvas de reacción de los anticuerpos con el trazador ( (±) ABA marcado radiactivamente) en presencia de cantidades crecientes de diferentes conjugados y análogos de (+) ABA: metil éster de (+) ABA (ABA-met) , glucosil éster de (+) ABA (ABA-glu) y el isómero (-) ABA. Los valores son media de 4 ensayos independientes y las barras de error muestran la desviación estándar.
La figura 3 muestra la visualización bajo luz ultravioleta de los productos de la reacción de síntesis de (±) ABA-4'-aminobenzoilhidrazona separados mediante cromatografía en capa fina (calles 3 a 18) . En las calles 1 y 2 se colocaron patrones de (±) ABA y de p- aminobenzoil hidracida. La flecha indica la mancha correspondiente a (±) ABA-4'-aminobenzoilhidrazona con Rf 0, 4.
Descripción detallada de una realización preferida
La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Generación y purificación de anticuerpos policlonales anti ácido (+) -2cis-4trans-abscísico ( (+) ABA)
Los sueros anti-ABA fueron generados en conejos blancos New Zealand. Los conjugados utilizados en la inmunización fueron los formados por KLH y (±) ABA o (+) ABA. El método de conjugación fue el de acoplamiento de p- aminobenzoil hidracida que implicó los siguientes procesos:
a) Síntesis de (±) ABA-4'-aminobenzoilhidrazona o de (+) ABA-4'-aminobenzoilhidrazona por reacción de condensación entre p- aminobenzoil hidracida y el grupo carbonilo en el carbono 4' de (±) ABA o (+) ABA en medio orgánico, condiciones de oscuridad, pH ácido, agitación continua, temperatura ambiente y atmósfera libre de oxígeno.
b) Purificación de la hidrazona sintetizada. La solución que contiene la hidrazona se fracciona 4 veces entre acetato de etilo y tampón borato 0, 1 M pH 9. La fase orgánica se recoge, se concentra por evaporación bajo corriente de nitrógeno y se somete a cromatografia en capa fina. El compuesto con Rf 0, 4, que se corresponde con (±) ABA-4'-aminobenzoilhidrazona o con (+) ABA-4'-aminobenzoilhidrazona, se eluye con metanol:acetato de etilo (4:6 v/v) .
c) Activación de la hidrazona por diazotación en presencia de ácido nitroso.
d) Acoplamiento entre la hidrazona de (±) ABA o de (+) ABA activada y los restos tirosina de la KLH dializada frente a tampón borato 0, 25 M, pH 9.
Los conjugados entre KLH y la hidrazona de (±) ABA o de (+) ABA obtenidos se utilizaron para inmunizar dos conejos. La inyección primaria fue intramuscular y se realizó con 1 mg de proteína (cantidad estimada por ensayo Bradford) disuelta en tampón PBS (phosphate buffer saline, tampón salino de fosfatos) pH 7, 2 estéril mezclado con un volumen equivalente de adyuvante de Freud completo. El día anterior se tomaron muestras de suero pre-inmune de los conejos. La respuesta inmune de los animales fue reforzada mediante cuatro inyecciones idénticas a la primaria, pero en las que el adyuvante de Freud completo se sustituyó por el incompleto, que se realizaron los días 21, 35, 49 y 63 después de la inyección primaria. Se extrajeron muestras parciales de suero de los conejos el día 34 desde el inicio de la inmunización y el día 77 los sueros completos.
La purificación de los anticuerpos a partir del suero completo de cada conejo se realizó mediante precipitación secuencial con ácido caprílico y sulfato amónico siguiendo el método de M. M. McKinney y A. Parkinson (J. Immunol. Meth. 1987, vol. 96, pp. 271-278) . El suero se diluyó (4 veces) en tampón acetato 60 mM, pH 4 y se ajustó su pH a 4, 5. A esta solución se añadió lentamente ácido caprílico en una relación de 25 μL por mL de suero diluido. La mezcla se incubó 30 minutos en agitación y se centrifugó (10000 g, 30 minutos) . El sobrenadante con las proteínas de interés se recogió, se filtró, se mezcló con tampón PBS 10X (una parte de tampón por cada diez de sobrenadante) y se enfrió a 4ºC. Para precipitar los anticuerpos que contiene esta solución se le añadió sulfato amónico al 45% (p/v) en agua. La mezcla se mantuvo 30 minutos a 4ºC y se centrifugó. El precipitado con los anticuerpos se recogió, se resuspendió en tampón PBS pH 7, 2 y se dializó frente a 2000 volúmenes del mismo tampón. La solución final de anticuerpos se fraccionó en alícuotas de 50 μL que fueron guardadas a -20ºC.
