Métodos y compuestos para la caracterización de la población bacteriana en biopelículas.
Campo técnico de la invención
La invención se relaciona con reactivos adecuados para la detección específica de microorganismos del género que forma parte habitualmente de las biopelículas que aparecen en la maquinaria usada en la industria papelera, particularmente Klebsiella, Raoultella, Enterobacter y Pantoea.
Antecedentes de la invención
Uno de los principales problemas asociados al proceso de fabricación de papel y cartón en la industria papelera es la formación de biopelículas o depósitos de slime o biopelícula que afectan tanto al proceso de fabricación del papel como a la calidad del producto final. Las biopelículas se definen como acumulaciones microbianas inmovilizadas y embebidas en una matriz de un polímero orgánico de origen microbiano (exopolisacáridos) , mezclados con fibras, cargas minerales y otros componentes orgánicos e inorgánicos resultantes del metabolismo microbiano. Este problema es más acusado en la actualidad debido a la baja calidad de las fibras recicladas usadas hoy en día como materia prima así como a ciertos procedimientos que se usan actualmente (circuitos cerrados de agua, temperaturas de hasta 50ºC y pH neutro) , puesto que proporcionan un microentorno favorable para el crecimiento de bacterias, levaduras y hongos.
La formación de biopelículas resulta en la aparición de defectos en el producto final tales como manchas y agujeros, malos olores y la pérdida de las propiedades ópticas del papel, así como una menor productividad en el proceso de fabricación debido a roturas y tiempos de limpieza y un mayor coste debido a los compuestos químicos usados para el tratamiento de las biopelículas.
Tradicionalmente, las biopelículas se han tratado usando agentes antimicrobianos de amplio espectro. Sin embargo, debido a los problemas medioambientales asociados a dichos tratamientos, es preferible usar tratamientos más específicos que no afectan a todos los microorganismos de forma indiscriminada sino sólo a aquellos que aparecen en las papeleras y que influyen negativamente en la calidad y en el rendimiento del proceso de fabricación de papel. Además, los microorganismos que forman las biopelículas son más resistentes a agentes biocidas que los microorganismos que no forman parte de dichas biopelículas por lo que el tratamiento indiscriminado con agentes biocidas poco específicos puede resultar en una selección de los microorganismos que forman la biopelícula. Uno de los grupos de microorganismos más abundantes en las papeleras son las enterobacterias y, más particularmente, Pantoea agglomerans, Enterobacter sp., Raoultella y Klebsiella sp. (Rätto, M. et al., 2001, Appl. Microbiol. Biotechnol., 57:182-185; Rättö, M. et al., 2006, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 33:359-367 y Väisänen, O.M. et al., 1998, J. Appl. Microbiol., 84:1069-1084) .
Sin embargo, la composición bacteriana exacta de las biopelículas depende tanto de la naturaleza de la contaminación bacteriana original como de las condiciones de crecimiento, por lo que la eficacia de un tratamiento puede variar enormemente entre distintas papeleras. Por tanto, la elección del tratamiento adecuado requiere el conocimiento previo de la composición microbacteriana de la biopelícula presente en la papelera.
WO2005045132 describe un método para la detección de microorganismos formadores de biopelículas en un proceso de fabricación de papel o cartón en el que se usan colorantes que identifican la totalidad de la biomasa, colorantes que muestran el número total de células, colorantes de viabilidad que muestran el número de células vivas y sustratos fluorogénicos que permiten detectar la presencia de determinadas actividades enzimáticas. Este método, sin embargo, únicamente proporciona información sobre la presencia de microorganismos en una determinada muestra sin aportar ninguna información sobre la identidad de los microorganismos detectados y, además, requiere el cultivo de los microorganismos antes de poder efectuar la determinación.
EP1350431 describe un método para la identificación de agentes antimicrobianos capaces de inhibir la formación de una biopelícula que incluye, en una primera etapa, la identificación de los microorganismos presentes en una biopelícula mediante la amplificación del ADNr 16S, su secuenciación y la posterior comparación con las secuencias de ADNr 16S disponibles en las bases de datos. Este método sólo permite identificar aquellos microorganismos cuyo ADNr 16S haya sido descrito con anterioridad y, además, no proporciona ninguna información sobre la viabilidad de dichos microorganismos.
Rättö, M. et al. (J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2005, 32:109-114) han descrito un método para la identificación de los microorganismos que forman parte de los depósitos de biopelículas que se forman en la maquinaria empleada para la fabricación de papel mediante secuenciación del ADNr 16S, ribotipaje, ensayos fisiológicos y análisis de ácidos grasos. Sin embargo, este método requiere múltiples ensayos para la caracterización de los microorganismos presentes, no proporciona ninguna información particular sobre qué microorganismos se encuentran formando parte de biopelículas y tampoco proporciona ninguna información sobre la viabilidad de los microorganismos.
Por tanto, es necesario un método que permita la detección de bacterias en su entorno natural, sin necesidad de cultivarlas, a la vez que la identificación de los microorganismos presentes en la muestra. Un método que proporciona una solución a dichos problemas es la hibridación in situ con marcadores fluorescentes (FISH) (Amman, R.I. et al., 1995, Microbiol. Rev., 59:143-149) . Sin embargo, esta tecnología se ha utilizado sólo en contadas ocasiones para el estudio de la composición bacteriana de las biopelículas formadas en máquinas de fabricación de papel. Por ejemplo, la tesis doctoral de Kolari, M. ("Attachment mechanisms and properties of bacterial biofilms on non-living surfaces", mayo de 2003, Universidad de Helsinki, Faculty of Agriculture and Forestr y , Applied Chemistr y and Microbiology, disponible online en https://oa.doria.fi/handle/10024/3281) describe el uso de FISH para la identificación de D. geothermalis en biopelículas formadas en máquinas usadas en la fabricación de papel mediante el uso de sondas específicas para el ARN 16S de dicho organismo. Kim, S.B. et al. (Water Sci. Technol., 2002, 559-564) describen el uso de FISH para la identificación de Thiothrix sp., en aguas residuales procedentes de industrias papeleras o de tratamiento de aguas, mediante el uso de sondas dirigidas al ADNr 16S.
Sin embargo, ninguno de los métodos descritos hasta la fecha para identificar microorganismos en biopelículas permite la detección simultánea de microorganismos pertenecientes a más de un género. Además, la técnica de FISH presenta las desventajas de que (i) no proporciona ninguna información sobre la viabilidad de los microorganismos analizados y (ii) la sensibilidad viene determinada por el número de copias del ADN diana presentes en la muestra. Por ello, se han desarrollado métodos en los que la técnica de FISH se usa en combinación con otros métodos que si proporcionan información sobre la viabilidad de los microorganismos y que permiten aumentar la sensibilidad de la detección, tales como el recuento de células viables (Armisen, T. et al., 2004, Water Science and Technology, 50:271-275; García-Armisen. T. y Servais, P., 2004, Journal of Microbiological Methods, 58:269-279) , la citometría de flujo (Rigottier-Gois, L. et al., 2003, FEMS Microbiology Ecology, 43:237-245) , la reacción en cadena de la polimerasa in situ o la tinción con compuestos que sólo son capaces de detectar células vivas, tales como el ioduro de propidio.
Por tanto, es necesario el disponer de técnicas que permitan la caracterización de la población microbiana que forma las biopelículas que no presenten los inconvenientes de los métodos conocidos en el estado de la técnica, es decir, que permitan la caracterización de las especies o géneros de microorganismos presentes en la biopelícula y que, además, proporcionen información sobre su viabilidad.
La identificación de especies presentes en una población bacteriana es posible mediante el empleo de las llamadas sondas de especie, género y familia, que permiten detectar, respectivamente, todos los microorganismos de una determinada especie, de un determinado género o de una determinada familia. En el caso particular de las biopelículas que aparecen en las máquinas de fabricación de papel, las bacterias más abundantes son las pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Hasta la fecha se han descrito sondas específicas para la familia de las enterobacteriaceas basadas en las secuencia de los nucleótidos 1251-1274 del ARNr 16S de E. coli (Ootsubo, M. et al., 2002, J. Applied Microbiol., 93:60-68) , la secuencia consistente en los nucleótidos 1273-1289 del ARNr 16S de E. coli (Loge, F. et al., 1999, Water Environment Research, 71:75-83) o la denominada secuencia repetitiva intergénica (ERIC) (Hulton, C.S.J., et al., 1991, Mol. Microbiol., 5:825-834) . La sonda dirigida contra los nucleótidos 1251-1274 del ARNr 16S de E. coli (sonda D) ha sido usada para la detección específica de enterobacterias mediante FISH (Ootsubo, M. et al., 2003, Journal of Applied Microbiology, 95:1182-1190) .
