METHOD OF IDENTIFICATION OF SPECIES OF THE PENAEOIDEA SUPERFAMILY BY MEANS OF DNA ANALYSIS

Abstract

The present invention relates to a method of identification of species of the superfamily Penaeoidea by means of DNA analysis which comprises: A. Extraction and isolation of the DNA from a biological or food sample. B. Subsequent amplification by means of use of primers of any isolated nucleotide sequence and the complementary thereof, of the DNA isolated in the earlier stage, characterised in being comprised between nucleotid sequences with at least 90% identity with SEQ ID N 1 and SEQ ID N 2C. Digestion of theamplified nucleotid sequences by means of the restriction enzymes Alul, Taql or Hinfl D. Detection of the fragments obtained in previous stage E. Identification of the species by comparison of the fragments detected in the previous stage with the characteristic fragments pattern for each species.

Description

ES-2319009_A1

Método de identificación de especies de la superfamilia Penaeoidea mediante análisis de ADN.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a un método de identificación de especies de la superfamilia Penaeoidea mediante análisis de ADN.

Estado de la técnica

Diversos países, entre ellos los países integrantes de la Unión Europea, destacan entre sus objetivos prioritarios lograr la transparencia en los mercados pesqueros y ofrecer al consumidor información fiable sobre los productos que va a consumir. Este hecho resulta fundamental en un mercado cada vez más globalizado donde se pueden encontrar varias especies distintas bajo una misma denominación. Este es el caso concreto de las especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea. La incorrecta catalogación, debida a que, entre otras cosas, especies de origen y características muy diversas no son adecuadamente identificadas, puede ocasionar problemas de sustituciones que afectarían tanto al etiquetado como a la actividad comercial del sector y al propio consumidor.

En el mercado existe una notable heterogeneidad de las especies y géneros que constituyen los principales "nombres comerciales" de langostinos peneidos. Cabe destacar que bajo los términos "langostino banana", "langostino blanco" o "langostino tigre" se encuadran distintas especies de peneidos e incluso distintos géneros. Otro ejemplo es la cada vez más frecuente comercialización de gamba pelada donde se engloban diversas especies de langostinos cuya diferenciación en base a criterios morfológicos es complicada.

Estos ejemplos ilustran la importancia de la correcta identificación de estas especies marinas tanto de origen pesquero como procedentes de la acuicultura.

Sin embargo, la situación actual es de carencia de métodos fiables de identificación de especies de crustáceos pertenecientes al Orden Decapoda, que engloba a las principales especies de langostinos y gambones.

Se han realizado con anterioridad estudios filogenéticos con el objetivo de relacionar distintas especies dentro de la superfamilia Penaeoidea, en los que se ha trabajado con la clonación, secuenciación y comparación de secuencias nucleotídicas del ADN. En concreto, en el artículo de nombre "Sequence and Conservation of a RNA and tRNA^Val Mitocondrial Gene Fragment from Penaeus californiensis and Comparison with Penaus vannamei and Penaeus stylirostris" de Luis Enrique Gutiérrez-Millán et al (Marine Biotechnology 4, 392-398, 2002) se realizó un estudio donde se utilizaba una secuencia nucleotídica de 1.38 Kb que abarcaba un fragmento de los genes mitocondriales 16S rRNA y 12S rRNA y la secuencia completa del gen mitocondrial tRNA^Val para el estudio de las relaciones filogenéticas entre las especies Penaeus californiensis, Penaeus vannamei y Penaeus stylirostris. Sin embargo, este estudio no aporta un método para la identificación de las citadas especies.

En el artículo "Species identification of Five Penaeid Shrimps using PCR-RFLP and SSCP analyses of 16S Ribosomal DNA" de Bavornlak Khamnamtong et al, (Journal of Biochemistr y and Molecular Biology Vol 38 No. 4 July 2005, pp 491-499) se cita un método para la identificación de especies de peneideos en base al polimorfismo del gen 16S rRNA en el cual abarcaban únicamente las especies P. monodon, P. semisulcatus, Litopenaeus vannamei, Fenneropenaeus merguiensis y Marsupenaeus japonicus. En dicho método se describe el proceso de obtención de nuevos cebadores específicos por amplificación de las regiones del ADN correspondientes a los genes COI - COII y 16S rRNA mediante PCR utilizando cebadores universales y el posterior alineamiento de las secuencias obtenidas, con el fin de encontrar secuencias conservadas en las distintas especies de peneidos que pudieran servir como cebadores.

Con los nuevos cebadores obtenidos, 16S 312 Forward y 16S 312 Reverse, amplificaron una secuencia de 312 pb del 16S rDNA. Los productos amplificados fueron sometidos a digestión por separado con los enzimas de restricción AluI, SspI y VspI y posteriormente a electroforesis. Se obtuvieron patrones de bandas para la identificación de las especies P. monodon, P. semisulcatus, L. vannamei, F. merguiensis y M. japonicus. Sin embargo, en el caso de algunas de estas especies (P. semisulcatus, M. japonicus y L. vannamei) , no lograron dilucidar de qué especie se trataba ya que presentaban los mismos patrones de corte.

A la vista de los intentos anteriormente realizados, podemos observar cómo aún persiste la necesidad de encontrar un sistema que proporcione soluciones a los problemas planteados a la hora de realizar una correcta identificación de especies pertenecientes a la superfamilia Peneaoidea.

Descripción de la invención

De acuerdo con la presente invención, los autores proporcionan un método de identificación de langostinos capaz de identificar al menos 24 especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea mediante análisis de ADN previamente aislado.

En la presente invención se logra la correcta identificación de especies comerciales por medio de un método fiable, que cumple con una serie de requisitos entre los que cabe destacar los siguientes: que permite la identificación de un gran número de especies dentro de la misma familia, resulta fiable, se minimiza el margen de confusión, siendo a la vez sencillo y reproducible. Por otro lado, este método utiliza marcadores susceptibles de ser seguidos durante toda la vida útil del producto, con el fin de garantizar su trazabilidad.

En la presente invención se identifican las secuencias nucleotídicas que van a ser utilizadas en los ensayos de identificación de especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea y se desarrollan los cebadores que resultan necesarios para la implantación de sistemas de trazabilidad.

La presente invención versa sobre un método de identificación de especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea cuyos aspectos fundamentales son:

• La extracción y aislamiento del ADN a partir de una muestra biológica o alimentaria,

• La posterior amplificación mediante el uso de cebadores de cualquier secuencia nucleotídica aislada y su complementaria, del ADN aislado en el paso anterior, caracterizada por estar comprendida entre secuencias nucleotídicas con al menos un 90% de identidad con SEQ ID N°1 y SEQ ID N°2

• La digestión de la secuencia nucleotídica amplificada mediante los enzimas de restricción AluI, TaqI o HinfI

• La detección de los fragmentos de restricción obtenidos en el paso anterior

• La identificación de las especies por comparación de los fragmentos detectados en el paso anterior con el patrón de fragmentos de restricción característico de cada especie.

En una realización preferida la secuencia amplificada en la presente invención está comprendida entre SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 2.

De aquí en adelante nos referiremos a las secuencias nucleotídicas aisladas susceptibles de ser amplificadas mediante el uso de cebadores y que se encuentran comprendidas entre las SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 2 o entre secuencias con un grado de identidad de al menos el 90% con SEQ ID n° 1 y SEQ ID N° 2, y a sus secuencias complementarias, como secuencias nucleotídicas de la invención.

En una realización preferida, los cebadores utilizados para la amplificación de las secuencias nucleotídicas de la invención son un cebador directo que comprende la SEQ ID N° 3 (16S CRUC3) , y un cebador reverso que comprende la SEQ ID N° 4 (16S CRUC4) .

Estos cebadores permiten la amplificación de todas las especies que habitualmente se pueden encontrar en el mercado y de aquí en adelante nos referiremos a ellos como cebadores de la invención.

En otra realización preferida las secuencias nucleotídicas amplificadas se seleccionan de cualquiera de las secuencias SEQ ID N° 7 a SEQ ID N° 33.