La reactividad de los Abs frente a ABA fue determinada mediante RIA. Para ello, se incubaron 100 μL de diferentes diluciones de los sueros anti-ABA preparadas en tampón PBS 50 mM pH 7 con 0, 165 pmol de antígeno marcado radiactivamente ([3H] (±) ABA, actividad específica 1, 48 TBq/mmol) en tubos de polipropileno de 2 mL a los que se añadieron además 600 μL de gelatina (0, 1%, p/v) y 100 μL de BSA (1%, p/v) , ambas disueltas también en tampón PBS 50 mM pH 7. Al cabo de 3 horas de incubación a 4ºC, el antígeno libre y el ligado a los anticuerpos fueron separados por precipitación con sulfato amónico y centrifugación. La cantidad de complejos antígeno-anticuerpo formados fue detectada midiendo la radiactividad en los precipitados. Se detectó actividad para diluciones por debajo de 104- veces de los antisueros.
Ejemplo 2
Método inmunoquímico para la detección y cuantificación de (+) ABA en muestras
La detección y cuantificación de (+) ABA en muestras se realiza utilizando un método inmunoquímico, particularmente un RIA competitivo. Se basa en la competición entre una cantidad variable de antígeno frío (no marcado) y una cantidad fija de antígeno trazador (marcado radiactivamente) por la unión a una cantidad fija de los anticuerpos anti-ABA tipo C4'-ABA desarrollados en la patente. El antígeno frío puede ser, o bien (+) ABA de la muestra en la que queremos detectar y cuantificar la hormona, o bien (+) ABA estándar de una solución de concentración conocida.
El método de detección y cuantificación de (+) ABA de esta invención está caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
a) Añadir en tubos de polipropileno de 2 mL volúmenes de 0, 5 mL de gelatina (0, 1%, p/v) , 0, 1 mL de BSA (1%, ply) , 0, 1 mL de antígeno trazador ([3H] (±) ABA, actividad específica 1, 48 TBq/mmol) y 0, 1 mL de solución de (+) ABA estándar o de muestra. Todas las soluciones se preparan en tampón PBS 50 mM pH 7 y las muestras se resuspenden también en 0, 5-1 mL del mismo tampón. Las concentraciones de (+) ABA estándar de la curva de calibración son 0, 0, 05, 0, 2, 0, 5, 2, 5, 20, 50, 200 y 500 pmol/100 μL. La concentración de antígeno trazador es 0, 165 pmol/100 μL. La mezcla se agita.
b) Añadir 0, 1 mL del suero anti-ABA diluido en tampón PBS 50 mM pH 7 e incubar durante al menos 3 horas a 4ºC en oscuridad. En una realización preferida del método que se describe, los antisueros específicos se preparan como se describe en el ejemplo 1 de la patente.
b) Añadir a cada tubo 1 mL de una solución acuosa de sulfato amónico 76% (p/v, concentración saturante) para precipitar los anticuerpos y mantener a temperatura ambiente durante 30 minutos.
c) Centrifugar los tubos durante 15 minutos a 10500 g. Retirar el sobrenadante para eliminar el antígeno no ligado y resuspender el precipitado que contiene los complejos antígeno-anticuerpo en 1 mL de una solución acuosa de sulfato amónico 38% (p/v) . Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente
d) Centrifugar los tubos durante 15 minutos a 10500 g. Retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 150 μL de agua destilada.
e) Añadir 1, 5 mL de líquido de centelleo y medir la radiactividad en un contador de centelleos para cuantificar el (+) ABA presente en las muestras con ayuda de los datos obtenidos para la curva de calibración.