Sin embargo, éstas son incapaces de distinguir los distintos géneros de la familia Enterobacteriaceae. Por otro lado, JP7067657 y JP7067656 describen, respectivamente, sondas específicas para los géneros Klebsiella y Enterobacter. Sin embargo, estas sondas no han sido utilizadas hasta la fecha para el análisis de biopelículas y únicamente permiten la detección de microorganismos pertenecientes a un único género, lo que limita su aplicación para la caracterización de poblaciones bacterianas mediante FISH puesto que requeriría el uso de un marcador fluorescente por cada género presente en la población, lo que reduce necesariamente el número de cepas que pueden ser detectadas dado el limitado número de marcadores fluorescentes que pueden ser detectados simultáneamente. Por tanto, existe la necesidad en la técnica de métodos adicionales que permitan la caracterización en mayor detalle de los microorganismos que se encuentran formando parte de una biopelícula.
Compendio de la invención
La invención se relaciona con un oligonucleótido que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies de los géneros Klebsiella y Raoultella, con un oligonucleótido que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies de los géneros Enterobacter y Pantoea y con una sonda que comprende un oligonucleótido que hibrida específicamente con la región repetitiva intergénica consenso (ERIC) de organismos de la familia Enterobacteriaceae acoplado a un resto fluorescente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de al menos un oligonucleótido de la invención o de una sonda según la invención para la detección de enterobacterias.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la detección de enterobacterias pertenecientes a los géneros Klebsiella y Raoultella, que comprende
(a) poner en contacto la muestra que se sospecha contiene dichas enterobacterias con al menos una sonda que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies de los géneros Klebsiella y Raoultella, en condiciones adecuadas para la hibridación de las sondas con los microorganismos pertenecientes a dichos géneros y
(b) detectar la fluorescencia emitida por las moléculas de oligonucleótido que han hibridado con la muestra.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la detección de enterobacterias pertenecientes al género Raoultella en una muestra que comprende
(a) poner en contacto la muestra que se sospecha contiene dichas enterobacterias con al menos una sonda que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies de los géneros Klebsiella y Raoultella y con una sonda específica para los microorganismos del género Klebsiella, en condiciones adecuadas para la hibridación de las sondas con los microorganismos pertenecientes a dichos géneros y
(b) detectar la fluorescencia emitida por las moléculas de oligonucleótidos que han hibridado con la muestra
en donde las enterobacterias del género Raoultella son aquellas marcadas con la sonda específica de las especies de los géneros Klebsiella y Raoultella pero no con la sonda específica del género Klebsiella.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la detección en una muestra de enterobacterias pertenecientes a los géneros Enterobacter y Pantoea que comprende
(a) poner en contacto la muestra que se sospecha contiene dichas enterobacterias con al menos una sonda que hibrida específicamente las de los géneros Enterobacter y Pantoea en condiciones adecuadas para la hibridación de las sondas con los microorganismos pertenecientes a dichos géneros.
(b) detectar la fluorescencia emitida por las moléculas de oligonucleótido que han hibridado con la muestra
en donde los microorganismos pertenecientes a los géneros Enterobacter y Pantoea son aquellos marcados simultáneamente con la sonda específica de los géneros Enterobacter y Pantoea.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la detección de enterobacterias en una muestra de bacterias pertenecientes a la especie Enterobacter aerogenes Bac que comprende
(a) poner en contacto la muestra que se sospecha contiene dichas enterobacterias con al menos una sonda que hibrida de forma específica con especies de los géneros Klebsiella y Raoutella y con al menos una sonda que hibrida de forma específica con especies de los géneros Enterobacter y Pantoea en condiciones adecuadas para la hibridación de dichas sondas con el material genético perteneciente a los microorganismos de dichos géneros y
(b) detectar la fluorescencia emitida por las moléculas de oligonucleótido que han hibridado con la muestra en donde los microorganismos pertenecientes a la especie Enterobacter aerogenes Bac son aquellos marcados simultáneamente con al menos una sonda que hibrida de forma específica con especies de los géneros Klebsiella y Raoutella y con al menos una sonda que hibrida de forma específica con especies de los géneros Enterobacter y Pantoea.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la caracterización de una población bacteriana que comprende
(a) poner en contacto dicha población bacteriana con un oligonucleótido que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies de los géneros Klebsiella y Raoultella y
(b) determinar el número de células cuyo ADN hibrida específicamente con dicho oligonucleótido y el número total de células
en donde el porcentaje de células positivas cuyo ADN hibrida con el oligonucleótido con respecto al número de células totales indica el porcentaje de bacterias de los géneros Klebsiella y Raoultella en la muestra.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la caracterización de una población bacteriana que comprende
(a) poner en contacto dicha población bacteriana con un oligonucleótido que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies de los géneros Enterobacter y Pantoea y
(b) determinar el número de células cuyo ADN hibrida específicamente con dicho oligonucleótido sonda y el número total de células
en donde el porcentaje de células positivas cuyo ADN hibrida con el oligonucleótido con respecto al número de células totales indica el porcentaje de bacterias de los géneros Enterobacter y Pantoea en la muestra.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para determinar la eficacia de un tratamiento antibacteriano sobre las enterobacterias que forman una biopelícula que comprende las etapas de
(a) someter la biopelícula a un tratamiento antibacteriano
(b) poner en contacto dicha biopelícula con al menos una sonda que comprende un oligonucleótido que hibrida específicamente con la región repetitiva intergénica consenso (ERIC) de organismos de la familia Enterobacteriaceae acoplado a un resto fluorescente y
(c) determinar el porcentaje de células positivas para la sonda o sondas aplicada o aplicadas en la etapa (b) con respecto el número total de células
en donde una reducción del valor determinado en la etapa (c) con respecto al valor determinado en ausencia de tratamiento antibacteriano es indicativo de que el tratamiento es particularmente eficaz para eliminar las enterobacterias de la biopelícula.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Imagen compuesta de una doble hibridación de un cultivo puro de una muestra de biopelícula. Detección de bacterias positivas a la sonda ERIC marcada con FITC (panel inferior) , EUB 338 marcado con CY3 (panel intermedio) y ADN teñido con DAPI (panel superior) .
Figura 2: Efecto de tres tipos de productos antimicrobiológicos en el crecimiento de cepas enterobacterianas formadoras de biopelículas: (A) E. aerogenes Bac, (B) E. cloacae E-022114 y (C) K. pneumoniae E-011927. B1: Butrol, B2: Butrol 881, B3: Butrol 1072, B4: Butrol 1009, B5: Busperse 235, B6: Buzyme 2501.
Descripción detallada de la invención
Los autores de la presente invención han identificado una secuencia en el ADNr 16S de Klebsiella pneumoniae y de Raoutella planticola que es específica de especies de los géneros Klebsiella y Raoutella, de forma que oligonucleótidos que contienen dicha secuencia pueden ser usados como sondas de género para la identificación de microorganismos pertenecientes a especies de dichos géneros. Así mismo, los autores de la presente invención han identificado una secuencia en el ADNr 16S de Enterobacter cloacae que es específica para las especies de los géneros Enterobacter, Pantoea y para Citrobacter koseri, de forma que oligonucleótidos que contienen dicha secuencia pueden ser usados como sondas de género para la identificación de microorganismos pertenecientes a especies de dichos géneros.
Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido que hibrida de forma específica con el ADNr 16S de especies de los géneros Klebsiella y Raoutella. En otro aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido que hibrida de forma específica con el ADNr 16S de especies de los géneros Enterobacter y Pantoea.