Otra realización preferida de la invención es la amplificación de las secuencias nucleotídicas de la invención mediante PCR. En la PCR, la temperatura de anillamiento varía entre 51°C y 55°C, debido a la variabilidad interespecífica que presentan las secuencias manejadas para los distintos langostinos.

En otra realización preferida la detección e identificación de los fragmentos se realiza mediante electroforesis.

En otra realización preferida de la invención la identificación de las especies se realiza por comparación de los patrones de tamaño de fragmentos de restricción obtenidos, con los reflejados en la tabla 1.

En una realización preferida de la invención el presente método permite identificar al menos cualquiera de las especies de la siguiente lista: Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus, Litopenaeus vannamei, Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Farfantepenaeus aztecus, Farfantepenaeus californiensis, Fenneropenaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis, Fenneropenaeus sp. 29, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Parapenaeus longirostris, Metapenaeus sp. 21, Metapenaeus sp. 9, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea.

Otras especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea susceptibles de ser identificadas mediante el método de la presente invención quedarían dentro de las realizaciones de la presente invención.

La enzima de restricción AluI, mediante la digestión de las secuencias nucleotídicas de la invención, genera patrones de bandas que permiten diferenciar al menos cualquiera de las especies citadas a continuación: Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus, Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Fenneropenaeus indicus, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Metapenaeus sp. 21, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea.

Por otro lado, para los casos en los que, mediante los ensayos realizados según el método de la presente invención utilizando como enzima de restricción AluI, persistan dudas sobre la correcta identificación, existen ensayos complementarios mediante la utilización de los enzimas de restricción TaqI o de HinfI, que permiten confirmar la especie a la que pertenece la muestra biológica o alimentaria a evaluar.

En concreto,

• la utilización de la enzima de restricción TaqI en el método de la presente invención, permite la identificación de al menos cualquiera de las siguientes especies: Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus aztecus y Farfantepenaeus californiensis.

• la utilización de las enzimas de restricción TaqI y HinfI mediante ensayos independientes realizados según el método de la presente invención, permite la identificación de al menos cualquiera de las siguientes especies: Litopenaus vannamei, Fenneropenaeus merguiensis y Fenneropenaeus sp. 29, las cuales son claramente diferenciables.

• la utilización de la enzima de restricción HinfI en el método de la presente invención, permite la identificación de al menos cualquiera de las siguientes especies: Metapenaeus sp. 9 y Parapenaeus longirostris.

Los enzimas de restricción utilizados en la presente invención evitan zonas de corte que presentan variabilidad intraespecífica, lo cual contribuye a minimizar el margen de confusión entre distintas especies.

Las secuencias nucleotídicas de la invención están caracterizadas por presentar tamaños variables en especies muy próximas. El tamaño que dichas secuencias amplificadas presentan, por un lado facilita su amplificación y por otro lado permite el análisis e identificación en productos procesados donde el ADN se encuentra parcialmente degradado. Preferiblemente este tamaño se encuentra entre 515 y 535 pb aproximadamente.

En este documento se entiende por "secuencia nucleotídica" cualquier polímero de nucleótidos compuesto por dos o más subunidades que son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, unidos entre sí por puentes fosfodiéster. Las "secuencias nucleotídicas" incluyen ácido desoxirribonucleico (ADN) , ácido ribonucleico (ARN) , oligonucleótidos, y fragmentos generados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , o por otros métodos que incluyen pero no se limita a ligamiento, escisión, acción de endonucleasas y acción de exonucleasas.

Por "nucleótido" se entiende una unidad monomérica de ADN o ARN que contiene un resto de azúcar (pentosa) , un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. Las cuatro bases del ADN son adenina ("A") , guanina ("G") , citosina ("C") y timina ("T") . Las cuatro bases del ARN son A, G, C y uracilo ("U") .

Por "secuencia nucleotídica aislada" se entiende una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Dicha molécula de ácido nucleico puede separarse del ADN genómico de una célula, puede producirse usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por PCR, clonación, etc.) , o puede sintetizarse químicamente. La molécula de ácido nucleico aislada puede obtenerse de su fuente natural como gen completo o una parte del mismo capaz de formar un híbrido estable con ese gen. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria.

Por "enzimas de restricción" se entiende enzimas endonucleasas que cortan los enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia que reconocen (diana de restricción) . Las dianas de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases y son palindrómicas. Estas enzimas permiten cortar ADN bicatenario rompiendo 2 enlaces fosfodiéster en la doble cadena y dando lugar a dos extremos del ADN, que pueden ser Romos o Cohesivos/ escalonados.

Por "PCR", Reacción en Cadena de la Polimerasa, se entiende una técnica de biología molecular que permite amplificar un fragmento de ADN, gracias a la acción de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternados, para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

En este documento se entiende por "electroforesis" una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) sobre la base de su tamaño molecular, conformación, el tamaño de los poros del gel o la magnitud de la carga neta de la molécula y carga eléctrica. Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida. Las moléculas cargadas son forzadas a ir a través de una matriz debido a un flujo de corriente eléctrica. Al exponer la mezcla de moléculas a un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando a través del gel, por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.

Los fragmentos generados a partir de una molécula de ADN por corte con enzimas de restricción pueden ser separados en base a su tamaño utilizando un gel de electroforesis. Los fragmentos de ADN migrarán de un modo inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño o peso molecular.

El movimiento de los fragmentos de ADN genera un "patrón de bandas", donde cada banda corresponde a un fragmento de un tamaño particular. El tamaño de cada fragmento puede ser determinado utilizando un marcador de ADN cuyos fragmentos tienen pesos moleculares conocidos. Este marcador sirve de control y migrará paralelo a las bandas de ADN que deseamos analizar.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Exposición detallada de modos de realización

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del método de detección anteriormente descrito.

Ejemplo 1

Extracción, Purificación y Cuantificación de DNA de langostinos

El ADN de los langostinos fue extraído a partir de porciones de 250 mg de músculo esquelético de cada una de las muestras investigadas, mediante el método comercial (DNeasy Tissue Isolation kit, QIAGEN, Darmstadt, Germany) , que consta de dos fases:

A) Fase de lisis celular

Se cortó el músculo en pequeños pedazos para que la tisis fuera más eficiente. Se pesaron 250 mg. de muestra en un tubo microcentrífuga de 1, 5 ml y se le añadieron 180 μl de buffer ATL y 20 μl de proteinasa K. Se agitó vigorosamente el tubo de microcentrífuga (Mixtub Raypa) y se incubó en el termomezclador (Thermomixer Comfort, Eppendorf) a 55°C durante 1-3 horas o bien toda la noche para que la tisis fuera eficiente. En algunos casos se añadieron 4 μl de RNasa (100 mg/ml) y se agitó vigorosamente.

Después se mantuvieron las muestras durante 2 minutos a temperatura ambiente (18-20°C) , se agitaron durante 15 segundos y se les añadió 200 μl de buffer AL a cada muestra. Se agitó cuidadosamente y se incubó a 70°C durante 10 minutos. A continuación se añadieron 200 μl de etanol (96-100%) en la muestra y se agitó suavemente.

B) Fase de purificación del ADN

Se transfirieron las muestras que habían completado la tisis a una membrana (DNasy Mini Spin column) en un tubo colector de 2 ml. La muestra se centrifugó en microcentrífuga (modelo 5415 D, Eppendorf) a 8.000 rpm durante 1 minuto. Se transfirió el DNasy Mini Spin column a otro tubo de colector de 2 ml, y se añadieron 500 μl de buffer AW1. Se sometió a centrifugación a 8.000 rpm durante 1 minuto y se descartaron el tubo colector y su contenido. Se repitió el paso anterior añadiendo 500 μl de buffer AW2 y se centrifugó a 13.000 rpm durante 3 minutos.

Finalmente, el DNeasy Mini Spin Column fue transferido a un tubo colector de 1, 5-2 ml, y se añadieron 100-200 μl de buffer AE directamente sobre la membrana DNeasy. Se incubó a temperatura ambiente durante 1 minuto y después se centrifugó a 8.000 rpm durante 1 minuto. Se descartó el DNeasy Mini Spin column y se recuperó el extracto del ADN purificado obtenido.

