• la extensión final se realizó a 72°C durante 15 minutos. La temperatura de anillamiento varió entre 51°C y 55°C, debido a la variabilidad interespecífica que exhiben las secuencias manejadas para los distintos langostinos.
Los productos obtenidos en la PCR se procesaron, con vista a detectar la presencia de ADN, mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 2, 5% en tampón TAE 1X (Tris-acetate-EDTA) con 0.5 μg/ml del bromuro de etidio (Merck, Darmstadt, Germany) . Se cargaron en el gel 5 μL de cada muestra mezclados con 3-4 μl de tampón de carga. Las condiciones de electroforesis fueron: 1 hora a 100 V. La visualización de los fragmentos amplificados, o amplicones, se realizó en un transiluminador de luz ultravioleta (254 nm) .
La determinación del tamaño de los productos de amplificación producidos mediante la PCR se llevó a cabo en el mismo gel, mediante la comparación con el marcador de peso EZ Load 100 bp Molecular Ruler (Sigma) , analizado en paralelo con las muestras. Este patrón de peso presenta 10 fragmentos de ADN con los siguientes tamaños: 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 y 100 pb.
Por otro lado, los productos de PCR amplificados fueron purificados mediante el kit ExoSAP-IT (GE Healthcare - Amersham Biosciences) con el fin de eliminar componentes de la reacción (primers, dNTPs, sales, etc) que pudieran interferir en la reacción de secuenciación.
La secuenciación directa de los amplicones purificados se realizó mediante el método comercial BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) . Para llevar a cabo las reacciones de secuenciación, se emplearon los mismos cebadores de la PCR, realizándose la secuenciación en ambos sentidos de las hebras de ADN con el fin de poder comparar ambas hebras y poder así tener mayor información acerca de las secuencias de las muestras de langostinos. Una vez finalizada la secuenciación se añadieron 4 μL de formamida/EDTA-dextran blue (5/1) y las muestras se desnaturalizaron 2 min a 90°C. Las reacciones de secuenciación se analizaron en un secuenciador capilar ABI 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems) .
Las secuencias obtenidas fueron analizadas por medio de cromatografía. Los cromatogramas de las muestras secuenciadas se visualizaron mediante el programa bioinformático CHROMAS Versión 1.45 (Technelysium Pty, Tewantin, Australia) , que permite editar las secuencias nucleotídicas y copiarlas en formato FASTA. En el estudio filogenético se incluyeron las siguientes secuencias del gen 16S rRNA depositadas en las bases de datos publicas (Genbank) : Penaeus monodon (AF217843) , Marsupenaeus japonicus (NC_007010) , Marsupenaeus japonicus (AP006346) , Litopenaeus stylirostris (AY046913) , Penaeus stylirostris (AJ297970) , Penaeus vannamei (AJ132780) , Litopenaeus vannamei (AY046914) , Penaeus setiferus (AJ297971) , Farfantepenaeus californiensis (AY046912) y Penaeus notialis (X84350) .
Las secuencias en formato FASTA se alinearon con el programa ClustalX 1.83 (Thompson y col., 1997) . Posteriormente se realizó el análisis filogenético de las secuencias alineadas. Los árboles filogenéticos se obtuvieron empleando el algoritmo de Neighbor-Joining aplicando el modelo de dos parámetros de Kimura en el programa MEGA 3.1 (Kumar y col., 2004) . Para evaluar el soporte estadístico de la topología obtenida se realizó un Bootstrap resampling test con 1.000 replicaciones.
La asignación de genotipos se basó en la relación filogenética con respecto a muestras utilizadas como referencia, cuyos fenotipos fueron previamente determinados mediante análisis morfológico de los caracteres externos.