El término "oligonucleótido", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un ácido nucleico de al menos 16, preferiblemente al menos 20, preferiblemente al menos 25 y, preferiblemente no más de 100 nucleótidos que es capaz de hibridar específicamente con un ADN genómico, con un ADNc, con un ARNm o con cualquier otro ácido nucleico de interés. La invención contempla tanto el uso de oligonucleótidos formados por nucleótidos convencionales unidos por enlaces fosfodiester convencionales como variantes de los mismos que incluyen modificaciones en los restos de purina o pirimidina y modificaciones en los restos de ribosa o desoxirribosa. Modificaciones adecuadas en el contexto de la presente invención incluyen nucleótidos modificados con arabinosa, según se ha descrito en WO2007/038869 así como nucleótidos que presentan en posición 2' del azúcar un substituyente seleccionado del grupo de fluoro, hidroxilo, amino, azido, alquilo, alcoxi y alcoxialquilo. En otra forma de realización de la invención, el grupo alquilo se selecciona del grupo metilo, etil, propil, butil o un grupo alquilo funcionalizado como etilamino, porpilamino y butilamino. Alternativamente, el grupo alcoxi es metoxi, etoxi, propoxi o un grupo alcoxi funcionalizado según la fórmula -O (CH2) q-R, donde q es de 2 a 4 y R es un grupo amino, metoxi o etoxi. Grupos alcoxialquilo adecuados son metoxietilo y etoxietilo. También forman parte de la invención oligonucleótidos en los que distintos nucleótidos contienen distintas modificaciones en posición 2'. Alternativa o adicionalmente, los oligonucleótidos de la invención pueden contener enlaces modificados tales como enlaces tipo fosfodiester, fosfotriester, fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoamidato, metilfosfonato, boranofosfonato así como combinaciones de los mismos o bien son péptidos ácidos nucleicos (Peptide nucleic acids, PNA) , en los que los distintos nucleótidos están unidos por enlaces amida.
La expresión "hibridación específica", tal como se utiliza en la presente invención se refiere a que es posible elegir condiciones adecuadas que permiten la hibridación de la sonda con el ácido nucleico diana sin que exista una hibridación sustancial con ácidos nucleicos que carecen de la secuencia complementaria a la secuencia de la sonda. En cada reacción de hibridación, las condiciones restrictivas pueden variarse mediante manipulación de tres factores: temperatura, concentración de sales y concentración de formamida. La alta temperatura y la baja concentración de sal aumentan las condiciones restrictivas. La formamida disminuye la temperatura de fusión del ADN, disminuyendo así la temperatura a la que se puede formar el híbrido entre dos cadenas de ácidos nucleicos.
Condiciones típicas de hibridación altamente restrictivas incluyen la incubación de la sonda con la muestra que contiene el ácido nucleico diana en 6 X SSC (1 X SSC: NaCl 0, 15 M, citrato de sodio 0, 015 M) y formamida al 40% a 42ºC durante 14 horas, seguido de uno o varios ciclos de lavado usando 0, 5 X SSC, SDS al 0, 1% a 60ºC. Alternativamente, condiciones altamente restrictivas incluyen aquellas que comprenden una hibridación a una temperatura de aproximadamente 50º-55ºC en 6XSSC y un lavado final a una temperatura de 68ºC en 1-3XSSC. Las condiciones restrictivas moderadas comprenden la hibridación a una temperatura de aproximadamente 50ºC hasta unos 65ºC en NaCl 0, 2 o 0, 3 M, seguida de lavado a aproximadamente 50ºC hasta unos 55ºC en 0, 2X SSC, 0, 1% SDS (sulfato de dodecilo y sodio) . La invención contempla variaciones de las condiciones anteriormente descritas de forma que la sondas sean capaces de discriminar el polinucleótido diana de otros polinucleótidos que aparecen en microorganismos no diana.
El término "ADN 16S" tal como se usa en la presente invención, se refiere al gen que codifica el ARNr 16S que forma parte de la subunidad 30S de los ribosomas procariotas. Los ADN 16S que se usan en el contexto de la presente invención incluyen el ADN 16S de Klebsiella pneumoniae (Número de acceso en GenEMBL: AF130982) , el ADN 16S de Raoultella planticola ( (Número de acceso en GenEMBL: AF129443) , el ADN 16S de Enterobacter cloacae ( (Número de acceso en GenEMBL: AJ251469) .
La expresión "especies pertenecientes al género Klebsiella", según se entiende en la presente invención, incluye todas aquellas cepas bacterianas que tienen las características del género Klebsiella según se define en Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (eds. Garrity, George M., Boone, David R. y Castenholz, Richard W., segunda edición, 2001) y en la publicación de Drancourt et al., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001, 51:925-32. Ejemplos ilustrativos no limitativos de especies que forman parte del género Klebsiella incluyen Klebsiella granulomatis, Klebsiella milletis, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae y sus diferentes subsespecies y similares.
La expresión "especies pertenecientes al género Raoultella", según se entiende en la presente invención, incluye todas aquellas cepas bacterianas que tienen las características del género Raoultella según se define en Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (eds. Garrity, George M., Boone, David R. y Castenholz, Richard W., segunda edición, 2001) y en la publicación de Drancourt et al., 2001, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001, 51:925-32. Ejemplos ilustrativos no limitativos de especies que forman parte del género Raoultella incluyen Raoultella ornithinolytica, Raoultella planticola y Raoultella terrigena.
La expresión "especies pertenecientes al género Enterobacter", según se entiende en la presente invención, incluye todas aquellas cepas bacterianas que tienen las características del género Enterobacter según se define en Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (eds. Garrity, George M., Boone, David R. y Castenholz, Richard W., segunda edición, 2001) . Ejemplos ilustrativos y no limitativos de especies que forman parte del género Enterobacter incluyen Enterobacter aerogenes, Enterobacter amnigenus, Enterobacter cancerogenus, Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae, Enterobacter hormaechei, Enterobacter cowanii, Enterobacter gergoviae, Enterobacter helveticus, Enterobacter kobei, Enterobacter ludwigii, Enterobacter nickellidurans, Enterobacter nimipressuralis, Enterobacter pulveris, Enterobacter pyrinus, Enterobacter radicincitans, Enterobacter turicensis y similares.
La expresión "especies pertenecientes al género Pantoea", según se entiende en la presente invención, incluye todas aquellas cepas bacterianas que tienen las características del género Pantoea según se define en Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (eds. Garrity, George M., Boone, David R. y Castenholz, Richard W., segunda edición, 2001) . Ejemplos ilustrativos y no limitativos de especies que forman parte del género Pantoea incluyen Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea cedenensis, Pantoea citrea, Pantoea dispersa, Pantoea endophytica, Pantoea oleae, Pantoea stewartii y similares.
En una forma preferida de realización, el oligonucleótido que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies del género Klebsiella y Raoultella es un oligonucleótido que comprende la secuencia correspondientes a las posiciones 434 a 452 del ADN 16S de Klebsiella penumoniae y Raoutella planticola (SEQ ID NO:3) o una variante funcionalmente equivalente de la misma. En otra forma preferida de realización, el oligonucleótido que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies del género Enterobacter, Pantoea y Citrobacter koseri es un oligonucleótido que comprende la secuencia correspondiente a las posiciones 442 a 457 del ADN 16S de Enterobacter cloacae (SEQ ID NO:5) o una variante funcionalmente equivalente de la misma.
Por variante funcionalmente equivalente de una secuencia se entiende toda aquella secuencia que pueda ser obtenida mediante inserción, deleción y/o sustitución de uno o más nucleótidos de aquella y que mantenga sustancialmente intacta su capacidad de hibridar bajo condiciones muy estrictas con su secuencia diana. Métodos adecuados para identificar variantes funcionalmente equivalentes de las secuencias de SEQ ID NO:3 y 5 incluyen la realización de estudios de FISH sobre cultivos puros de cepas de referencia en las condiciones que se especifican en el ejemplo 3.
En otra forma preferida de realización, el oligonucleótido que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies del género Klebsiella y Raoultella es un oligonucleótido que consiste en la secuencia SEQ ID NO:3 y el oligonucleótido que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies del género Enterobacter y Pantoea es un oligonucleótido que consiste en la secuencia SEQ ID NO:5.
Los oligonucleótidos objeto de la presente invención definidos anteriormente pueden conjugarse a una molécula fluorescente para así poder ser usados para la detección de enterobacterias mediante FISH. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con una sonda que comprende un oligonucleótido oligonucleótido que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies del género Klebsiella y Raoultella acoplado a un marcador fluorescente y a un oligonucleótido que hibrida específicamente con el ADNr 16S de especies del género Enterobacter y Pantoea acoplado a un resto fluorescente.