El ADN extraído fue cuantificado mediante fluorimetría utilizando el método de Downs y Wilfinger (Downs y Wilfinger, 1983) y un fluorímetro LS 50 (Perkin Elmer- fluorometer, Applied Biosystems, Foster City, CA) mediante la determinación de la fluorescencia obtenida al mezclar un volumen conocido del extracto del ADN con el reactivo Hoechst 33258 (The Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) , compuesto por 1 bis-benzimida, la cual se intercala entre las moléculas de ADN. La longitud de onda de excitación de esta molécula está en el ultravioleta próximo (350 nm) mientras que la longitud de onda de emisión se encuentra en la región azul (450 nm) . La sensibilidad del ensayo con el Hoechst 33258 (Sigma) es de 5 ng/ml aproximadamente. Las medidas se llevaron a cabo en un fluorímetro LS 50 (Perkin Elmer) .

Para llevar a cabo la medida de la fluorescencia se preparó cada vez 100 ml de disolución fresca de Hoechst de la siguiente manera:

• 10 ml de TNE 10X

• 10 μl de Hoechst (1 mg/ml)

• 90 ml de agua Milli-Q

La composición del TNE 10X es la siguiente:

• 12.11 g de Tris; (hidroximetil) aminometano (Merck)

• 3.72 g de EDTA (Calbiochem)

• 116.89 g de cloruro sódico (Merck)

• Hasta 800 ml de agua Milli-Q

• pH=7.4; ajustar con HCI (Merck) concentrado.

Se prepararon soluciones control y estándar. Como solución control, dependiendo de la concentración final que estimamos obtener en las muestras, se prepararon dos tipos de soluciones de ADN de calf-thymus (Sigma) , una de bajo rango, con rangos de concentración entre 10 y 150 ng/ml y otra de rango más elevado, con unas concentraciones entre 100 y 1000 ng/ml.

Para calcular la concentración de ADN de cada muestra, se tomaron 4 μl de cada muestra de ADN extraído, se añadió el tampón TNE Hoechst 33258 (NaCl 0.2 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.4) para un volumen total de 2000 μl en la cubeta. Se mezclaron la disolución de Hoechst-TNE y el ADN a fin de medir la intensidad de cada muestra.

Ejemplo 2

Diseño de cebadores específicos y amplificación de las regiones de interés

En el presente ejemplo se describe cómo se procedió al diseño de cebadores en una zona conservada del gen 16S rRNA.

Se estudiaron 70 secuencias de ADN del gen 16S rRNA y tRNA^Val del ADN mitocondrial, que comprenden 20 especies de la superfamilia Penaeoidea de interés comercial en el sector alimentario, dentro de las cuales se encuentran las siguientes especies: Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Litopenaeus vannamei, Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Fenneropenaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis, Fenneropenaeus sp. 29, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Parapenaeus longirostris, Metapenaeus sp. 21, Metapenaeus sp. 9, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea. Todas estas especies pertenecen a la superfamilia Penaeoidea, que a su vez pertenece al Orden Decapoda.

Una vez purificado el ADN según se expone en el ejemplo 1, se procedió a amplificar la zona del ADN mitocondrial de interés. Para ello se buscaron oligonucleotidos en las regiones 16S rRNA, tRNA^Val y 12S rRNA.

Los cebadores fueron diseñados en base a los alineamientos de secuencias completas publicadas del orden Decapoda, buscando zonas conservadas del gen 16S rRNA.

Las secuencias que se alinearon para el diseño de los cebadores se mencionan a continuación, y están depositadas en la base de datos del GenBank: Penaeus monodon (NC_002184) , Penaeus monodon (AF217843) , Marsupenaeus japonicus (AP006346) , Marsupenaeus japonicus mitochondrion (NC_007010) , Callinectes sapidus (NC_006281) , Callinectes sapidus (AY363392) , Panulirus japonicus (NC_004251) , Panulirus japonicus (AB071201) , Portunus trituberculatus (NC_005037) Portunus trituberculatus (AB093006) , Pagurus longicarpus (NC_003058) , Pagurus longicarpus (AF150756) .

Se seleccionaron los oligonucleotidos 16S CRUF (SEQ ID N° 5) y 16S CRUR (SEQ ID N° 6) como cebadores, que caían en las regiones 16S rRNA y tRNA^Val, respectivamente. Los cebadores fueron diseñados en base a estos oligonucleótidos mediante el programa PrimerExpress de Applied Biosystems.

Para la amplificación mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de las secuencias de ADN reconocidas por los cebadores 16S CRUF y 16S CRUR, que amplifican un fragmento de 966 bp, las condiciones seleccionadas fueron:

• se suplementó la mezcla de reacción con MgCl₂ a una concentración final de 2.0 mM.

• la desnaturalización inicial se realizó a 94°C durante 90 segundos

• se sometió a 35 ciclos (94°C durante 20 segundos, 51-55°C durante 20 s, 72°C durante 30 segundos)

• la extensión final se realizó a 72°C durante 15 minutos.

La temperatura de anillamiento varió entre 51°C y 55°C, debido a la variabilidad interespecífica que exhiben las secuencias manejadas para los distintos langostinos.

Los productos obtenidos en la PCR se procesaron, con vista a detectar la presencia de ADN, mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 2, 5% en tampón TAE 1X (Tris-acetate-EDTA) con 0.5 μg/ml del bromuro de etidio (Merck, Darmstadt, Germany) . Se cargaron en el gel 5 μL de cada muestra mezclados con 3-4 μl de tampón de carga. Las condiciones de electroforesis fueron: 1 hora a 100 V. La visualización de los fragmentos amplificados, o amplicones, se realizó en un transiluminador de luz ultravioleta (254 nm) .

La determinación del tamaño de los productos de amplificación producidos mediante la PCR se llevó a cabo en el mismo gel, mediante la comparación con el marcador de peso EZ Load 100 bp Molecular Ruler (Sigma) , analizado en paralelo con las muestras. Este patrón de peso presenta 10 fragmentos de ADN con los siguientes tamaños: 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 y 100 pb.

Por otro lado, los productos de PCR amplificados fueron purificados mediante el kit ExoSAP-IT (GE Healthcare - Amersham Biosciences) con el fin de eliminar componentes de la reacción (primers, dNTPs, sales, etc) que pudieran interferir en la reacción de secuenciación.

La secuenciación directa de los amplicones purificados se realizó mediante el método comercial BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) . Para llevar a cabo las reacciones de secuenciación, se emplearon los mismos cebadores de la PCR, realizándose la secuenciación en ambos sentidos de las hebras de ADN con el fin de poder comparar ambas hebras y poder así tener mayor información acerca de las secuencias de las muestras de langostinos. Una vez finalizada la secuenciación se añadieron 4 μL de formamida/EDTA-dextran blue (5/1) y las muestras se desnaturalizaron 2 min a 90°C. Las reacciones de secuenciación se analizaron en un secuenciador capilar ABI 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems) .

Las secuencias obtenidas fueron analizadas por medio de cromatografía. Los cromatogramas de las muestras secuenciadas se visualizaron mediante el programa bioinformático CHROMAS Versión 1.45 (Technelysium Pty, Tewantin, Australia) , que permite editar las secuencias nucleotídicas y copiarlas en formato FASTA. En el estudio filogenético se incluyeron las siguientes secuencias del gen 16S rRNA depositadas en las bases de datos publicas (Genbank) : Penaeus monodon (AF217843) , Marsupenaeus japonicus (NC_007010) , Marsupenaeus japonicus (AP006346) , Litopenaeus stylirostris (AY046913) , Penaeus stylirostris (AJ297970) , Penaeus vannamei (AJ132780) , Litopenaeus vannamei (AY046914) , Penaeus setiferus (AJ297971) , Farfantepenaeus californiensis (AY046912) y Penaeus notialis (X84350) .

Las secuencias en formato FASTA se alinearon con el programa ClustalX 1.83 (Thompson y col., 1997) . Posteriormente se realizó el análisis filogenético de las secuencias alineadas. Los árboles filogenéticos se obtuvieron empleando el algoritmo de Neighbor-Joining aplicando el modelo de dos parámetros de Kimura en el programa MEGA 3.1 (Kumar y col., 2004) . Para evaluar el soporte estadístico de la topología obtenida se realizó un Bootstrap resampling test con 1.000 replicaciones.

