Uso de la [Des-Gly10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide para inseminación intravaginal en conejas.
Sector de la técnica
La presente invención pertenece al ámbito de la producción animal y más concretamente a la cría intensiva de conejos mediante inseminación artificial.
Estado de la técnica
El uso de la inseminación artificial en las explotaciones cunícolas es una práctica común en Europa. Como consecuencia, se han introducido numerosos cambios en el manejo de los animales para su adaptación a esta técnica. En general, estos cambios han contribuido a mejorar la calidad de vida del cunicultor y la productividad de las explotaciones. Sin embargo, aún es posible mejorar los sistemas de manejo actuales en aspectos como reducir la administración de sustancias exógenas o simplificar la aplicación de otras, que al menos de momento, no se pueden eliminar, como es el caso de la administración de GnRH para la inducción de la ovulación.
En la coneja, la ovulación no ocurre espontáneamente, se produce por un reflejo neurohormonal que se inicia durante el coito. Cuando se utiliza la inseminación artificial, el macho no está presente y la ovulación debe inducirse mediante métodos artificiales. El método más frecuentemente empleado para la inducción de la ovulación es la administración intramuscular de GnRH o uno de sus análogos sintéticos. Algunos métodos alternativos a la aplicación de esta hormona son:
. La administración intravenosa de acetato de cobre (Kishk W, Awad M, Ayoub M. Non-hormonal substances for the induction of ovulation in rabbit does. 7th World Rabbit Congress. Valencia. Spain. 2000) . Investigaciones realizadas por diferentes autores demuestran que las sales de cobre pueden provocar un pico de LH seguido de la ovulación, de forma similar al inducido por el coito. Este efecto se debe a un sinergismo entre el cobre y las gonadotropinas. Sin embargo, cualquier método que implique la administración intravenosa de una sustancia hace que sea imposible su aplicación por la dificultad y el tiempo requerido.
. Uso de machos vasectomizados (Khalifa RM, El-Alamy MA, Beshir MA. Vasectomized buck gave better reproductive results in artificial insemination techniques in rabbit than GnRH or HCG. 7th World Rabbit Congress. Valencia. Spain. 2000) . Su uso permite la obtención de resultados similares a los obtenidos mediante la administración de GnRH por vía intramuscular. Sin embargo, el tiempo requerido para conseguir el efecto deseado es muy superior y es necesario mantener un grupo de machos vasectomizados en la granja. Estos inconvenientes hacen que no sea aplicable su uso a nivel de campo.
En la mayor parte de las explotaciones, la preparación y administración de la GnRH está a cargo del cunicultor, con un cierto riesgo de errores y con un incremento del tiempo necesario para la realización de la inseminación artificial. La GnRH o sus análogos son normalmente administrados por vía intramuscular, sin embargo, al tratarse de moléculas de bajo peso molecular, es posible su absorción a través de las mucosas. En este sentido, existen referencias que indican que es posible la absorción de análogos de la GnRH a través de las mucosas, ya que en medicina humana se utilizan algunos por vía intranasal, aunque la dosis es superior a la aplicada por vía intramuscular (Camier B, Gagneur O, Arlot S, Thépot F, Vitse M. Preliminar y study of the use of intranasal buserelin in the long-term protocol of ovarian stimulation with the view toward fertilization in vitro. Rev Fr Gynecol Obstet 1989, 84: 659-661) .
La administración vía intravaginal de la GnRH, añadida al semen, reduciría el tiempo necesario para realizar la inseminación artificial y los posibles errores como consecuencia de una manipulación por personas no cualificadas, ya que se podría añadir en el Centro de inseminación, lugar en el que se elaboran las dosis seminales que serán utilizadas en la inseminación artificial de las conejas.