Por "resto fluorescente", según se usa en el contexto de la presente invención, se entiende cualquier molécula capaz de emitir una radiación electromagnética en respuesta a la absorción de una radiación de excitación en donde la longitud de onda de la radiación emitida es distinta que la longitud de onda de la radiación de excitación y en donde la emisión de radiación persiste únicamente mientras se mantiene la radiación de excitación. Ejemplos ilustrativos pero no limitativos de marcadores fluorescentes que pueden ser usados en el contexto de la presente invención incluyen:
TABLA 1 Colorantes fluorescentes comúnmente empleados 
En una forma preferida de realización, el resto fluorescente se selecciona del grupo de fluoresceína (FITC) , hexaclorofluoresceina (HEX) y CY3.
Adicionalmente, la invención se relaciona con una sonda que comprende un oligonucleótido que hibrida específicamente con la región repetitiva intergénica consenso (ERIC) de la familia Enterobacteriaceae marcado acoplado a un resto fluorescente. En una forma preferida de realización. el oligonucleótido que hibrida específicamente con la región repetitiva intergénica consenso (ERIC) de la familia Enterobacteriaceae es la región identificada por Hulton, C.S.J. et al. (Mol. Microbiol., 1991, 5:825-834) . En una forma preferida de realización, el oligonucleótido que hibrida específicamente con la región intergénica repetitiva consenso (ERIC) de la familia Enterobacteriaceae comprende la secuencia SEQ ID NO:6. En una forma de realización aún más preferida, el oligonucleótido que hibrida específicamente con la región repetitiva intergénica consenso (ERIC) de la familia Enterobacteriaceae consiste en la secuencia SEQ ID NO:6.
Los marcadores fluorescentes que pueden ser acoplados a la sonda específica para la región consenso ERIC, según la presente invención, son los mismos que se han señalado anteriormente en el caso de las sondas específicas de género. Preferiblemente, los marcadores fluorescentes se seleccionan del grupo de fluoresceína (FITC) , hexaclorofluoresceina (HEX) y CY3.
Los oligonucleótidos y las sondas objeto de la invención tienen una especial utilidad para la detección de enterobacterias y, más en particular, para la identificación de enterobacterias formadoras de biopelículas, preferiblemente para la identificación de enterobacterias pertenecientes a los géneros Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, y Pantoea. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de al menos un oligonucleótido de la invención para la detección de enterobacterias, preferiblemente para la detección de enterobacterias pertenecientes al género Klebsiella, Raoultella, Enterobacter y Pantoea.
Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido que hibrida de forma específica con el ADNr 16S de especies de los géneros Klebsiella y Raoutella. En otro aspecto, la invención se relaciona con un oligonucleótido
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la detección de enterobacterias pertenecientes a los géneros Klebsiella y Raoultella que comprende
(a) poner en contacto la muestra que se sospecha contiene dichas enterobacterias con al menos una sonda que hibrida de forma específica con el ADNr 16S de especies de los géneros Klebsiella y Raoutella según la invención en condiciones adecuadas para la hibridación de dichas sondas con el material genético perteneciente a los microorganismos de dichos géneros.
(b) detectar la fluorescencia emitida por las moléculas de oligonucleótido que han hibridado con la muestra.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la detección de enterobacterias pertenecientes al género Raoultella que comprende
(a) poner en contacto la muestra que se sospecha contiene dichas enterobacterias con al menos una sonda que hibrida de forma específica con el ADNr 16S de especies de los géneros Klebsiella y Raoutella y con al menos una sonda específica para los microorganismos del género Klebsiella y
(b) detectar la fluorescencia emitida por las moléculas de oligonucleótido que han hibridado con la muestra,
en donde las enterobacterias del género Raoultella aquellas marcadas con la sonda que hibrida de forma específica con el ADNr 16S de especies de los géneros Klebsiella y Raoutella pero no con la sonda que hibrida de forma específica con los microorganismos del género Klebsiella.
En una forma preferida de realización, la sonda que hibrida de forma específica con los microorganismos del género Klebsiella comprende un oligonucleótido que comprende o consiste en la secuencia definida en SEQ ID NO:8 acoplada a un marcador fluorescente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la detección de enterobacterias pertenecientes a los géneros Enterobacter y Pantoea que comprende
(a) poner en contacto la muestra que se sospecha contiene dichas enterobacterias con al menos una sonda que hibrida de forma específica con el ADNr 16S de especies de los géneros Enterobacter y Pantoea en condiciones adecuadas para la hibridación de dichas sondas con el material genético perteneciente a los microorganismos de dichos géneros y
(b) detectar la fluorescencia emitida por las moléculas de oligonucleótido que han hibridado con la muestra.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para la detección de enterobacterias en una muestra de bacterias pertenecientes a la especie Enterobacter aerogenes Bac que comprende
(a) poner en contacto la muestra que se sospecha contiene dichas enterobacterias con al menos una sonda que hibrida de forma específica con el ADNr 16S de especies de los géneros Klebsiella y Raoutella y con al menos una sonda que hibrida de forma específica con el ADNr 16S de especies de los géneros Enterobacter y Pantoea y en condiciones adecuadas para la hibridación de dichas sondas con el material genético perteneciente a los microorganismos de dichos géneros y
(b) detectar la fluorescencia emitida por las moléculas de oligonucleótido que han hibridado con la muestra
en donde los microorganismos pertenecientes a la especie Enterobacter aerogenes Bac son aquellos marcados simultáneamente con al menos una sonda que hibrida de forma específica con el ADNr 16S de especies de los géneros Klebsiella y Raoutella y con al menos una sonda que hibrida de forma específica con el ADNr 16S de especies de los géneros Enterobacter y Pantoea.
La invención permite el análisis de prácticamente cualquier muestra que pueda estar contaminada con una población de enterobacterias. Típicamente, la muestra es una población bacteriana asociada a un procedimiento industrial de producción de bienes de consumo como por ejemplo industrias papeleras, industrias heladeras, industrias petroleras, industrias aceiteras, cerveceras y de tratamiento de aguas residuales o asociada a un procedimiento de manipulación de fluidos biológicos en el entorno sanitario como sistema de perfusión entéricos, sistemas de diálisis, catéteres y similares. Alternativamente, la muestra puede ser de origen biológico y comprender tejidos, células, extractos celulares, homogenados celulares, fracciones proteicas, fluidos biológicos (sangre, suero, plasma, orina, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, orina, sudor, etc.) . Alternativamente, la muestra puede consistir en órganos enteros tales como músculo, ojo, piel, gónadas, nódulos linfáticos, corazón, cerebro, pulmón, hígado, riñón, bazo, tumores.
La muestra se prepara de forma que sea accesible a las sondas de la invención. Preferiblemente, la muestra se permeabiliza mediante el uso de lisozima seguido de un tratamiento de deshidratación con concentraciones crecientes de etanol de 70%, 90% y 96%.
Los métodos de FISH permiten detectar la presencia de una determinada especie de polinucleótido pero no proporcionan ninguna información sobre la viabilidad celular. Por ello, en una forma de realización, el método de determinación de la presencia de una enterobacteria perteneciente al género de Klebsiella, Raoultella, Enterobacter, y Pantoea, de acuerdo con la invención, comprende una etapa adicional en la que se determina la viabilidad celular.
La viabilidad celular se puede determinar bien mediante la cuantificación directa del número de células viables o mediante la diferencia entre el número de células totales y el número de células no viables. Los métodos para la determinación del número de células viables que se pueden utilizar en el contexto de la presente invención son ampliamente conocidos para el experto en la materia, e incluyen, sin limitación, las medidas de dispersión óptica, medidas potenciométricas y determinaciones redox. En una forma preferida de realización, la determinación de la viabilidad celular se efectúa mediante el uso de compuestos capaces de acceder al interior celular en donde son modificados por enzimas intracelulares, principalmente esterasas, para dar lugar a un compuesto detectable que queda retenido en el interior celular. Ejemplos de este tipo de compuestos se han descrito en "The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies", capítulo 15 (Molecular Probes Inc.) e incluyen las denominadas calceínas, BCECF AM, diacetato de fluoresceína, diacetato de carboxifluoresceina, diacetato de sulfofluoresceina, Green CMFDA, diacetato de pentafluorobenzoil aminofluoresceina, acetado de clorometil SNARF-1 y diacetato de carboxinaftofluoresceina.