La asignación de genotipos se basó en la relación filogenética con respecto a muestras utilizadas como referencia, cuyos fenotipos fueron previamente determinados mediante análisis morfológico de los caracteres externos.

Basándose en el alineamiento de todas las secuencias obtenidas mediante la amplificación con los cebadores que amplifican un fragmento de 966 bp, se llevó a cabo el diseño de unos nuevos cebadores con el fin de obtener unos cebadores en una zona conservada, y que amplificasen un fragmento de ADN más corto. Este fragmento más corto es de gran utilidad para la identificación de los productos procesados, ya que al estar sometidos a altas temperaturas, el ADN está parcialmente degradado.

Con los nuevos cebadores diseñados, 16S CRUC3 (SEQ ID N° 3) y 16S CRUC4 (SEQ ID N° 4) se consiguió amplificar el ADN extraído de la totalidad de las muestras utilizadas para este estudio. Con estas amplificaciones se llevó a cabo la posterior digestión con las enzimas de restricción utilizadas en esta invención.

Los nuevos cebadores específicos para langostinos de la superfamilia Penaeoidea (langostinos peneidos) amplifican un fragmento de aproximadamente entre 515 bp y 535 bp del gen 16S rRNA y parte del tRNA^Val, ambos pertenecientes al ADN mitocondrial.

Ejemplo 3

Obtención de patrones de bandas característicos

Una vez purificado el ADN según se expone en el ejemplo 1, se procedió a amplificar con los nuevos cebadores específicos 16S CRUC3 y 16S CRUC4, la zona del ADN mitocondrial de interés.

Utilizando los cebadores específicos 16S CRUC3 y 16S CRUC4 se amplificó mediante PCR el ADN de Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus Litopenaeus vannamei, Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Farfantepenaeus aztecus, Farfantepenaeus californiensis, Fenneropennaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis, Fenneropenaeus sp. 29, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Parapenaeus longirostris, Metapenaeus sp. 21, Metapenaeus sp. 9, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea.

Para realizar la amplificación se suplementó la mezcla de reacción con MgCl₂ a una concentración final de 2.0 mM, se desnaturalizó a 94°C durante 90 segundos, y se sometió a 35 ciclos (94°C durante 20 segundos, 51-55°C durante 20 s, 72°C durante 30 segundos) , con una extensión final a 72°C durante 15 minutos.

La temperatura de anillamiento varió entre 51°C y 55°C, debido a la variabilidad interespecífica que exhiben las secuencias manejadas para los langostinos peneidos.

La selección de los enzimas de restricción se llevó a cabo mediante la búsqueda de lugares de restricción en las secuencias de ADN que habían sido alineadas y editadas en formato FASTA. Mediante el programa bioinformático Restrictionmapper versión 3 se seleccionaron las enzimas que permitían la diferenciación de las especies comerciales de langostinos. Las enzimas de restricción seleccionadas fueron AluI, TaqI y HinfI.

Los fragmentos amplificados se sometieron a digestión por separado con cada uno de los enzimas de restricción AluI, TaqI y HinfI. Las condiciones de las reacciones fueron:

1. 2 μl de la enzima de restricción

2. 2 μl de buffer especifico de la enzima

3. 8 μl de amplicón (producto de PCR) y

4. 8 μl de agua de PCR, para un volumen total de 20 μl.

Las muestras se agitaron y centrifugaron unos segundos y se incubaron durante 1-2 horas a 37°C.

La visualización de los fragmentos de restricción se llevó a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa al 2.5% o bien mediante electroforesis en geles analíticos de poliacrilamida (15% ExcelGel Homogeneous SDS-PAGE, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) , siguiendo el protocolo que indica el método. Los geles fueron procesados a 15°C en una cubeta de electroforesis Multiphor II equipado con un criostato MultiTemp III, utilizando los ánodos y cátodos comerciales (ExcelGel Buffer Strips, Amersham Biosciences) . Las condiciones en que se llevó a cabo la electroforesis fueron de 600 V/30 mA/30 W durante 140 min. Los fragmentos fueron visualizados según el protocolo de tinción de plata (Amersham Biosciences) .

Los resultados obtenidos quedan reflejados en la tabla 1.

TABLA 1 Fragmentos que resultan del corte con los enzimas de restricción del ADN amplificado con los cebadores 16SCRUF, 16SCRUR

ES-2319009_B2

Método de identificación de especies de la superfamilia Penaeoidea mediante análisis de ADN.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a un método de identificación de especies de la superfamilia Penaeoidea mediante análisis de ADN.

Estado de la técnica

Diversos países, entre ellos los países integrantes de la Unión Europea, destacan entre sus objetivos prioritarios lograr la transparencia en los mercados pesqueros y ofrecer al consumidor información fiable sobre los productos que va a consumir. Este hecho resulta fundamental en un mercado cada vez más globalizado donde se pueden encontrar varias especies distintas bajo una misma denominación. Este es el caso concreto de las especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea. La incorrecta catalogación, debida a que, entre otras cosas, especies de origen y características muy diversas no son adecuadamente identificadas, puede ocasionar problemas de sustituciones que afectarían tanto al etiquetado como a la actividad comercial del sector y al propio consumidor.

En el mercado existe una notable heterogeneidad de las especies y géneros que constituyen los principales "nombres comerciales" de langostinos peneidos. Cabe destacar que bajo los términos "langostino banana", "langostino blanco" o "langostino tigre" se encuadran distintas especies de peneidos e incluso distintos géneros. Otro ejemplo es la cada vez más frecuente comercialización de gamba pelada donde se engloban diversas especies de langostinos cuya diferenciación en base a criterios morfológicos es complicada.

Estos ejemplos ilustran la importancia de la correcta identificación de estas especies marinas tanto de origen pesquero como procedentes de la acuicultura.

Sin embargo, la situación actual es de carencia de métodos fiables de identificación de especies de crustáceos pertenecientes al Orden Decapoda, que engloba a las principales especies de langostinos y gambones.

Se han realizado con anterioridad estudios filogenéticos con el objetivo de relacionar distintas especies dentro de la superfamilia Penaeoidea, en los que se ha trabajado con la clonación, secuenciación y comparación de secuencias nucleotídicas del ADN. En concreto, en el artículo de nombre "Sequence and Conservation of a RNA and tRNA^Val Mitocondrial Gene Fragment from Penaeus californiensis and Comparison with Penaus vannamei and Penaeus stylirostris" de Luis Enrique Gutiérrez-Millán et al (Marine Biotechnology 4, 392-398, 2002) se realizó un estudio donde se utilizaba una secuencia nucleotídica de 1.38 Kb que abarcaba un fragmento de los genes mitocondriales 16S rRNA y 12S rRNA y la secuencia completa del gen mitocondrial tRNA^Val para el estudio de las relaciones filogenéticas entre las especies Penaeus californiensis, Penaeus vannamei y Penaeus stylirostris. Sin embargo, este estudio no aporta un método para la identificación de las citadas especies.

En el artículo "Species identification of Five Penaeid Shrimps using PCR-RFLP and SSCP analyses of 16S Ribosomal DNA" de Bavornlak Khamnamtong et al, (Journal of Biochemistr y and Molecular Biology Vol 38 No. 4 July 2005, pp 491-499) se cita un método para la identificación de especies de peneideos en base al polimorfismo del gen 16S rRNA en el cual abarcaban únicamente las especies P. monodon, P. semisulcatus, Litopenaeus vannamei, Fenneropenaeus merguiensis y Marsupenaeus japonicus. En dicho método se describe el proceso de obtención de nuevos cebadores específicos por amplificación de las regiones del ADN correspondientes a los genes COI - COII y 16S rRNA mediante PCR utilizando cebadores universales y el posterior alineamiento de las secuencias obtenidas, con el fin de encontrar secuencias conservadas en las distintas especies de peneidos que pudieran servir como cebadores.