En este sentido, existen pruebas de que la administración de un análogo sintético de la GnRH, concretamente la Buserelina, por vía intravaginal añadiendo la hormona a la dosis seminal, es igual de eficaz induciendo ovulación que la administrada por vía intramuscular (Quintela, L.A; Peña, A.I.; Vega, MaD.; Gullón, J.; Prieto, C.; Barrio, M.; Becerra, J.J.; Maseda, F. y Herradón, P.G. Ovulation induction in rabbit does submitted to artificial insemination by adding buserelin to the seminal dose. Reprod. Nutr. Dev. 2004, 44: 79-88) .
La presente invención, describe la eficacia induciendo la ovulación en la coneja de un análogo o sintético de la GnRH, la [Des-Gly10, D-Ala6]-LHRH Ethyl-Amide, CAS Register Number [52435-06-0], administrado por vía intravaginal. Esta eficacia es incluso superior a la demostrada por la GnRH administrada por vía intramuscular, y, además, se puede añadir al semen hasta 24 horas antes de su aplicación. La invención facilita considerablemente el empleo de la inseminación artificial en cunicultura, al reducir el tiempo necesario para su realización y evitar la manipulación de las hormonas por personal no cualificado, con los consiguientes errores de dosificación o incluso problemas sanitarios debidos al uso en varios animales de las mismas agujas. Asimismo, supone una alternativa a la vía de administración habitual de la hormona responsable de la inducción de la ovulación en la coneja.
También, la invención consiste en un método de inducción de la ovulación en conejas que radica en la adición de un análogo de la GnRH a la dosis seminal. Con esto se consigue eliminar la preparación de las dosis de hormona y la administración intramuscular a cada animal. La hormona en este caso es administrada al mismo tiempo que se insemina la coneja, sin un trabajo extra. Por otra parte, se reducen los errores al reducir la manipulación que el cunicultor debe realizar de la hormona.
Descripción de la invención
La presente invención esta dirigida a obtener una alternativa más eficaz al sistema tradicional de inducción de la ovulación en conejas sometidas a inseminación artificial.
Esta alternativa consiste en la administración por vía intravaginal, añadida a la dosis seminal, del análogo de la GnRH cuya denominación es la: [Des-G1y10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide, CAS Register Number [52435-06-0].
La dosis recomendada para obtener los mejores resultados de fertilidad y prolificidad es la de 25 μg. por coneja, añadida a la dosis seminal hasta 24 h. antes de uso, manteniendo ésta a la temperatura de conservación normal del semen de conejo (16ºC) .
Ejemplos En los ejemplos descritos a continuación se demuestra la eficacia de la [Des-Gly10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide administrada por vía vaginal añadida a la dosis seminal, en la inducción de la ovulación en la coneja.
Animales En todos los ejemplos se utilizaron conejas híbridas comerciales (Hyplus línea PS19, Grimaud Freres, Francia) . Todas las conejas procedían de una explotación industrial de conejos. Los ejemplos fueron realizados en la Universidade de Santiago de Compostela, Facultad de Veterinaria de Lugo durante los meses de noviembre de 2004 a junio de 2005 Las conejas estaban alojadas en una granja experimental sin ventanas, con luz artificial que aportaba una intensidad de 70 lux y con un sistema de ventilación forzada y de climatización de forma que la temperatura interior se mantuviese en un rango entre 18 y 22ºC. Las luces estaban conectadas a un programador que mantenía un fotoperiodo artificial de 12 horas de luz y 12 de oscuridad. Seis días antes de la inseminación artificial este fotoperiodo se incrementaba a 16 horas de luz y 8 de oscuridad. Durante los 4 días siguientes a la inseminación artificial se reducía 1 hora de luz al día hasta volver al fotoperiodo inicial de 12 h. de luz/12 h. de oscuridad.