Preferiblemente, la viabilidad celular se determina mediante la cuantificación del número de células no viables. Para este fin se utilizan los denominados colorantes de exclusión, que son compuestos capaces de acceder al interior de células con una integridad de membrana comprometida pero que son excluidos completamente por células vivas. Preferiblemente, estos compuestos son capaces de unirse al ADN generando de esa manera aductos fluorescentes que facilitan la detección a la vez que eliminan la necesidad de efectuar lavados entre la adición del compuesto y la visualización de la muestra al microscopio. Compuestos de este tipo han sido descritos en "The Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies", capítulo 15 (Molecular Probes Inc.) e incluyen el SYTOX Green, el SYTOX Orange, el SYTOX Blue, TOTO, TO-PRO, ioduro de propidio, bromuro de etidio, homodímero de etidio 1, monoazida de etidio, ioduro de hexidio. En una forma preferida de realización, el colorante de exclusión es el ioduro de propidio.
Las células se incuban con el colorante de exclusión durante el tiempo necesario y a la concentración necesaria, siendo ambos parámetros determinables de forma rutinaria por el experto en la materia. Una vez terminada la incubación con el colorante de exclusión, se efectúan uno o varios lavados en caso de que sea necesario y, a continuación, se inspeccionan las células. El experto en la materia apreciará que el marcaje de las células con las sondas de familia y/o de género y el marcaje con el colorante de exclusión puede ser llevado a cabo en cualquier orden, simultáneamente e incluso en paralelo sobre muestras distintas de la misma población bacteriana. Las condiciones para la determinación de la fluorescencia emitida por los distintos colorantes vitales o colorantes de exclusión se determina usando las técnicas a disposición del experto en la materia. El experto en la materia apreciará que es posible la determinación simultánea de células vivas, usando alguno de los colorantes vitales descritos anteriormente, y de células muertas usando los colorantes de exclusión citados anteriormente. Cuando se lleva a cabo un doble marcaje, es preferible efectuar la detección de las células vivas y muertas mediante citometría de flujo.
En una forma preferida de realización, la determinación del número de células muertas mediante el uso de colorantes de exclusión se lleva a cabo simultáneamente a la determinación del número de células totales, de forma que el número de células viables se puede determinar a partir de la diferencia entre el número de células totales y el número de células no viables. En una forma preferida de realización, el número total de células se determina mediante el uso de colorantes que son capaces de atravesar la membrana plasmática de células, tanto vivas como muertas, para interaccionar con el ADN y dar lugar a un complejo fluorescente. Colorantes adecuados para este propósito incluyen SYTO 15, SYTO 25, SYTO 13, SYTO 9, SYBR Green I, SYTO 16, SYTO 17, SYTO 17, SYTO 21, SYTO 59, SYTO 16, SYTOX, SYTO BC, DAPI, Hoechst 33342, Hoechst 33258, y PicoGreen. En una forma preferida de realización, el colorante usado para determinar el número de células totales es DAPI. En otra forma de realización, dicho colorante es SYTO13.
En otra forma preferida de realización, el número total de células se determina mediante el uso de una sonda capaz de hibridar específicamente con todos los microorganismos del superreino Eubacteria. En una forma de realización aún más preferida, dicha sonda es capaz de hibridar con el ADNr 16S de dichos microorganismos. Preferiblemente, la sonda que se utiliza para determinar el número total de células es la sonda EUB338 (SEQ ID NO: 7) .
En una forma preferida de realización, la muestra de bacterias en la que se quiere detectar la presencia de enterobacterias es una muestra que se encuentra inmovilizada en un soporte. Por "población bacteriana inmovilizada" se entiende, en el contexto de la presente invención, un conjunto de bacterias cuyo movimiento libre de flotación en el medio se encuentra parcial o totalmente restringido mediante interacciones con otros organismos y/o con un soporte sólido.
Poblaciones inmovilizadas que pueden ser analizadas de acuerdo a la presente invención incluyen biopelículas, en las que las poblaciones se encuentran inmovilizadas dentro de una matriz producida por exopolisacáridos secretados por las propias bacterias y, normalmente, asociados a una superficie. Habitualmente, las biopelículas se forman sobre una superficie que puede ser abiótica (acero inoxidable, estaño, aluminio, titanio, cromo o cualquier metal que tiene una superficie de óxido cristalino, cloruro de polivinilo, poliestireno y otros plásticos poliméricos, cristal, silicatos, cerámica y similares) o biótica (el esmalte de los dientes) . Alternativamente, las células pueden ser células originalmente en suspensión o células procedentes de una biopelícula que ha sido previamente disgregada y que han sido inmovilizadas sobre un soporte usando métodos conocidos para el experto en la materia (filtración, centrifugación y similares) . En una forma de realización preferida, el soporte es una matriz tridimensional. En una forma de realización aún más preferida, la matriz tridimensional es una matriz microporosa. Prácticamente cualquier soporte microporoso puede ser empleado en la presente invención, siempre que sea adecuado para el cultivo de células en suspensión y que el tamaño del poro sea lo suficientemente pequeño para que no escapen las bacterias de su interior. Materiales adecuados para preparar soportes microporosos de acuerdo con la presente invención incluyen gelatina (Cultispher G, HyClone) , celulosa (Cytocell, Pharmacia) , polietileno (Cytoline 1 and 2, Pharmacia) , silicona (Immobasil, Ashby Scientific) , colágeno (Microsphere, Cellex Biosciences) , cristal (Siran, Schott Glassware) , copolímeros acrílicos, de acrilamida, metilen-bis-acrilamida, dimetilaminopropil, metacrilamida, metacrilato de metilestireno, etileno/ácido acrílico, acrilo-nitrilo butadienestireno (ABS) , ABS/policarbonato, ABS/polisulfona, ABS/cloruro de polivinilo, etileno propileno, etilvinilacetato (EVA) , nitrocelulosa, poliacrilonitrilo (PAN) , poliacrilato, policarbonato, polibutilentereftalato (PBT) , polietilentereftalato (PET) , polímeros y copolímeros de polipropileno, poliestireno, politetrafluoroetileno (PTFE) , etileno-propileno fluorado (FEP) , etilentetrafluoroetileno (ETFE) , perfluoroalcoxietileno (PFA) , fluoruro de polivinilo (PVF) , fluoruro de polivinilideno (PVDF) , policlorotrifluoroetileno (PCTFE) , etilenclorotrifluoroetileno (ECTFE) , alcohol polivinílico (PVA) , estirenacrilonitrilo (SAN) , estireno-anhídrido maléico (SMA) .
Una vez que las células se han marcado con las distintas sondas y agentes adecuados, es necesario determinar la emisión fluorescente asociada a las sondas específicas para la determinación del número de enterobacterias de los distintos géneros así como la emisión originada por los agentes usados para la determinación del número total de células y para la determinación del número de células viables. La determinación de la emisión fluorescente por cada uno de los marcadores se puede llevar a cabo mediante FISH así como mediante citometría de flujo. El experto en la materia apreciará que, en el caso de las células que se han hecho crecer sobre filtros, es más adecuada la determinación mediante FISH, mientras que en el caso de células en suspensión, se puede emplear tanto la citometría de flujo, directamente sobre la población celular, como la FISH si la población celular se fija sobre un soporte tal y como se ha indicado anteriormente. La determinación de la emisión fluorescente mediante FISH se lleva a cabo mediante protocolos conocidos para el experto en la materia (véase por ejemplo, Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc.; 2003, unidad 14.7) .
Los oligonucleótidos y sondas objeto de la presente invención son particularmente útiles para la caracterización de poblaciones bacterianas en las que se sospecha que puede existir, en mayor o menor medida, enterobacterias pertenecientes a los géneros Klebsiella, Raoultella, Enterobacter y Pantoea puesto que permiten la detección de distintos géneros pertenecientes a dicha familia, así como la determinación del porcentaje de dichos microorganismos con respecto al total de enterobacterias. Así, en otra forma preferida de realización, la invención se relaciona con un método para la caracterización de la población bacteriana que comprende
(a) poner en contacto dicha población inmovilizada con un oligonucleótido específico para los microorganismos pertenecientes al género Klebsiella y Raoultella
(b) determinar el número de células que muestran una señal de hibridación con dicho oligonucleótido y el número total de células en la muestra
en donde el porcentaje de células que hibridan con el oligonucleótido con respecto al número total de células totales indica el porcentaje de microorganismos pertenecientes a los géneros Klebsiella y Raoultella.