Con los nuevos cebadores obtenidos, 16S 312 Forward y 16S 312 Reverse, amplificaron una secuencia de 312 pb del 16S rDNA. Los productos amplificados fueron sometidos a digestión por separado con los enzimas de restricción AluI, SspI y VspI y posteriormente a electroforesis. Se obtuvieron patrones de bandas para la identificación de las especies P. monodon, P. semisulcatus, L. vannamei, F. merguiensis y M. japonicus. Sin embargo, en el caso de algunas de estas especies (P. semisulcatus, M. japonicus y L. vannamei) , no lograron dilucidar de qué especie se trataba ya que presentaban los mismos patrones de corte.

A la vista de los intentos anteriormente realizados, podemos observar cómo aún persiste la necesidad de encontrar un sistema que proporcione soluciones a los problemas planteados a la hora de realizar una correcta identificación de especies pertenecientes a la superfamilia Peneaoidea.

Descripción de la invención

De acuerdo con la presente invención, los autores proporcionan un método de identificación de langostinos capaz de identificar al menos 24 especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea mediante análisis de ADN previamente aislado.

En la presente invención se logra la correcta identificación de especies comerciales por medio de un método fiable, que cumple con una serie de requisitos entre los que cabe destacar los siguientes: que permite la identificación de un gran número de especies dentro de la misma familia, resulta fiable, se minimiza el margen de confusión, siendo a la vez sencillo y reproducible. Por otro lado, este método utiliza marcadores susceptibles de ser seguidos durante toda la vida útil del producto, con el fin de garantizar su trazabilidad.

En la presente invención se identifican las secuencias nucleotídicas que van a ser utilizadas en los ensayos de identificación de especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea y se desarrollan los cebadores que resultan necesarios para la implantación de sistemas de trazabilidad.

La presente invención versa sobre un método de identificación de especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea cuyos aspectos fundamentales son:

• La extracción y aislamiento del ADN a partir de una muestra biológica o alimentaria,

• La posterior amplificación mediante el uso de cebadores de cualquier secuencia nucleotídica aislada y su complementaria, del ADN aislado en el paso anterior, caracterizada por estar comprendida entre secuencias nucleotídicas con al menos un 90% de identidad con SEQ ID Nº1 y SEQ ID Nº2

• La digestión de la secuencia nucleotídica amplificada mediante los enzimas de restricción AluI, TaqI o HinfI

• La detección de los fragmentos de restricción obtenidos en el paso anterior

• La identificación de las especies por comparación de los fragmentos detectados en el paso anterior con el patrón de fragmentos de restricción característico de cada especie.

En una realización preferida la secuencia amplificada en la presente invención está comprendida entre SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2.

De aquí en adelante nos referiremos a las secuencias nucleotídicas aisladas susceptibles de ser amplificadas mediante el uso de cebadores y que se encuentran comprendidas entre las SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2 o entre secuencias con un grado de identidad de al menos el 90% con SEQ ID nº 1 y SEQ ID Nº 2, y a sus secuencias complementarias, como secuencias nucleotídicas de la invención.

En una realización preferida, los cebadores utilizados para la amplificación de las secuencias nucleotídicas de la invención son un cebador directo que comprende la SEQ ID Nº 3 (16S CRUC3) , y un cebador reverso que comprende la SEQ ID Nº 4 (16S CRUC4) .

Estos cebadores permiten la amplificación de todas las especies que habitualmente se pueden encontrar en el mercado y de aquí en adelante nos referiremos a ellos como cebadores de la invención.

En otra realización preferida las secuencias nucleotídicas amplificadas se seleccionan de cualquiera de las secuencias SEQ ID Nº 7 a SEQ ID Nº 33.

Otra realización preferida de la invención es la amplificación de las secuencias nucleotídicas de la invención mediante PCR. En la PCR, la temperatura de anillamiento varía entre 51ºC y 55ºC, debido a la variabilidad interespecífica que presentan las secuencias manejadas para los distintos langostinos.

En otra realización preferida la detección e identificación de los fragmentos se realiza mediante electroforesis.

En otra realización preferida de la invención la identificación de las especies se realiza por comparación de los patrones de tamaño de fragmentos de restricción obtenidos, con los reflejados en la tabla 1.

En una realización preferida de la invención el presente método permite identificar al menos cualquiera de las especies de la siguiente lista: Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus, Litopenaeus vannamei, Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Farfantepenaeus aztecus, Farfantepenaeus californiensis, Fenneropenaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis, Fenneropenaeus sp. 29, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Parapenaeus longirostris, Metapenaeus sp. 21, Metapenaeus sp. 9, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea.

Otras especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea susceptibles de ser identificadas mediante el método de la presente invención quedarían dentro de las realizaciones de la presente invención.

La enzima de restricción AluI, mediante la digestión de las secuencias nucleotídicas de la invención, genera patrones de bandas que permiten diferenciar al menos cualquiera de las especies citadas a continuación: Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus, Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Fenneropenaeus indicus, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Metapenaeus sp. 21, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea.

Por otro lado, para los casos en los que, mediante los ensayos realizados según el método de la presente invención utilizando como enzima de restricción AluI, persistan dudas sobre la correcta identificación, existen ensayos complementarios mediante la utilización de los enzimas de restricción TaqI o de HinfI, que permiten confirmar la especie a la que pertenece la muestra biológica o alimentaria a evaluar.

En concreto,

• la utilización de la enzima de restricción TaqI en el método de la presente invención, permite la identificación de al menos cualquiera de las siguientes especies: Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus aztecus y Farfantepenaeus californiensis.

• la utilización de las enzimas de restricción TaqI y HinfI mediante ensayos independientes realizados según el método de la presente invención, permite la identificación de al menos cualquiera de las siguientes especies: Litopenaus vannamei, Fenneropenaeus merguiensis y Fenneropenaeus sp. 29, las cuales son claramente diferenciables.

• la utilización de la enzima de restricción HinfI en el método de la presente invención, permite la identificación de al menos cualquiera de las siguientes especies: Metapenaeus sp. 9 y Parapenaeus longirostris.

Los enzimas de restricción utilizados en la presente invención evitan zonas de corte que presentan variabilidad intraespecífica, lo cual contribuye a minimizar el margen de confusión entre distintas especies.

Las secuencias nucleotídicas de la invención están caracterizadas por presentar tamaños variables en especies muy próximas. El tamaño que dichas secuencias amplificadas presentan, por un lado facilita su amplificación y por otro lado permite el análisis e identificación en productos procesados donde el ADN se encuentra parcialmente degradado. Preferiblemente este tamaño se encuentra entre 515 y 535 pb aproximadamente.

En este documento se entiende por "secuencia nucleotídica" cualquier polímero de nucleótidos compuesto por dos o más subunidades que son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, unidos entre sí por puentes fosfodiéster. Las "secuencias nucleotídicas" incluyen ácido desoxirribonucleico (ADN) , ácido ribonucleico (ARN) , oligonucleótidos, y fragmentos generados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , o por otros métodos que incluyen pero no se limita a ligamiento, escisión, acción de endonucleasas y acción de exonucleasas.

Por "nucleótido" se entiende una unidad monomérica de ADN o ARN que contiene un resto de azúcar (pentosa) , un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. Las cuatro bases del ADN son adenina ("A") , guanina ("G") , citosina ("C") y timina ("T") . Las cuatro bases del ARN son A, G, C y uracilo ("U") .

Por "secuencia nucleotídica aislada" se entiende una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Dicha molécula de ácido nucleico puede separarse del ADN genómico de una célula, puede producirse usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por PCR, clonación, etc.) , o puede sintetizarse químicamente. La molécula de ácido nucleico aislada puede obtenerse de su fuente natural como gen completo o una parte del mismo capaz de formar un híbrido estable con ese gen. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria.

Por "enzimas de restricción" se entiende enzimas endonucleasas que cortan los enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia que reconocen (diana de restricción) . Las dianas de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases y son palindrómicas. Estas enzimas permiten cortar ADN bicatenario rompiendo 2 enlaces fosfodiéster en la doble cadena y dando lugar a dos extremos del ADN, que pueden ser Romos o Cohesivos/ escalonados.