Las conejas estaban alojadas en jaulas individuales (0, 3 m2) , comunicadas con un nido exterior (0, 12 m2) , por un orificio circular que se cierra mediante una puerta deslizante. Las conejas preñadas o lactantes se alimentaron ad libitum, mientras que las no gestantes y no lactantes fueron racionadas a 150 g/día de un pienso comercial, excepto en el intervalo que va de los 6 días anteriores a la inseminación artificial (IA) al diagnóstico de gestación, en que fueron alimentadas ad libitum. Se emplearon dos tipos diferentes de dietas: de los 21 días posparto al destete (30-35 días) , todas las conejas, por razones prácticas, incluidas las no lactantes, fueron alimentadas con un pienso de gazapos (15.3% Proteína Bruta, 16.5 Fibra Bruta, 1800 Kcal Energía Digestible) , durante el resto de los días recibieron un pienso de maternidad (17.8% Proteína Bruta, 13.3 Fibra Bruta, 2300 Kcal Energía Digestible) .
Manejo reproductivo
Todas las hembras fueron inseminadas el mismo día, con un intervalo de 42 días (11 días posparto) . Todas las hembras fueron tratadas hormonalmente para sincronizar el estro. El tratamiento hormonal consistente en 20 UI eCG (Follygon®, Laboratorios Intervet, Salamanca, España) , inyectado en un volumen de 1 mL, 48 h. antes de la inseminación artificial.
Se les aplicó un programa de amamantamiento controlado a todas las hembras entre los días 0 a 10 posparto, manteniendo la puerta del nido cerrada y abriéndola sólo cada 24 h, a las 12:00 h, para permitir a las crías mamar una vez al día. El día de la inseminación el amamantamiento fue retrasado hasta las 17:00 h, 5-10 minutos antes de llevar a cabo la inseminación artificial, lo que supuso una separación coneja-gazapo de 30 h. Desde el día 12 posparto (1 día pos-inseminación) hasta el destete (30-35 días posparto) se permitió la lactancia libre dejando la puerta del nido abierta. Entre los días 11 y 14 pos-inseminación se realizó el diagnóstico de gestación de todas las conejas mediante palpación transabdominal.
Al destete los conejos fueron trasladados a una nave de cebo para finalizar su crecimiento, y durante este periodo (7-12 días previos al siguiente parto) se llevó a cabo la limpieza y desinfección de los nidales a fin de preparar el próximo parto.
Los partos tuvieron lugar principalmente a los 30 días pos-inseminación y en la mañana del día 31. En aquellas conejas que no hubiesen parido el mediodía del día 31, se les indujo el parto mediante la inyección subcutánea 2 UI Oxytocina (Hormohipra®, Laboratorios Hipra, Girona, España) . Después de este tratamiento (aplicado aproximadamente a un 5% de las parturientas) , el parto comienza por lo general a los 5-10 minutos y se completa en 15 minutos.
Una vez paridas todas las conejas se anota el número de nacidos vivos y nacidos muertos. Posteriormente, las camadas son igualadas hasta las 10 crías cada una, con un tamaño de éstas similar dentro de cada grupo. Las crías sobrantes son eutanasiadas mediante la inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (Dolethal®, Laboratorios Vetoquinol, Madrid, España) .
Procesado del semen e inseminación artificial
El semen empleado se obtuvo de un centro de inseminación artificial, en donde rutinariamente el semen de conejo es recogido, diluido y almacenado a 16ºC usándolo en un intervalo de 24 horas.
Eyaculados de 8-12 conejos (Hyplus PS39, Grimaud Freres, France) , son recogidos usando una vagina artificial, mezclados y diluidos con un diluyente comercial (MA 24®, Laboratorios Ovejero, León, España) hasta una concentración estándar de 60x106 espermatozoides/mL. Sólo fueron empleados aquellos eyaculados cuyo volumen libre de gel era superior a 0.2 mL y la motilidad espermática (evaluación subjetiva con microscopio) mayor al 70%.
Las hembras fueron inseminadas vaginalmente usando pipetas de plástico de un único uso, con una dosis de 30 x 106 espermatozoides en un volumen de 0.5 mL. En el momento de realizar la inseminación artificial fue observado el color de la vulva y clasificado como blanco, rosa, rojo o púrpura.