En una forma preferida de realización, la muestra a analizar se pone en contacto en la etapa (a) simultáneamente con un oligonucleótido específico para los microorganismos pertenecientes a los géneros Enterobacter y Pantoea, en donde el porcentaje de células positivas para dicho oligonucleótido indica el porcentaje de microorganismos pertenecientes a los géneros Enterobacter y Pantoea.
En otra forma preferida de realización, la invención se relaciona con un método para la caracterización de la población bacteriana que comprende
(a) poner en contacto dicha población inmovilizada con un oligonucleótido específico para los microorganismos pertenecientes al género Enterobacter y Pantoea.
(b) determinar el número de células que muestran una señal de hibridación con dicho oligonucleótido y el número total de células en la muestra
en donde el porcentaje de células que hibridan con el oligonucleótido con respecto al número total de células totales indica el porcentaje de microorganismos pertenecientes a los géneros Enterobacter y Pantoea.
En una forma preferida de realización, la muestra a analizar se pone en contacto en la etapa (a) simultáneamente con un oligonucleótido específico para los microorganismos pertenecientes a los géneros Klebsiella y Raoultella, en donde el porcentaje de células positivas para dicho oligonucleótido indica el porcentaje de microorganismos pertenecientes a los géneros Klebsiella y Raoultella.
En otra forma preferida de realización, la muestra cuya población bacteriana se desea caracterizar se pone en contacto en la etapa (a) con un oligonucleótido que hibrida específicamente con la región intergénica repetitiva consenso (ERIC) de los microorganismos de la familia enterobacteria, en donde el porcentaje de células positivas con respecto al número de células totales para dicho oligonucleótido indica el porcentaje de enterobacterias en la muestra.
Los oligonucleótidos específicos para los distintos grupos de géneros así como para las enterobacterias han sido definidos anteriormente. En una forma preferida de realización, la sonda que hibrida específicamente con la región intergénica repetitiva consenso (ERIC) comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO:6.
En una forma preferida de realización, los oligonucleótidos específicos para Klebsiella y Raoultella, los oligonucleótidos específicos para Enterobacter y Pantoea y los oligonucleótidos específicos para la región intergénica repetitiva consenso (ERIC) se han marcado, respectivamente, con un primer, con un segundo y con un tercer marcador fluorescente. El experto en la materia apreciará que la elección de marcadores para los tres oligonucleótidos ha de ser tal que no exista un solapamiento sustancial en las longitudes de onda de la radiación de emisión de forma que sea posible la detección simultánea e individualizada de los tres marcadores. Combinaciones de tres marcadores que pueden ser usados simultáneamente incluyen FITC, Cy3 y rodamina, ácido acético amino metil cumarina (AMCA) , FITC y TRITC, FITC, R-PE y PE-Cy5, Cy2, PE-Texas Red y PE-CY5.5, Alexa 488, Cy3 y PE-Alexa 647, Cy3, FITC y Cy5, FITC, rodamina y cumarina, FITC, Texas Red y Cy5 y similares.
En una forma preferida de realización, la detección de las células marcadas con el primer, segundo y/o tercer oligonucleótido se lleva a cabo mediante FISH. Para ello, se emplean los métodos descritos anteriormente.
Preferiblemente, la determinación del número total de células se lleva a cabo mediante el uso de un agente intercalante de ADN capaz de detectar todas las células o mediante el uso de una sonda capaz de hibridar con todos los microorganismos del superreino Bacteria. Ejemplos de dichos agentes intercalantes y de sondas adecuados para la realización de la invención han sido descritos anteriormente. Preferiblemente, la determinación del número total de células se lleva a cabo mediante FISH o mediante citometría de flujo. Preferiblemente, la población celular cuya composición en enterobacterias se desea estudiar se encuentra inmovilizada, bien en forma de biopelícula inmovilizada por los exopolisacáridos producidos por los propios microorganismos de la biopelícula, bien mediante un soporte sólido sobre el que se han aplicado los microorganismos previamente en suspensión mediante filtración o centrifugación.
Las sondas y oligonucleótidos de la presente invención, cuando se usan simultáneamente con los métodos de determinación de la viabilidad celular, permiten determinar la eficacia de un tratamiento antibacteriano sobre las enterobacterias que forman parte de una biopelícula. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para determinar la eficacia de un tratamiento antibacteriano sobre las enterobacterias que forman una biopelícula que comprende las etapas de
(a) someter la biopelícula a un tratamiento antibacteriano
(b) poner en contacto dicha biopelícula con al menos una sonda de la invención específica que hibrida específicamente con la región repetitiva intergénica consenso (ERIC) de la familia Enterobacteriaceae marcado acoplado a un resto fluorescente y
(c) determinar el porcentaje de células positivas para la sonda o sondas aplicada o aplicadas en la etapa (a) con respecto el número total de células
en donde una reducción del valor determinado en la etapa (c) con respecto al valor determinado en ausencia de tratamiento antibacteriano es indicativo de que el tratamiento es particularmente eficaz para eliminar las enterobacterias de la biopelícula.
Por tratamiento antibacteriano se entiende, en el contexto de la presente invención, tratamientos que interfieren con el metabolismo de las bacterias encaminados a matar o detener el crecimiento de las bacterias que forman parte de las biopelículas así como a tratamientos encaminados a solubilizar total o parcialmente la biopelícula para aumentar la accesibilidad de tratamientos bactericidas o bacteriostáticos convencionales a los microorganismos allí presentes, así como a los métodos encaminados a desprender la biopelícula de su soporte biótico o abiótico.
Métodos de tratamiento antibacteriano que pueden ser usados en el contexto de la presente invención incluyen, dependiendo del tipo de superficie a ser tratada, precipitación de plata coloidal, extirpación mediante láser y pulsos de campo eléctrico, limitación de nutrientes esenciales, cloración, destrucción mecánica, tratamiento con ozono, uso de bacteriófagos, péptidos antimicrobianos, inhibición de los mecanismos de interacción de los microorganismos dentro de la biopelícula (quórum-sensing) , inhibición de la colonización, modificación del la superficie para impedir su colonización mediante hidrofilización, nanoestructuración, introducción de cargas negativas, tratamiento con plasma, recubrimiento con antibióticos o antisépticos, incorporación de metales tóxicos, recubrimiento con microorganismos no patógenos y similares.
Preferiblemente, la determinación del número total de células se lleva a cabo mediante el uso de un agente intercalante de ADN capaz de detectar todas las células o mediante el uso de una sonda capaz de hibridar con todos los microorganismos del superreino Bacteria. Ejemplos de dichos agentes intercalantes y de sondas adecuados para la realización de la invención han sido descritos anteriormente. Preferiblemente, la determinación del número total de células se lleva a cabo mediante FISH o mediante citometría de flujo.
La invención se describe a continuación mediante los siguientes ejemplos que tienen un carácter ilustrativo y en ningún caso limitativo.
Ejemplos
Ejemplo 1
Diseño de las sondas de oligonucleótidos
El diseño de sondas para la detección de géneros comúnmente involucrados en la formación de la biopelícula se realizó basándose en las secuencias 16S ADNr de los diferentes géneros de Enterobacteriaceae.
La sonda KPN- 1 (5'- AAGGCGTTAAGGTTAATAA-3') fue diseñada para marcar principalmente la región 16S ADNr de las especies formadoras de biopelícula Klebsiella y Raoultella. Esta sonda fue diseñada a partir de las posiciones 434-452 del ADN que codifica la región 16S-RNA de K. pneumoniae y R. planticola respectivamente (número de acceso AF130982 y AF129443) .
La sonda ENT-1 (5'-CAGCAATTGACGTTAC-3') , se diseñó basándose en las posiciones 442-445 del ADN que codifica la región 16S-RNA del E. cloacae (número de acceso AJ251469) . El diseño de las sondas también se realizó teniendo en cuenta el programa ARB (Kumar, Y. et al., 2005, BMC Bioinformatics, 6:61) .