Basándose en el alineamiento de todas las secuencias obtenidas mediante la amplificación con los cebadores que amplifican un fragmento de 966 bp, se llevó a cabo el diseño de unos nuevos cebadores con el fin de obtener unos cebadores en una zona conservada, y que amplificasen un fragmento de ADN más corto. Este fragmento más corto es de gran utilidad para la identificación de los productos procesados, ya que al estar sometidos a altas temperaturas, el ADN está parcialmente degradado.
Con los nuevos cebadores diseñados, 16S CRUC3 (SEQ ID N° 3) y 16S CRUC4 (SEQ ID N° 4) se consiguió amplificar el ADN extraído de la totalidad de las muestras utilizadas para este estudio. Con estas amplificaciones se llevó a cabo la posterior digestión con las enzimas de restricción utilizadas en esta invención.
Los nuevos cebadores específicos para langostinos de la superfamilia Penaeoidea (langostinos peneidos) amplifican un fragmento de aproximadamente entre 515 bp y 535 bp del gen 16S rRNA y parte del tRNAVal, ambos pertenecientes al ADN mitocondrial.
Ejemplo 3
Obtención de patrones de bandas característicos
Una vez purificado el ADN según se expone en el ejemplo 1, se procedió a amplificar con los nuevos cebadores específicos 16S CRUC3 y 16S CRUC4, la zona del ADN mitocondrial de interés.
Utilizando los cebadores específicos 16S CRUC3 y 16S CRUC4 se amplificó mediante PCR el ADN de Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus Litopenaeus vannamei, Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Farfantepenaeus aztecus, Farfantepenaeus californiensis, Fenneropennaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis, Fenneropenaeus sp. 29, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Parapenaeus longirostris, Metapenaeus sp. 21, Metapenaeus sp. 9, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea.
Para realizar la amplificación se suplementó la mezcla de reacción con MgCl2 a una concentración final de 2.0 mM, se desnaturalizó a 94°C durante 90 segundos, y se sometió a 35 ciclos (94°C durante 20 segundos, 51-55°C durante 20 s, 72°C durante 30 segundos) , con una extensión final a 72°C durante 15 minutos.
La temperatura de anillamiento varió entre 51°C y 55°C, debido a la variabilidad interespecífica que exhiben las secuencias manejadas para los langostinos peneidos.
La selección de los enzimas de restricción se llevó a cabo mediante la búsqueda de lugares de restricción en las secuencias de ADN que habían sido alineadas y editadas en formato FASTA. Mediante el programa bioinformático Restrictionmapper versión 3 se seleccionaron las enzimas que permitían la diferenciación de las especies comerciales de langostinos. Las enzimas de restricción seleccionadas fueron AluI, TaqI y HinfI.
Los fragmentos amplificados se sometieron a digestión por separado con cada uno de los enzimas de restricción AluI, TaqI y HinfI. Las condiciones de las reacciones fueron:
1. 2 μl de la enzima de restricción 2. 2 μl de buffer especifico de la enzima 3. 8 μl de amplicón (producto de PCR) y 4. 8 μl de agua de PCR, para un volumen total de 20 μl. Las muestras se agitaron y centrifugaron unos segundos y se incubaron durante 1-2 horas a 37°C.
La visualización de los fragmentos de restricción se llevó a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa al 2.5% o bien mediante electroforesis en geles analíticos de poliacrilamida (15% ExcelGel Homogeneous SDS-PAGE, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) , siguiendo el protocolo que indica el método. Los geles fueron procesados a 15°C en una cubeta de electroforesis Multiphor II equipado con un criostato MultiTemp III, utilizando los ánodos y cátodos comerciales (ExcelGel Buffer Strips, Amersham Biosciences) . Las condiciones en que se llevó a cabo la electroforesis fueron de 600 V/30 mA/30 W durante 140 min. Los fragmentos fueron visualizados según el protocolo de tinción de plata (Amersham Biosciences) .
Los resultados obtenidos quedan reflejados en la tabla 1.
TABLA 1 Fragmentos que resultan del corte con los enzimas de restricción del ADN amplificado con los cebadores 16SCRUF, 16SCRUR