Por "PCR", Reacción en Cadena de la Polimerasa, se entiende una técnica de biología molecular que permite amplificar un fragmento de ADN, gracias a la acción de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternados, para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

En este documento se entiende por "electroforesis" una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) sobre la base de su tamaño molecular, conformación, el tamaño de los poros del gel o la magnitud de la carga neta de la molécula y carga eléctrica. Para la separación se usa un gel de agarosa o poliacrilamida. Las moléculas cargadas son forzadas a ir a través de una matriz debido a un flujo de corriente eléctrica. Al exponer la mezcla de moléculas a un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando a través del gel, por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.

Los fragmentos generados a partir de una molécula de ADN por corte con enzimas de restricción pueden ser separados en base a su tamaño utilizando un gel de electroforesis. Los fragmentos de ADN migrarán de un modo inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño o peso molecular.

El movimiento de los fragmentos de ADN genera un "patrón de bandas", donde cada banda corresponde a un fragmento de un tamaño particular. El tamaño de cada fragmento puede ser determinado utilizando un marcador de ADN cuyos fragmentos tienen pesos moleculares conocidos. Este marcador sirve de control y migrará paralelo a las bandas de ADN que deseamos analizar.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Exposición detallada de modos de realización

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del método de detección anteriormente descrito.

Ejemplo 1

Extracción, Purificación y Cuantificación de DNA de langostinos

El ADN de los langostinos fue extraído a partir de porciones de 250 mg de músculo esquelético de cada una de las muestras investigadas, mediante el método comercial (DNeasy Tissue Isolation kit, QIAGEN, Darmstadt, Germany) , que consta de dos fases:

A) Fase de lisis celular

Se cortó el músculo en pequeños pedazos para que la tisis fuera más eficiente. Se pesaron 250 mg. de muestra en un tubo microcentrífuga de 1, 5 ml y se le añadieron 180 μl de buffer ATL y 20 μl de proteinasa K. Se agitó vigorosamente el tubo de microcentrífuga (Mixtub Raypa) y se incubó en el termomezclador (Thermomixer Comfort, Eppendorf) a 55ºC durante 1-3 horas o bien toda la noche para que la tisis fuera eficiente. En algunos casos se añadieron 4 μl de RNasa (100 mg/ml) y se agitó vigorosamente.

Después se mantuvieron las muestras durante 2 minutos a temperatura ambiente (18-20ºC) , se agitaron durante 15 segundos y se les añadió 200 μl de buffer AL a cada muestra. Se agitó cuidadosamente y se incubó a 70ºC durante 10 minutos. A continuación se añadieron 200 μl de etanol (96-100%) en la muestra y se agitó suavemente.

B) Fase de purificación del ADN

Se transfirieron las muestras que habían completado la tisis a una membrana (DNasy Mini Spin column) en un tubo colector de 2 ml. La muestra se centrifugó en microcentrífuga (modelo 5415 D, Eppendorf) a 8.000 rpm durante 1 minuto. Se transfirió el DNasy Mini Spin column a otro tubo de colector de 2 ml, y se añadieron 500 μl de buffer AW1. Se sometió a centrifugación a 8.000 rpm durante 1 minuto y se descartaron el tubo colector y su contenido. Se repitió el paso anterior añadiendo 500 μl de buffer AW2 y se centrifugó a 13.000 rpm durante 3 minutos.

Finalmente, el DNeasy Mini Spin Column fue transferido a un tubo colector de 1, 5-2 ml, y se añadieron 100-200 μl de buffer AE directamente sobre la membrana DNeasy. Se incubó a temperatura ambiente durante 1 minuto y después se centrifugó a 8.000 rpm durante 1 minuto. Se descartó el DNeasy Mini Spin column y se recuperó el extracto del ADN purificado obtenido.

El ADN extraído fue cuantificado mediante fluorimetría utilizando el método de Downs y Wilfinger (Downs y Wilfinger, 1983) y un fluorímetro LS 50 (Perkin Elmer- fluorometer, Applied Biosystems, Foster City, CA) mediante la determinación de la fluorescencia obtenida al mezclar un volumen conocido del extracto del ADN con el reactivo Hoechst 33258 (The Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) , compuesto por 1 bis-benzimida, la cual se intercala entre las moléculas de ADN. La longitud de onda de excitación de esta molécula está en el ultravioleta próximo (350 nm) mientras que la longitud de onda de emisión se encuentra en la región azul (450 nm) . La sensibilidad del ensayo con el Hoechst 33258 (Sigma) es de 5 ng/ml aproximadamente. Las medidas se llevaron a cabo en un fluorímetro LS 50 (Perkin Elmer) .

Para llevar a cabo la medida de la fluorescencia se preparó cada vez 100 ml de disolución fresca de Hoechst de la siguiente manera:

• 10 ml de TNE 10X

• 10 μl de Hoechst (1 mg/ml)

• 90 ml de agua Milli-Q

La composición del TNE 10X es la siguiente:

• 12.11 g de Tris; (hidroximetil) aminometano (Merck)

• 3.72 g de EDTA (Calbiochem)

• 116.89 g de cloruro sódico (Merck)

• Hasta 800 ml de agua Milli-Q

• pH=7.4; ajustar con HCI (Merck) concentrado.

Se prepararon soluciones control y estándar. Como solución control, dependiendo de la concentración final que estimamos obtener en las muestras, se prepararon dos tipos de soluciones de ADN de calf-thymus (Sigma) , una de bajo rango, con rangos de concentración entre 10 y 150 ng/ml y otra de rango más elevado, con unas concentraciones entre 100 y 1000 ng/ml.

Para calcular la concentración de ADN de cada muestra, se tomaron 4 μl de cada muestra de ADN extraído, se añadió el tampón TNE Hoechst 33258 (NaCl 0.2 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.4) para un volumen total de 2000 μl en la cubeta. Se mezclaron la disolución de Hoechst-TNE y el ADN a fin de medir la intensidad de cada muestra.

Ejemplo 2

Diseño de cebadores específicos y amplificación de las regiones de interés

En el presente ejemplo se describe cómo se procedió al diseño de cebadores en una zona conservada del gen 16S rRNA.

Se estudiaron 70 secuencias de ADN del gen 16S rRNA y tRNA^Val del ADN mitocondrial, que comprenden 20 especies de la superfamilia Penaeoidea de interés comercial en el sector alimentario, dentro de las cuales se encuentran las siguientes especies: Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Litopenaeus vannamei, Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Fenneropenaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis, Fenneropenaeus sp. 29, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Parapenaeus longirostris, Metapenaeus sp. 21, Metapenaeus sp. 9, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea. Todas estas especies pertenecen a la superfamilia Penaeoidea, que a su vez pertenece al Orden Decapoda.

Una vez purificado el ADN según se expone en el ejemplo 1, se procedió a amplificar la zona del ADN mitocondrial de interés. Para ello se buscaron oligonucleotidos en las regiones 16S rRNA, tRNA^Val y 12S rRNA.

Los cebadores fueron diseñados en base a los alineamientos de secuencias completas publicadas del orden Decapoda, buscando zonas conservadas del gen 16S rRNA.

Las secuencias que se alinearon para el diseño de los cebadores se mencionan a continuación, y están depositadas en la base de datos del GenBank: Penaeus monodon (NC_002184) , Penaeus monodon (AF217843) , Marsupenaeus japonicus (AP006346) , Marsupenaeus japonicus mitochondrion (NC_007010) , Callinectes sapidus (NC_006281) , Callinectes sapidus (AY363392) , Panulirus japonicus (NC_004251) , Panulirus japonicus (AB071201) , Portunus trituberculatus (NC_005037) Portunus trituberculatus (AB093006) , Pagurus longicarpus (NC_003058) , Pagurus longicarpus (AF150756) .

Se seleccionaron los oligonucleotidos 16S CRUF (SEQ ID Nº 5) y 16S CRUR (SEQ ID Nº 6) como cebadores, que caían en las regiones 16S rRNA y tRNA^Val, respectivamente. Los cebadores fueron diseñados en base a estos oligonucleótidos mediante el programa PrimerExpress de Applied Biosystems.