La sonda ERIC-1 (5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3') marca las secuencias intergénicas consenso repetitivas del género Enterobacteriaceae (Hulton, C.S.J. et al., 1991, Mol. Microbiol., 5:825-834) . Estas sondas fueron marcadas en su extremo 5' con un derivado del isotiocianato (CY3) o con isotiociananto de fluoresceína (FITC) a través de un enlace covalente, y purificadas con cromatografía líquida en fase inversa.
La sonda Kpn publicada previamente (Kempf, V.A.J., 2000, J. Clin. Microbiol. 38:830-838) (5'-CCTACACAC CAGCGTGCC-3') , específica para K. pneumoniae, está dirigida a la región 23.S RNA de esta bacteria. La sonda EUB_338 (5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3') , complementaria a la región 16S ARNr es especifica para el dominio bacteriano, fue usada como control positivo para probar la efectividad de hibridación (Amann, R.I. et al., 1995, Microbiol. Rev., 59:143-169) . Las sondas fueron sintetizadas por Transgenomic (UK) . Alternativamente, las muestras fueron marcadas con DAPI (4', 6'-diamino-2-fenilindol) que detecta el ADN de todas las bacterias y otros microorganismos.
Ejemplo 2
Control de la sonda y optimización de la rigurosidad de la hibridación
La efectividad de hibridación de las sondas de oligonucleótidos fue estimada por el seguimiento de la intensidad de fluorescencia de los cultivos puros usados como blanco. Toda la hibridación celular fue hecha a diferentes temperaturas con aumento en las concentraciones de formamida (desde 0 a 50% v/v, en aumentos del 10%) para determinar las condiciones de discriminación entre las células blanco y las no blanco para cada sonda. Las sondas específicas de especie y grupo fueron incubadas simultáneamente con la sonda EUB338.
Ejemplo 3
Hibridación in situ sobre filtros de membrana
Los cultivos celulares fueron seleccionados en fase logarítmica, centrifugados y resuspendidos en 0.5 ml de PBS, 30 μl de la suspensión celular fueron ajustados a 105- 107 células/cm2. Estas suspensiones fueron colocadas sobre filtros de policarbonato (47 mm de diámetro, con un tamaño de poro de 0.2 μm; Isopore GTTP, Millipore, Alemania) mediante filtración. Las células fueron permeabilizadas con diferentes concentraciones de lisozima (Sigma lisozima en solución buffer que contenía Tris-HC1 al 50 mM EDTA pH 8) . Se ensayaron distintas temperaturas y tiempos de incubación para optimizar la permeabilización celular. Las células fueron lavadas dos veces con 2 ml de PBS y deshidratadas usando series de etanol 70, 90 y 96% (v/v) durante 10 min a temperatura ambiente. Los filtros se secaron al aire quedando así preparados para la hibridación. Estos filtros pueden ser almacenados a 20ºC durante varias semanas sin cambios aparentes. Cada filtro fue cortado en ocho secciones y fueron colocados en portaobjetos de vidrio. Cada sección de los filtros puede ser usada con sondas por separado o combinadas. Los filtros fueron calentados con una solución de formamida 2XSSC (formamida al 70%, NaCl 0.3M y citrato sódico 0.03 M, pH 7) a 70ºC, 2 min. Las secciones de los filtros fueron cubiertas con 50 μl de buffer de hibridación (NaCl 0.9 M, y Tris-HC1 20 mM, pH 7) , y las sondas fluorescentes fueron añadidas a una concentración final de 8 ng . μl- 1 Posteriormente se incubaron los filtros a la temperatura apropiada en un horno de hibridación. Después de 12 h de incubación, los filtros se transfirieron a un vial precalentado que contenía 50 ml de solución de lavado (NaCl 0.9 M, SDS 0.05% y Tris-HC1 20 mM, pH 7) y se incubaron sin agitación durante 20 min. Los filtros se aclararon con agua destilada, se secaron al aire y se dispusieron con el medio de montaje Vectashield.
Ejemplo 4
Microscopía láser confocal y análisis de Imagen
La señal emitida por las sondas fluorescentes se detectó usando un microscopio confocal MRC-1024 (Bio-Rad, Hempel Hempstead, UK) . Las sondas marcadas con FITC se excitaron usando un láser Ar que emite a 488 nm, y la fluorescencia fue recuperada a través de un filtro 515/30 BP. La sonda marcada con HEX se excitó usando un láser He-Ne que emite a 543 nm. La fluorescencia fue recuperada usando un filtro 600/30 BP. Cuando las sondas marcadas con FITC y HEX fueron usadas en la misma muestra, la adquisición de imágenes fue realizada de forma secuencial. Los programas Lasersharp y Laserpix (Bio-Rad) fueron usados para el análisis de imagen.
Ejemplo 5
Análisis de viabilidad celular mediante citometría de flujo
Con el fin de obtener información sobre la viabilidad celular, se seleccionó ioduro de propidio (Sigma) como colorante de exclusión y se combinó con SYTO 13 (Molecular Probes) como colorante de ADN de supervivencia. Ambos colorantes se añadieron simultáneamente a concentraciones de 0.1 μg/ml de ioduro de propidio y 2.5 μl de SYTO 13 a una muestra de 1 ml y se incubaron durante 10 minutos a 37ºC para la tinción. Se usó un citómetro FACScalibur con un láser que emitía a 488 nm. Las muestras se analizaron a baja velocidad y se adquirieron los datos en modo de registro mediante la captación de 10000 sucesos (Gasol, J.M., et al., Apl. Environ. Microbiol., 65:4475-4483) . Las células con membranas dañadas fueron penetradas tanto por el colorante de exclusión, ioduro de propidio, como por el colorante SYTO 13.
Ejemplo 6
Condiciones para la optimización de la hibridación
Las condiciones optimas para la aplicación del FISH fueron determinadas sobre cepas formadoras de biopelícula (CFB) seleccionadas: Enterobacter cloacae E-022114 y 022119, Enterobacter aerogenes Bac, Raoultella planticola E-022116 y Klebsiella pneumoniae E-11927. Para aumentar la sensibilidad de la hibridación (por ejemplo, el porcentaje de células hibridadas en las células marcadas con DAPI) de las CFB analizadas, es necesario considerar que se pueden obtener señales débiles cuando hay un número pequeño o una baja disponibilidad de las secuencias blanco o debido a una mala permeabilidad de las células fijadas (FH1) .
Ejemplo 7
Especificidad de la sonda
La especificidad de las sondas de oligonucleótidos ERIC-1, ENT-1 y KPN-1 para la CFB blanco fue evaluada mediante la realización de ensayos FISH, con cultivos puros de CFB aisladas de la industria papelera y con cepas de referencia, bajo las condiciones descritas en la tabla 2.
TABLA 2 Optimización de hibridación sobre células completas usando las distintas sondas sobre bacterias formadoras de biopelículas 
En el caso de las sondas Kpn y EUB338, los ensayos fueron llevados a cabo según ha sido descrito por otros autores (Kempf, V.A.J. et al., 2000, J. Clin. Microbiol., 38:830-838 y Peters, R.P.H. et al., 2006, J. Clin. Microbiol., 44:11-123) . Los conteos celulares obtenidos de los experimentos realizados se observan en la tabla 3. Los resultados obtenidos con la sonda ERIC-1 muestran que las cinco cepas de CFB fueron marcadas con éxito con esta sonda específica para el grupo Enterobacteriaceae. La máxima efectividad de FISH fue observada con la cepa de K. pneumoniae 11927 (92±1.2%) , y la más baja con la cepa de E. aerogenes Bac (82±1.4%) .
No se pudo diseñar una sonda específica para Enterobacter sp. en las secuencias 16S ARNr. En realidad, la sonda ENT-1 es complementaria a Pantoea sp. y a Citrobacter koseri, como se evidenció con el programa de alineamiento de secuencias de tipo local BLAST. Los resultados (tabla 3) muestran que la máxima efectividad de FISH fue obtenida con E. cloacae E-022114 y 022119. Aunque una baja sensibilidad de hibridación (86±0.4%) fue detectada con la cepa de E. aerogenes Bac. Las cepas de R. planticola E-022116 y K. pneumoniae E-11927 no fueron marcadas con ENT-1 y ninguna otra de las cepas de enterobacterias fueron marcadas con esta sonda.