Diseño experimental
Ejemplo 1
Prueba experimental de 2 concentraciones diferentes de [Des-Gly10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide añadido al semen
conejas de aproximadamente 30 semanas de edad (secundíparas) divididas al azar en 3 grupos de 6 fueron inseminadas 5 veces consecutivas. Cada grupo recibió un tratamiento hormonal diferente para la inducción de la ovulación en el momento de la IA:
1. Grupo control: 20 mg/coneja de GnRH natural (Inducel GNRH®, Laboratorios Ovejero S.A, León, España) vía intramuscular.
2. Grupo T25: 25 μg/coneja de [Des-Gly10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide diluido en solución salina fisiológica en relación 1/1 administrado intravaginal añadiendo la hormona a la dosis seminal (25 μL.) .
3. Grupo T30: 30 μg/coneja de [Des-Gly10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide diluido en solución salina fisiológica en relación 1/1 administrado intravaginal añadiendo la hormona a la dosis seminal (30 μL.) .
Ejemplo 2
Respuesta de la hipófisis a la administración de [Des-G1y10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide añadido al semen
A cuatro conejas elegidas aleatoriamente en cada uno de los tres grupos del experimento anterior en la 5ª IA, se les recogieron muestras de sangre justo antes de la IA y a los 60, 90, 120 y 150 min. de la IA, para la determinación de los niveles de LH en plasma. Las muestras fueron recogidas en la vena marginal de la oreja en tubos de EDTA e inmediatamente centrifugados a 1000 g. durante 10 min. El plasma sanguíneo así obtenido se congeló a -20ºC hasta su análisis hormonal.
Resultados
Ejemplo 1
Prueba experimental de 2 concentraciones diferentes de [Des-Gly10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide añadido al semen
En este ejemplo se demuestra que mediante la adición al semen de [des-Gly10, D-Ala6] - LHRH ethyl-amide en las dosis probadas se obtienen resultados similares a los que se conseguirían con la administración intramuscular de gonadorelina siguiendo el protocolo tradicional. Por otra parte, aunque en ningún caso las diferencias entre grupos fueron estadísticamente significativas, la dosis de 25 μg parece ser la mejor.
TABLA 1 Resultados de fertilidad y prolificidad obtenidos mediante la adición al semen de diferentes dosis de [Des-Gly10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide en una granja experimental 
Ejemplo 2
Respuesta de la hipófisis a la administración de [Des-Gly10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide añadido al semen
Los resultados obtenidos en este experimento no vienen más que a confirmar lo observado en el experimento anterior. Comprobamos que tras la administración de 25 o 30 μg de [Des-Gly10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide se consigue un pico de LH a los 90 min. de la administración, de igual forma que en el protocolo tradicional, e incluso ligeramente superior (Figura 1. Gráfica en la que se muestra el momento en el que se produce el pico de LH en conejas a las que se les administró GnRH por vía intramuscular o 25/30 μg de [Des-Gly10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide añadida al semen) .
Descripción de la figura
Representación de la Figura 1. Concentraciones de LH en plasma justo antes de la inseminación artificial y a los 60, 90, 120 y 150 minutos postinseminación en función del tratamiento administrado (C: 20 mg/coneja de GnRH natural (Inducel GNRH®, Laboratorios Ovejero S.A, León, España) vía intramuscular; 25: 25 μg/coneja de [Des-Gly10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide diluido en solución salina fisiológica en relación 1/1 administrado intravaginal añadiendo la hormona a la dosis seminal (25 μL.) ; 30: 30 μg/coneja de [des-Gly10, D-Ala6]-LHRH ethyl-amide diluido en solución salina fisiológica en relación 1/1 administrado intravaginal añadiendo la hormona a la dosis seminal (30 μL.) ) .