Para la amplificación mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de las secuencias de ADN reconocidas por los cebadores 16S CRUF y 16S CRUR, que amplifican un fragmento de 966 bp, las condiciones seleccionadas fueron:

• se suplementó la mezcla de reacción con MgCl₂ a una concentración final de 2.0 mM.

• la desnaturalización inicial se realizó a 94ºC durante 90 segundos

• se sometió a 35 ciclos (94ºC durante 20 segundos, 51-55ºC durante 20 s, 72ºC durante 30 segundos)

• la extensión final se realizó a 72ºC durante 15 minutos.

La temperatura de anillamiento varió entre 51ºC y 55ºC, debido a la variabilidad interespecífica que exhiben las secuencias manejadas para los distintos langostinos.

Los productos obtenidos en la PCR se procesaron, con vista a detectar la presencia de ADN, mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 2, 5% en tampón TAE 1X (Tris-acetate-EDTA) con 0.5 μg/ml del bromuro de etidio (Merck, Darmstadt, Germany) . Se cargaron en el gel 5 μL de cada muestra mezclados con 3-4 μl de tampón de carga. Las condiciones de electroforesis fueron: 1 hora a 100 V. La visualización de los fragmentos amplificados, o amplicones, se realizó en un transiluminador de luz ultravioleta (254 nm) .

La determinación del tamaño de los productos de amplificación producidos mediante la PCR se llevó a cabo en el mismo gel, mediante la comparación con el marcador de peso EZ Load 100 bp Molecular Ruler (Sigma) , analizado en paralelo con las muestras. Este patrón de peso presenta 10 fragmentos de ADN con los siguientes tamaños: 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 y 100 pb.

Por otro lado, los productos de PCR amplificados fueron purificados mediante el kit ExoSAP-IT (GE Healthcare - Amersham Biosciences) con el fin de eliminar componentes de la reacción (primers, dNTPs, sales, etc) que pudieran interferir en la reacción de secuenciación.

La secuenciación directa de los amplicones purificados se realizó mediante el método comercial BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) . Para llevar a cabo las reacciones de secuenciación, se emplearon los mismos cebadores de la PCR, realizándose la secuenciación en ambos sentidos de las hebras de ADN con el fin de poder comparar ambas hebras y poder así tener mayor información acerca de las secuencias de las muestras de langostinos. Una vez finalizada la secuenciación se añadieron 4 μL de formamida/EDTA-dextran blue (5/1) y las muestras se desnaturalizaron 2 min a 90ºC. Las reacciones de secuenciación se analizaron en un secuenciador capilar ABI 3730XL DNA Analyzer (Applied Biosystems) .

Las secuencias obtenidas fueron analizadas por medio de cromatografía. Los cromatogramas de las muestras secuenciadas se visualizaron mediante el programa bioinformático CHROMAS Versión 1.45 (Technelysium Pty, Tewantin, Australia) , que permite editar las secuencias nucleotídicas y copiarlas en formato FASTA. En el estudio filogenético se incluyeron las siguientes secuencias del gen 16S rRNA depositadas en las bases de datos publicas (Genbank) : Penaeus monodon (AF217843) , Marsupenaeus japonicus (NC_007010) , Marsupenaeus japonicus (AP006346) , Litopenaeus stylirostris (AY046913) , Penaeus stylirostris (AJ297970) , Penaeus vannamei (AJ132780) , Litopenaeus vannamei (AY046914) , Penaeus setiferus (AJ297971) , Farfantepenaeus californiensis (AY046912) y Penaeus notialis (X84350) .

Las secuencias en formato FASTA se alinearon con el programa ClustalX 1.83 (Thompson y col., 1997) . Posteriormente se realizó el análisis filogenético de las secuencias alineadas. Los árboles filogenéticos se obtuvieron empleando el algoritmo de Neighbor-Joining aplicando el modelo de dos parámetros de Kimura en el programa MEGA 3.1 (Kumar y col., 2004) . Para evaluar el soporte estadístico de la topología obtenida se realizó un Bootstrap resampling test con 1.000 replicaciones.

La asignación de genotipos se basó en la relación filogenética con respecto a muestras utilizadas como referencia, cuyos fenotipos fueron previamente determinados mediante análisis morfológico de los caracteres externos.

Basándose en el alineamiento de todas las secuencias obtenidas mediante la amplificación con los cebadores que amplifican un fragmento de 966 bp, se llevó a cabo el diseño de unos nuevos cebadores con el fin de obtener unos cebadores en una zona conservada, y que amplificasen un fragmento de ADN más corto. Este fragmento más corto es de gran utilidad para la identificación de los productos procesados, ya que al estar sometidos a altas temperaturas, el ADN está parcialmente degradado.

Con los nuevos cebadores diseñados, 16S CRUC3 (SEQ ID Nº 3) y 16S CRUC4 (SEQ ID Nº 4) se consiguió amplificar el ADN extraído de la totalidad de las muestras utilizadas para este estudio. Con estas amplificaciones se llevó a cabo la posterior digestión con las enzimas de restricción utilizadas en esta invención.

Los nuevos cebadores específicos para langostinos de la superfamilia Penaeoidea (langostinos peneidos) amplifican un fragmento de aproximadamente entre 515 bp y 535 bp del gen 16S rRNA y parte del tRNA^Val, ambos pertenecientes al ADN mitocondrial.

Ejemplo 3

Obtención de patrones de bandas característicos

Una vez purificado el ADN según se expone en el ejemplo 1, se procedió a amplificar con los nuevos cebadores específicos 16S CRUC3 y 16S CRUC4, la zona del ADN mitocondrial de interés.

Utilizando los cebadores específicos 16S CRUC3 y 16S CRUC4 se amplificó mediante PCR el ADN de Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus Litopenaeus vannamei, Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Farfantepenaeus aztecus, Farfantepenaeus californiensis, Fenneropennaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis, Fenneropenaeus sp. 29, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Parapenaeus longirostris, Metapenaeus sp. 21, Metapenaeus sp. 9, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea.

Para realizar la amplificación se suplementó la mezcla de reacción con MgCl₂ a una concentración final de 2.0 mM, se desnaturalizó a 94ºC durante 90 segundos, y se sometió a 35 ciclos (94ºC durante 20 segundos, 51-55ºC durante 20 s, 72ºC durante 30 segundos) , con una extensión final a 72ºC durante 15 minutos.

La temperatura de anillamiento varió entre 51ºC y 55ºC, debido a la variabilidad interespecífica que exhiben las secuencias manejadas para los langostinos peneidos.

La selección de los enzimas de restricción se llevó a cabo mediante la búsqueda de lugares de restricción en las secuencias de ADN que habían sido alineadas y editadas en formato FASTA. Mediante el programa bioinformático Restrictionmapper versión 3 se seleccionaron las enzimas que permitían la diferenciación de las especies comerciales de langostinos. Las enzimas de restricción seleccionadas fueron AluI, TaqI y HinfI.

Los fragmentos amplificados se sometieron a digestión por separado con cada uno de los enzimas de restricción AluI, TaqI y HinfI. Las condiciones de las reacciones fueron:

1. 2 μl de la enzima de restricción

2. 2 μl de buffer especifico de la enzima

3. 8 μl de amplicón (producto de PCR) y

4. 8 μl de agua de PCR, para un volumen total de 20 μl.

Las muestras se agitaron y centrifugaron unos segundos y se incubaron durante 1-2 horas a 37ºC.

La visualización de los fragmentos de restricción se llevó a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa al 2.5% o bien mediante electroforesis en geles analíticos de poliacrilamida (15% ExcelGel Homogeneous SDS-PAGE, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) , siguiendo el protocolo que indica el método. Los geles fueron procesados a 15ºC en una cubeta de electroforesis Multiphor II equipado con un criostato MultiTemp III, utilizando los ánodos y cátodos comerciales (ExcelGel Buffer Strips, Amersham Biosciences) . Las condiciones en que se llevó a cabo la electroforesis fueron de 600 V/30 mA/30 W durante 140 min. Los fragmentos fueron visualizados según el protocolo de tinción de plata (Amersham Biosciences) .

Los resultados obtenidos quedan reflejados en la tabla 1.