Se obtuvieron resultados satisfactorios cuando se utilizó la sonda KPN-1 en experimentos FISH para detectar los géneros Klebsiella y Raoultella. Las cepas K. pneumoniae 11927, K. oxytoca DSZ-2 y R. planticola E-022116 mostraron una alta señal de intensidad de fluorescencia relacionada con una alta efectividad de hibridación (tabla 3) . Sin embargo, la fluorescencia con esta sonda fue también observada con E. aerogenes Bac. Además de esto, la especificidad de la sonda KPN-1 fue establecida con los resultados obtenidos con las otras enterobacterias ensayadas y ninguna de estas cepas fue marcada con la KPN-1 en los experimentos FISH. Finalmente, la sonda de género específica Kpn hibrida únicamente con K. pneumoniae 11927 y con K. oxytoca DSZ-2.
TABLA 3 Detección de bacterias usando distintas sondas sobre filtros de membrana 
La alta sensibilidad obtenida con las sonda ENT-1 y KPN-1 puede ser debida a que uno de los criterios que se utilizó para elegir las secuencias que forman parte de la sonda fue la accesibilidad de dicha secuencia dentro de la estructura de ARNr. Así, las hibridaciones llevadas a cabo con la sonda KPN-1 demostraron su utilidad para detectar bacterias pertenecientes al grupo Klebsiella/Raoultella, aunque se observó fluorescencia también con E. aerogenes Bac. Sin embargo, la hibridación cruzada de la sonda KPN-1 con E. aerogenes no es sorprendente considerando que los estudios filogenéticos basados en la secuencia de ADNr 16S, groE y gyrB han propuesto transferir E. aerogenes al género Klebsiella (Dauga, C., 2002, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 52:531-547) . Aunque la sonda ENT-1, mostró una menor especificidad, esto no supone un inconveniente puesto que Enterobacter, Pantoea y, ocasionalmente, Citrobacer y Serratia se han descrito como formadores primarios de biopelículas ya que aparecen frecuentemente en el suelo, en madera sana y en putrefacción en plantas.
La distinción entre los microorganismos pertenecientes al género Klebsiella y Raoultella fue posible gracias al uso combinado de las sondas KPN-1 y Kpn. Además, el uso combinado de ENT-1 y KPN-1 permitió la identificación de Enterobacter aerogenes.
Como complemento a la optimización de la temperatura de FISH, se evaluó el efecto de los diferentes permeabilizantes, tales como formamida y lisozima (Tabla 2) . La concentración óptima de lisozima fue diferente entre especies debido a la diferencia en la resistencia de la pared celular. Las cepas 022116, E-11927 y E. aerogenes Bac proporcionaron los mejores resultados con respecto a la tasa de detección con 0.1 mg/ml de lisozima mientras que las otras cepas fueron permeabilizadas adecuadamente con 1 mg/ml. Para cuantificar una posible pérdida de membrana se realizaron incubaciones con lisozima a temperatura ambiente a tiempos de 0, 30 y 60 min. No se detectaron pérdidas celulares significativas comparando los conteos con DAPI y FISH (con la sonda Eub338) en las muestras después de 60 min de tratamiento con la lisozima. Las muestras que no fueron tratadas con lisozima presentaron bajas señales de intensidad de fluorescencia y de efectividad de hibridación FISH.
En términos de efectividad de hibridación de FISH (con EUB_338 y con las sondas específicas) los resultados mostraron un incremento de 48±3% en las muestras sin permeabilizar a 92±5% tras 60 min de permeabilización con la enzima. La máxima efectividad de hibridación fue observada cuando los cultivos celulares fueron seleccionados en fase de crecimiento exponencial. Las temperaturas óptimas de hibridación para cada cepa y sonda se encuentran en la tabla 2. Los tiempos de hibridación varían desde 2 h para EUB338, a 16 h para las sondas específicas.
Ejemplo 8
Ensayo de productos que inhiben la formación de biopelícula
Se determinó el efecto de 3 tipos de compuestos reguladores de la formación de biopelículas sobre la viabilidad celular de enterobacterias:
• Agentes biocidas (por ejemplo Butrol 1009, Butrol 1072, Butrol 1130 y Buitrol 881) que atacan directamente a los microorganismos inhibiendo su metabolismo o secuestrando metales necesarios para el metabolismo.
• Dispersantes (por ejemplo Busperse) que actúan promoviendo la liberación de la biopelícula de su soporte, lo que hace a los microorganismos más vulnerables frente a la acción de compuestos biocidas o antisépticos.
• Enzimas (por ejemplo Buzyme) que actúan impidiendo la formación de las biopelículas, digiriendo los polisacáridos presentes en la biopelícula y, en algunos casos, dañando directamente a las células en la biopelícula. Este tratamiento por tanto, afecta la estructura celular, de modo que sólo las células en las que el tratamiento no tiene efecto serán las analizadas en posteriores experimentos de FISH.
La estructura química y el modo de acción de los distintos compuestos se recogen en la tabla 4.
TABLA 4 Compuestos y enzimas inhibidores de la formación de biopelícula aplicados sobre bacterias formadoras de biopelículas 
Cultivos puros de las bacterias seleccionadas en 250 ml de medio peptona salino se incubaron durante una noche a 37ºC en un agitador. Posteriormente, alícuotas de 100 ml de cada cultivo incubado se mezclaron con el producto estudiado. Los efectos de 100 ppm de los distintos compuestos se analizaron a tiempos distintos (0 h, 2 h, 8 h y 24 h) mediante citometría de flujo.
Los estudios demostraron que no todos los compuestos usados en el control de biopelículas son igualmente eficientes. Así, Butrol 1009 y Butrol 1072 fueron los compuestos más efectivos contra las enterobacterias, puesto que permitieron obtener un 80% de células muertas tras 8 horas de tratamiento, mientras que Butrol 1130 no fue tan eficiente a la dosis empleada y Butrol 881 sólo fue eficiente sobre E. cloacae tras 24 h de tratamiento. Por otro lado, el efecto de los dispersantes dependió de la cepa estudiada. Así, Busperse fue muy eficiente sobre E. cloacae tras 2 horas de tratamiento, moderadamente eficiente sobre K. pneumoniae a tiempos cortos (2 h) pero muy eficiente tras 24 h, mientras que no mostró eficacia ninguna sobre E. aerogenes.
Por otro lado, el tratamiento con proteasas (Buzyme) fue muy eficiente sobre K. penumoniae, resultando en más del 85% de bacterias muertas tras 2 h de tratamiento, eficiente sobre E. cloacae, produciendo más del 75% de bacterias muertas tras 2 h y moderadamente eficiente sobre E. aerogenes. En este último caso, solamente se observaron 80% de células muertas tras 2 h, aunque se observó un recrecimiento que llegó a alcanzar el 40% de las células vivas. Tras el tratamiento enzimático de las muestras de biopelículas, no se detectaron enterobacterias mediante FISH.
Ejemplo 9
Identificación de bacterias formadoras de biopelículas
Se analizaron mediante FISH muestras de biopelículas obtenidas de una máquina de producción de papel usando las sondas ERIC-1, Kpn, KPN-1 y ENT-1. El experimento se repitió 3 veces y, en cada repetición, se llevaron a cabo las hibridaciones con al menos tres triplicados. El análisis mediante FISH con la sonda ERIC-1 sobre la población bacteriana de muestras de biopelículas demostró que las enterobacterias formaban un alto porcentaje de los microorganismos totales (Figura 1) . Los resultados mostraron que un 45% de las células implicadas en la formación de biopelículas eran Enterobacterias. Se comprobó asimismo la especificidad de las sondas específicas de grupo mediante la identificación en las muestras de bacterias compatibles con Klebsiella sp. (14-16%) y Enterobacter sp. o Pantoea sp. (12%) (Tabla 5) . Además, tras el tratamiento enzimático de las muestras de biopelículas, no se pudieron detectar enterobacterias mediante FISH, lo que demostró la efectividad del tratamiento bactericida sobre la población bacteriana, así como la utilidad del método de identificación.
TABLA 5 Detección de bacterias usando las distintas sondas en las muestras de biopelículas de una industria papelera 