TABLA 1 Fragmentos que resultan del corte con los enzimas de restricción del ADN amplificado con los cebadores 16SCRUF, 16SCRUR

Claims

ES-2319009_A1

1. Método de identificación de especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea que comprende:

A. Extracción y aislamiento del ADN a partir de una muestra biológica o alimentaria.

B. La posterior amplificación mediante el uso de cebadores de cualquier secuencia nucleotídica aislada y su complementaria, del ADN aislado en el paso anterior, caracterizada por estar comprendida entre secuencias nucleotídicas con al menos un 90% de identidad con SEQ ID N°1 y SEQ ID N°2.

C. Digestión de la secuencia nucleotídica amplificada mediante los enzimas de restricción AluI, TaqI o HinfI.

D. Detección de los fragmentos obtenidos en el paso anterior.

E. Identificación de las especies por comparación de los fragmentos detectados en el paso anterior con el patrón de fragmentos característico de cada especie.

2. Método según la reivindicación anterior donde la secuencia amplificada en el paso B está comprendida entre SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 2.

3. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la amplificación se realiza utilizando un cebador directo que comprende la SEQ ID N° 3 (16S CRUC3) , y un cebador reverso que comprende la SEQ ID N° 4 (16S CRUC4) .

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la secuencia amplificada se selecciona de cualquiera de las secuencias SEQ ID N° 7 a SEQ ID N° 33.

5. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la amplificación se realiza mediante PCR.

6. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la detección e identificación de los fragmentos se realiza mediante electroforesis.

7. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la identificación de las especies se realiza por comparación del patrón de fragmentos obtenidos con los reflejados en la tabla 1.

8. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde las especies identificadas se seleccionan de la lista que comprende: Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus, Litopenaeus vannamei, Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Farfantepenaeus aztecus, Farfantepenaeus callforniensis, Fenneropennaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis, Fenneropenaeus sp. 29, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Parapenaeus longirostris, Metapenaeus sp. 21, Metapenaeus sp. 9, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea.

9. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde las especies identificadas utilizando AluI como enzima de restricción son seleccionadas de una lista que comprende Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus, Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Fenneropenaeus indicus, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Metapenaeus sp. 21, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea.

10. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde las especies identificadas utilizando TaqI como enzima de restricción son seleccionadas de una lista que comprende Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus aztecus o Farfantepenaeus californiensis.

11. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde las especies identificadas utilizando HinfI como enzima de restricción son seleccionadas de una lista que comprende Metapenaeus sp. 9 o Parapenaeus longirostris.

12. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde las especies identificadas mediante ensayos independientes con TaqI y HinfI son seleccionadas de una lista que comprende Litopenaus vannamei, Fenneropenaeus merguiensis o Fenneropenaeus sp. 29.

ES-2319009_B2

1. Método de identificación de especies pertenecientes a la superfamilia Penaeoidea que comprende:

A. Extracción y aislamiento del ADN a partir de una muestra biológica o alimentaria.

B. La posterior amplificación mediante el uso de cebadores de cualquier secuencia nucleotídica aislada y su complementaria, del ADN aislado en el paso anterior, caracterizada por estar comprendida entre secuencias nucleotídicas con al menos un 90% de identidad con SEQ ID Nº1 y SEQ ID Nº2.

C. Digestión de la secuencia nucleotídica amplificada mediante los enzimas de restricción AluI, TaqI o HinfI.

D. Detección de los fragmentos obtenidos en el paso anterior.

E. Identificación de las especies por comparación de los fragmentos detectados en el paso anterior con el patrón de fragmentos característico de cada especie.

2. Método según la reivindicación anterior donde la secuencia amplificada en el paso B está comprendida entre SEQ ID Nº 1 y SEQ ID Nº 2.

3. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la amplificación se realiza utilizando un cebador directo que comprende la SEQ ID Nº 3 (16S CRUC3) , y un cebador reverso que comprende la SEQ ID Nº 4 (16S CRUC4) .

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la secuencia amplificada se selecciona de cualquiera de las secuencias SEQ ID Nº 7 a SEQ ID Nº 33.

5. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde la amplificación se realiza mediante PCR.

6. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la detección e identificación de los fragmentos se realiza mediante electroforesis.

7. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la identificación de las especies se realiza por comparación del patrón de fragmentos obtenidos con los reflejados en la tabla 1.

8. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde las especies identificadas se seleccionan de la lista que comprende: Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus, Litopenaeus vannamei, Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Farfantepenaeus aztecus, Farfantepenaeus callforniensis, Fenneropennaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis, Fenneropenaeus sp. 29, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Parapenaeus longirostris, Metapenaeus sp. 21, Metapenaeus sp. 9, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea.

9. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde las especies identificadas utilizando AluI como enzima de restricción son seleccionadas de una lista que comprende Penaeus monodon, Penaeus semisulcatus, Penaeus setiferus, Litopenaeus stylirostris, Farfantepenaeus brasiliensis, Farfantepenaeus notialis, Fenneropenaeus indicus, Marsupenaeus japonicus, Melicertus latisulcatus, Melicertus sp. 30, Metapenaeus sp. 21, Solenocera agasizzi, Solenocera sp. 15, Solenocera sp. 18, Pleoticus muelleri y Aristeomorpha foliacea.

10. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde las especies identificadas utilizando TaqI como enzima de restricción son seleccionadas de una lista que comprende Farfantepenaeus brevirostris, Farfantepenaeus aztecus o Farfantepenaeus californiensis.

11. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde las especies identificadas utilizando HinfI como enzima de restricción son seleccionadas de una lista que comprende Metapenaeus sp. 9 o Parapenaeus longirostris.

12. Método de identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde las especies identificadas mediante ensayos independientes con TaqI y HinfI son seleccionadas de una lista que comprende Litopenaus vannamei, Fenneropenaeus merguiensis o Fenneropenaeus sp. 29.

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ES-2319009_A1

Clasificación avanzada:
C12Q 1/68 (2006.01)

El presente informe ha sido realizado para las siguientes reivindicaciones: TODAS
Fecha de realización del informe: 31.03.2009
Examinador: E. Relaño Reyes

Categoría	Documentos citados	Reivindicaciones afectadas
A	KHAMNAMTONG, B., KLINBUNGA, S., MENASVETA, P. Species	1-12
	identification of five penaeid shrimps using PCR-RFLP and SSCP
	analyses of 16S ribosomal DNA. Journal of Biochemistry and
	Molecular Biology. Julio 2005, Vol. 38, Nº 4, páginas 491-499.
	ISSN 1225-8687.
A	GUTIÉRREZ-MILLÁN, L. E., PEREGRINO-URIARTE, A. B., SOTELO-MUNDO,	1-12
	R. et al. Sequence and conservation of a rRNA and tRNAval
	mitochondrial gene fragment from Penaeus californiensis and
	comparison with Penaeus vannamei and Penaeus stylirostris.
	Marine Biotechnology. Septiembre 2002, Vol. 4, Nº 4,
	páginas 392-398. ISSN 1436-2228.
A	VOLOCH, C. M., FREIRE, P. R., RUSSO, C. A. M. Molecular	1-12
	phylogeny of penaeid shrimps inferred from two mitochondrial
	markers. Genetics and Molecular Research. 2005, Vol. 4, Nº 4,
	páginas 668-674. ISSN 1676-5680.
A	LAVERY, S., CHAN, T. Y., TAM, Y, K., CHU, K. H. Phylogenetic	1-12
	relationships and evolutionary history of the shrimp genus
	Penaeus s. l. derived from mitochondrial DNA. Molecular
	Phylogenetics and Evolution. Abril 2004, Vol. 31, Nº 1,
	páginas 39-49. ISSN 1055-7903.
A	QUAN, J., ZHUANG, Z., DENG, J. et al. Phylogenetic relationship	1-12
	of 12 Penaeoidea shrimp species deduced from mitochondrial DNA
	sequences. Biochemical Genetics. Octubre 2004, Vol. 42, Nº 9-10,
	páginas 331-345. ISSN 0006-2928.

Categoría de los documentos citados
X: de particular relevancia		O: referido a divulgación no escrita
Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría		P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud
A: refleja el estado de la técnica		E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud