d. Detección de los amplicones obtenidos en el paso c. En una realización preferida de este aspecto de la invención la bacteria Gram positiva es Lactobacillus casei, el fago atemperado para dicha bacteria es el fago A2 y la secuencia amplificada tiene al menos un 90%, preferentemente un 95% y más presentemente un 98% de homología con la secuencia SEQ ID 1, la secuencia complementaria o fragmentos de la mismas. En una realización aun más preferida la secuencia amplificada es la SEQ ID 1, la secuencia complementaria o fragmentos de las mismas. Y en una realización todavía mas preferida la región amplificada es el fragmento SEQ ID 2 o su secuencia complementaria.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención la bacteria Gram positiva es Escherichia coli, el fago atemperado para dicha bacteria es el fago lambda y la secuencia amplificada tiene al menos un 90%, preferentemente un 95% y más presentemente un 98% de homología con la secuencia SEQ ID 5, la secuencia complementaria o fragmentos de la mismas. En una realización aun más preferida la secuencia amplificada es la SEQ ID 5, la secuencia complementaria o fragmentos de las mismas. Y en una realización todavía más preferida la región amplificada es el fragmento SEQ ID 6 o su secuencia complementaria.
En otra realización preferida de la presente invención los cebadores tienen una longitud de al menos 10, preferentemente entre 15 y 30 nucleótidos. En una realización aun más preferida, dichos cebadores tienen cualquiera de las SEQ ID 3, 4, 5 y 6.
En otra realización aun más preferida de la presente invención la PCR es una PCR múltiple.
Un segundo aspecto de la presente invención se relaciona con kit para la detección y evaluación de agentes genotóxicos que comprende al menos una bacteria Gram positiva, al menos una Gram negativa lisogénicas para fagos inducibles por respuesta SOS o el genoma de dichas bacterias y las secuencias que comprenden a los sitios attP de dichos fagos, sus secuencias complementarias o fragmentos de las mismas.
En una realización más preferida del presente aspecto de la invención la bacteria Gram positiva es Lactobacillus casei y la Gram negativa es Escherichia coli.
En otra realización aun mas preferida de este aspecto de la invención las secuencias que comprenden al sitio attP pertenecen a los fagos A2 y lambda y tienen al menos 90%, preferentemente un 95% y más preferentemente un 98% de homología con SEQ ID 1, SEQ ID 5, sus secuencias complementarias o fragmentos de las mismas. Y todavía más preferentemente, las secuencias que comprenden al sitio attP que tienen la SEQ ID 2, SEQ ID 6 o sus secuencias complementarias.
En una realización preferida, el kit comprende cebadores capaces de amplificar cualquiera de las secuencias mencionadas en este aspecto de la invención. Mas preferentemente, dichos cebadores tienen cualquiera de las SEQ ID 3, 4, 7 y 8.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Esquema de la disposición del ADN viral (línea gruesa) respecto al bacteriano. Los sitios attP y attB son los puntos en los que ocurre la recombinación que conducirá a la integración/escisión del ADN viral. Las flechas horizontales representan a los oligonucleótidos cebadores. Obsérvese que los oligonucleótidos, que tienen orientación divergente en el fago integrado, pasan a ser convergentes en el ADN viral autónomo. El rectángulo colocado entre ambos cebadores representa el segmento que resultará amplificado por PCR.
Figura 2. Influencia de la mitomicina C sobre la escisión del genoma del fago A2 del cromosoma de una cepa lisogénica de Lactobacillus casei, medida por RT-PCR (el segmento amplificado está flanqueado por dos cebadores que enmarcan el sitio attP del fago) . \medbullet Cultivo sin Mitomicina C; \blacksquare 12, 5 ng/ml; \ding{115} 50 ng/ml; \blacklozenge 300 ng/ml; × 1000 ng/ml; \medcirc 3000 ng/ml; \Box 5000 ng/ml; Δ 10000 ng/ml. Nótese que en la gráfica los valores de Ct (eje de ordenadas) van de mayor a menor. La razón de este tipo de representación se deriva del hecho de que los valores de Ct son tanto más pequeños cuanto mayor es la concentración del ADN molde, que es el parámetro que nos indica la magnitud del efecto genotóxico de la mitomicina C.
Figura 3. Influencia de la mitomicina C sobre la producción de nuevos virus por un cultivo de Lactobacillus casei lisogénico para el fago A2. Los sobrenadantes de cultivo se incluyeron en medio semisólido sembrado con L. casei no lisogénico, utilizando la técnica de la doble capa y se incubaron durante la noche hasta conseguir visualizar las placas de lisis en el césped de la cepa indicadora. \medbullet Cultivo sin Mitomicina C; \blacksquare 12, 5 ng/ml; \ding{115} 50 ng/ml; \blacklozenge 300 ng/ml; × 1000 ng/ml; \medcirc 3000 ng/ml; \Box 5000 ng/ml; Δ 10000 ng/ml.
Figura 4. Influencia de la mitomicina C sobre la escisión del genoma del fago lambda del cromosoma de una cepa lisogénica de Escherichia coli, medida por RT-PCR (el segmento amplificado está flanqueado por dos cebadores que enmarcan el sitio attP del fago) . \medbullet Sin Mitomicina; \blacksquare 12, 5 ng/ml; \ding{115} 100 ng/ml; \blacklozenge 500 ng/ml; × 1000 ng/ml; \medcirc 3000 ng/ml; \Box 5000 ng/ml; Δ 10000 ng/ml; ◊enge 20000 ng/ml.
Figura 5. Correlación entre la concentración de mitomicina C (escala logarítmica) añadida a cultivos de L. casei lisogénico para el fago A2 y los valores de Ct obtenidos a las 3 h (\medbullet) , 4 h (\blacksquare) y 5 h (\ding{115}) de incubación con el agente genotóxico. Obsérvese: a) que a concentraciones moderadas de mitomicina C (entre 12, 5 y 300 ng/ml) los valores de Ct disminuyen al aumentar dicha concentración, b) que a partir de 500 ng/ml la mitomicina resulta tóxica y c) que, para cada concentración, los valores de Ct a las 4 y 5 horas son semejantes.
Figura 6. Correlación entre la concentración de mitomicina C (escala logarítmica) añadida a cultivos de E. coli lisogénica para el fago lambda y los valores de Ct obtenidos a 1 h (\medbullet) y 1:30 h (\blacksquare) de incubación con el agente genotóxico. Obsérvese que a 1:30 h los valores de Ct son semejantes en un amplio rango de concentraciones de mitomicina C.
Figura 7. Influencia de la mitomicina C sobre la producción de nuevos virus por un cultivo de Escherichia coli lisogénica para el fago lambda. \medbullet Sin Mitomicina; \blacksquare 12, 5 ng/ml; \ding{115} 100 ng/ml; \blacklozenge 500 ng/ml; × 1000 ng/ml; \medcirc 3000 ng/ml; \Box 5000 ng/ml; Δ 10000 ng/ml; ◊enge 20000 ng/ml. Los sobrenadantes de cultivo se incluyeron en medio semisólido sembrado con E. coli no lisogénica utilizando la técnica de la doble capa y se incubaron durante la noche hasta conseguir visualizar las placas de lisis en el césped de la cepa indicadora.
Figura 8. Influencia de la radiación ultravioleta sobre la escisión del genoma del fago A2 del cromosoma de una cepa lisogénica de Lactobacillus casei, medida por RT-PCR (el segmento amplificado está flanqueado por dos cebadores que enmarcan el sitio attP del fago) . \medbullet 0 J/m2; \blacksquare 1 J/m2; \ding{115} 5 J/m2; \blacklozenge 10 J/m2; × 30 J/m2; \medcirc 50 J/m2; \Box control positivo con Mitomicina C.
Figura 9. Influencia de la radiación ultravioleta sobre la escisión del genoma del fago lambda del cromosoma de una cepa lisogénica de Escherichia coli, medida por RT-PCR (el segmento amplificado está flanqueado por dos cebadores que enmarcan el sitio attP del fago) . \medbullet 0 J/m2; \blacksquare 1 J/m2; \ding{115} 5 J/m2; \blacklozenge 10 J/m2; × 30 J/m2; \medcirc 50 J/m2; \Box control positivo con Mitomicina C.
Figura 10. Influencia de la radiación ultravioleta sobre la producción de nuevos virus por un cultivo de Lactobacillus casei lisogénico para el fago A2. \medbullet 0 J/m2; \blacksquare 1 J/m2; \ding{115} 5 J/m2; \blacklozenge 10 J/m2; × 30 J/m2; \medcirc 50 J/m2; \Box control positivo con Mitomicina C.
Figura 11. Influencia de la radiación ultravioleta sobre la producción de nuevos virus por un cultivo de Escherichia coli lisogénica para el fago lambda. \medbullet 0 J/m2; \blacksquare 1 J/m2; \ding{115} 5 J/m2; \blacklozenge 10 J/m2; × 30 J/m2; \medcirc 50 J/m2; \Box control positivo con Mitomicina C.
Figura 12. Influencia de la ciprofloxacina sobre la escisión del genoma viral medida por RT-PCR. Los símbolos llenos representan a la combinación lambda - E. coli; los vacíos a A2 - L. casei. O Cultivo de E. coli sin antibiótico; \blacksquare 10 nM; \ding{115} 50 nM; \blacklozenge 500 nM. También se ensayaron las concentraciones 1 nM, 30 nM, 1500 nM, y 5000 nM cuyos datos no se muestran pero que corroboran las conclusiones indicadas en el texto.
Figura 13. Efecto de la ciprofloxacina sobre la producción de nuevos virus por cultivos de E. coli y L. casei lisogénicas para los fagos lambda y A2 respectivamente. \medcirc Sin Inducir; \blacksquare 10 nM; \ding{115} 50 nM; \blacklozenge 500 nM. La concentración de fagos en los sobrenadantes se determinó por la técnica de la doble capa.
Figura 14. Influencia del Etopósido sobre la escisión del genoma viral medida por RT-PCR. Los símbolos llenos representan a la combinación lambda - E. coli; los vacíos a A2 - L. casei. O Cultivo de L. casei sin antibiótico; \blacksquare 50 nM; \ding{115} 1500 nM; \blacklozenge 5000 nM. También se ensayaron concentraciones intermedias. Los datos obtenidos corroboran las conclusiones indicadas en el texto.
Figura 15. Efecto del Etopósido sobre la producción de nuevos virus por cultivos de E. coli y L. casei lisogénicas para los fagos lambda y A2 respectivamente. \medcirc Sin Inducir; \blacksquare 50 nM; \ding{115} 1500 nM; \blacklozenge 5000 nM. La concentración de fagos en los sobrenadantes se determinó por la técnica de la doble capa.
Exposición detallada de la invención
El sistema que proponemos pertenece a la categoría de los ensayos microbianos de genotoxicidad que detectan el estímulo de la respuesta SOS mediante la observación de la inducción de profagos residentes en el genoma de bacterias lisogénicas. La originalidad en este caso estriba en que se cuantifica un paso muy temprano de dicha inducción como es la separación del ADN viral y el bacteriano, en vez de observar la culminación del proceso, es decir la generación de la progenie viral, que es lo que hacen los métodos descritos en el estado de la técnica.
El protocolo se basa en las siguientes premisas: durante el proceso de integración tanto el ADN viral como el bacteriano se abren en puntos específicos denominados attP y attB respectivamente y se produce una soldadura entre ambas moléculas de ADN. La liberación del ADN viral, consecuencia de la activación de la respuesta SOS, es el proceso inverso al anterior y ocurre en los mismos puntos. De este modo, los segmentos de ADN viral que se encuentran a cada lado de attP y que, por lo tanto, están contiguos en el ADN del fago independiente, quedan separados por todo el ADN bacteriano después de la integración y vuelven a quedar adyacentes una vez que se libera el profago (Fig. 1) .
Basándonos en esos principios, se han diseñado parejas de oligonucleótidos cuyas secuencias se corresponden con segmentos de ADN viral que se encuentran a ambos lados de attP y están orientados hacia él, es decir, son convergentes. Dichos oligonucleótidos deberán inducir la amplificación del segmento intermedio en un PCR cuyo molde sea el ADN viral independiente, pero no cuando el molde es dicho ADN integrado en el genoma celular, ya que, en ese caso, su orientación sería divergente (Fig. 1) . En otras palabras, el ADN obtenido a partir de células lisogénicas no será amplificable, pero si lo será una vez que la respuesta SOS induzca la liberación del ADN viral.
En la aplicación de la PCR a tiempo real (RT-PCR) en lugar de una PCR normal podrá obtenerse un valor cuantitativo de la reacción de liberación del profago. En los experimentos de RT-PCR se obtiene un dato numérico, denominado Ct, que se corresponde con el umbral a partir del que se detecta el segmento de ADN amplificado. Cuanto menor sea ese valor la detección es más precoz, lo que es indicativo de una mayor concentración de moléculas molde en la mezcla de reacción. En este caso, los moldes se generan como consecuencia de la acción inductora de la respuesta SOS, que a su vez responde a la alteración del ADN por diferentes condiciones físicas (radiaciones) o compuestos químicos (genotóxicos) . Por ello, el método puede revelar la potencia de dichos agentes en relación a otro usado como control o medir la intensidad/concentración de uno de estos agentes respecto a una curva patrón obtenida, con concentraciones conocidas del mismo.
Para demostrar la aplicabilidad del principio, el sistema se puso a punto con dos asociaciones bacteria lisogénica - bacteriofago muy diferentes: Escherichia coli - fago lambda y Lactobacillus casei - fago A2. En el primer caso se usó la asociación habitual en métodos previos para facilitar la comparación con ellos. Complementariamente, así se podrá aprovechar la enorme diversidad de cepas de E. coli con diferentes características y utilidades específicas que se han ido desarrollando a lo largo del tiempo.
La asociación L. casei - fago A2, además del propósito ya enunciado de demostrar la aplicabilidad general del principio desarrollado, tenía otras dos metas; por un lado, trabajar con una bacteria Gram positiva y, por otro, con un organismo inocuo para la salud. Las bacterias Gram positivas presentan una pared de naturaleza esencialmente polisacarídica y muy porosa que no supone una barrera efectiva a la difusión de compuestos hidrofílicos hasta la membrana plasmática. Así se facilitará el acceso al citoplasma (y por ende al ADN) de determinados compuestos cuya actividad genotóxica se quiere evaluar (como se indicó anteriormente, la membrana externa de las bacterias Gram negativas, de naturaleza lipídica, puede suponer una barrera muy efectiva para este tipo de sustancias) .
Por otro lado, L. casei es una bacteria láctica que pertenece al grupo de organismos GRAS (Generally Regarded As Safe) , que es consumida habitualmente en grandes cantidades como parte de los productos lácteos y que, por lo tanto, no presenta ningún riesgo para la salud de los manipuladores de la técnica. De las bacterias usadas previamente en la detección de genotoxicidad, Salmonella typhimurium es un patógeno primario, mientras que E. coli, aunque es un organismo habitualmente inocuo, se asocia frecuentemente a infección urinaria, pudiendo producir cuadros graves, incluso septicemias, en individuos inmunocomprometidos.
A continuación se ilustrará la invención mediante los ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad del método.
Cepas bacterianas, bacteriófagos y condiciones de cultivo
Las bacterias utilizadas fueron:
a) Lactobacillus casei ATCC393 y su derivado lisogénico, que alberga el ADN genómico del bacteriofago A2 insertado al final del gen bacteriano que codifica para el RNA de transferencia específico para leucina cuyo anticodon es CAA.
b) Escherichia coli W3110 y una variante de la misma conteniendo el ADN del fago lambda insertado en su sitio primario de lisogenización, entre los genes ybhB e ybhC.
L. casei se propagó en medio MRS líquido (Oxoid) suplementado con CaCl2 (10 mM) y SO4Mg (10 mM) a 30ºC sin agitación. E. coli se incubó en medio LB (Sambrook, J., E., Fritsch, F. and Maniatis, T. "Molecular Cloning: A laborator y manual". 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laborator y Press. 1989) a 37ºC con agitación.
La determinación de la concentración de fagos presentes en los cultivos se llevó a cabo por el método de la doble capa, usando los mismos medios indicados anteriormente, a los que se añadió agar-agar a concentraciones del 1, 5% (capa inferior) y del 0, 7% (capa superior) .
Condiciones del PCR a tiempo real
Para la amplificación de un segmento de ADN que incluye el sitio attP del fago A2 se utilizaron como cebadores la pareja de oligonucleótidos: SEQ ID 3 y SEQ ID 4, que lo flanquean y originan un fragmento de 226 pares de bases (pb) . En el caso de lambda, los cebadores fueron SEQ ID 7 y SEQ ID 8, que limitan un segmento de 186 pb.
La mezcla de reacción tenía los siguientes ingredientes: cultivo 1, 25 μl, cebadores 0, 6 μM (concentración final) , mezcla PCR Q SYBR Green (Bio-Rad) 7, 5 μl y agua hasta 15 μl.
Las condiciones para la amplificación del ADN del fago A2 fueron las siguientes: estadio 1: 95ºC (3 min) ; estadio 2: 30 ciclos a 95ºC (45 s) , 67ºC (45 s) y 72ºC (45 s) ; estadio 3: 72ºC (10 min) . En el caso de lambda las condiciones de los estadios 1 y 3 fueron idénticas a las usadas con A2, pero en el estadio 2 se usaron los siguientes parámetros: 95ºC (35 s) , 57ºC (35 s) y 72ºC (35 s) .
Procedimiento Los cultivos de L. casei o de E. coli, lisogénicos para los fagos A2 o lambda respectivamente, se incubaron hasta alcanzar una absorbancia (a 600 nm) de 0, 1. En ese punto se repartieron en varios tubos (volumen final de 25 ml) . A cada uno de ellos se le añadió el agente cuya actividad genotóxica se quería conocer, a concentraciones comprendidas habitualmente entre 50 y 5000 nM (dado que muchos de estos compuestos no eran solubles en agua, se comprobó que el solvente utilizado no ejerciera ningún efecto sobre la viabilidad de los cultivos ni sobre la inducibilidad de los profagos) . Cada 15 min (E. coli) o cada 30 min (L. casei) se tomaban dos alícuotas de 50 μl. Una de ellas se congelaba inmediatamente y se mantenía en esas condiciones hasta su uso en la PCR. La otra se centrifugaba a 4ºC y el sobrenadante se diluía para cuantificar los fagos presentes en el mismo.
Para evaluar si el procedimiento detectaba el poder genotóxico de la radiación, los cultivos, a una absorbancia de 0.1, se centrifugaban y las células se suspendían en 1/10 del volumen inicial de ClNa al 0, 85%. A continuación se sometían a radiación UV (1 jul/m2) durante diferentes periodos de tiempo. Posteriormente, se añadía medio de cultivo precalentado a las suspensiones celulares hasta alcanzar el volumen inicial y se proseguía la incubación. La toma de muestras y su procesamiento posterior se llevaba a cabo tal como se ha indicado en el párrafo anterior.
Ejemplos de realización
Como ejemplo de los resultados que puede proporcionar la metodología desarrollada por la presente invención, a continuación se exponen los datos obtenidos del análisis de la actividad genotóxica de un compuesto químico, la mitomicina C, y de un agente físico, la radiación ultravioleta. El efecto genotóxico de la primera, y por tanto la inducción de la respuesta SOS, ocurre porque la mitomicina C se une al ADN e impide la separación de las cadenas, bloqueando así la replicación. Este modo de actuación ha promovido su uso como quimioterápico anticanceroso en determinados países. La radiación UV se usa como agente microbiocida e induce fundamentalmente la formación de dímeros de pirimidina en el ADN. Complementariamente, se presentan los resultados obtenidos con la ciprofloxacina y el etopósido. La primera es una quinolona fluorada que inhibe la acción de la ADN - girasa bacteriana. El etopósido es un compuesto antitumoral que inhibe el estadio G2 del ciclo de desarrollo de las células de mamífero. El propósito es ilustrar la utilidad que tiene el procedimiento combinado de detección de la respuesta SOS que presentamos, dado que cada uno de los dos compuestos la induce en uno de los sistemas fago - bacteria pero no en el otro. Se incluye, asimismo, una tabla con los resultados de inducción obtenidos con otros compuestos genotóxicos.
Ejemplo 1
Detección y análisis del efecto genotóxico de la mitomicina C sobre la inducción del ciclo lítico del profago A2
Efecto de la mitomicina C sobre la inducción del ciclo lítico del profago A2. La escisión del genoma del fago A2 residente en el cromosoma de L. casei, es detectable a concentraciones muy bajas del compuesto genotóxico, del orden de 12, 5 ng/ml de medio de cultivo (Fig. 2) . Incrementos sucesivos de la concentración de mitomicina C resultan en un aumento correlativo de la respuesta detectada, hasta llegar a valores 24 veces superiores (300 ng/ml) al que originaba la respuesta inicial. Incrementos posteriores de la concentración de mitomicina C se traducen en una inhibición gradual de la respuesta, hasta que a 10 000 ng/ml ya no se aprecian diferencias respecto al control al que no se le había añadido el agente genotóxico.
Adicionalmente, se determinó la producción de fagos que resultaba de la inducción de los cultivos con mitomicina C (Fig. 3) , para comparar la sensibilidad del RT-PCR con la del microescrutinio. Los datos obtenidos son semejantes a los correspondientes a la detección de la liberación de los profagos con algunas excepciones. Así, la concentración mínima de mitomicina C que induce una respuesta es la misma en ambos casos y hay un incremento de dicha respuesta según se va aumentando la concentración de agente genotóxico. Sin embargo, mientras por RT-PCR las muestras recogidas a las dos horas de incubación ya mostraban incrementos significativos respecto a los controles, únicamente empezaba a aparecer fago en las muestras recogidas a las tres horas de inducción. Debe tenerse en cuenta, además, que el procesamiento de la muestra por RT-PCR hasta que se obtienen los datos es de unas dos horas, mientras que la observación de las placas de lisis, en la que se basan los métodos de microescrutinio, solo puede hacerse al día siguiente. Por otra parte, el microescrutinio parece ser más susceptible al efecto tóxico de la mitomicina C. Así, por ejemplo, a una concentración de 5000 ng/ml ya no se detecta incremento en la generación de nuevos fagos, pero aún existe una amplificación del segmento de ADN viral evidente. Esta última diferencia está motivada, probablemente, por el hecho de que la liberación de los genomas virales no requiere de la síntesis de ADN, que es precisamente el proceso que inhibe la mitomicina C, mientras que la producción de nuevos fagos si depende de que haya replicación del material genético viral.
Ejemplo 2
Efecto de la mitomicina C sobre la inducción del ciclo Rico del bacteriófago lambda
La concentración mínima del genotóxico que induce la escisión es la misma que para A2 y, al igual que ocurría en este caso, al aumentar su concentración se incrementaban las tasas de liberación, hasta que la toxicidad inherente de la mitomicina C provocaba la disminución de la respuesta, lo que ocurría, en el caso de la asociación lambda - E. coli, a concentraciones de 15.000-20.000 ng/ml (Fig. 4) .
Sin embargo, el perfil de las curvas de variación de la Ct con el tiempo es diferente. En el caso de A2 se alcanza rápidamente una meseta, independientemente de la concentración de mitomicina C utilizada (Fig. 2) . En el de lambda, por el contrario, a concentraciones bajas del quimioterápico, existe una variación continua en los valores de Ct, de manera que todas las curvas alcanzan valores de Ct similares, si se incuban los cultivos con la mitomicina C el tiempo suficiente (Fig. 4) . La diferencia de comportamiento de ambos sistemas la interpretamos como un reflejo de la mayor permeabilidad de las células de L. casei con respecto a las de E. coli.
En el primer caso, la mitomicina C penetra rápidamente en las células y en aquellas en las que se alcanza un nivel crítico de concentración se inicia la respuesta SOS. Al aumentar la concentración de genotóxico que se añade a los cultivos, el número de células en las que se alcanza el umbral a partir del que se dispara la respuesta SOS y, con ella, la liberación del profago, aumentará correlativamente. Como consecuencia, la meseta aparecerá a valores de Ct progresivamente decrecientes (recuérdese que cuanto menor es Ct mayor es el número de moléculas molde para la RT-PCR) .
En el caso de E. coli, la mitomicina C tendría más dificultades para entrar. A pesar de ello, a concentraciones elevadas se alcanzarían los valores umbral relativamente pronto en todo el cultivo, pero cuando la concentración del genotóxico fuera limitante se establecería un gradiente continuo de células que irían alcanzando los niveles que disparan la respuesta SOS, lo que se apreciaría como una variación continua de los valores de Ct. De aquí se deduciría que, en realidad, la respuesta SOS de E. coli es mucho más sensible a la mitomicina C que la de L. casei, porque, por ejemplo, a la concentración mínima representada, 12, 5 ng/ml, la liberación de profagos llega a ser prácticamente completa, mientras que en L. casei los valores de escisión de A2 se quedan muy por debajo de los que se obtienen a concentraciones mayores del antibiótico (Figs. 2 y 4) .
Paradójicamente, la liberación de los profagos de A2 se inhibe a concentraciones de mitomicina C menores que las necesarias para obtener el mismo efecto con lambda [a partir de 5.000 ng/ml la inhibición es evidente en el primer caso, mientras en el segundo, a 20.000 ng/ml aún se produce una escisión prácticamente general (Figs. 2 y 4) ]. Nuevamente, la dificultad de entrada del genotóxico puede explicar este comportamiento. En L. casei se alcanzan rápidamente concentraciones intracelulares tóxicas, mientras que en E. coli, la penetración más lenta hace que no se alcancen dichos niveles al menos hasta después de que se produzca la inducción del profago.
En términos prácticos, los resultados expuestos tienen dos consecuencias:
1) Los datos representados en la Fig. 2 permiten simplificar la metodología a aplicar en la cuantificación del efecto genotóxico, cuando ésta se hace con cultivos de L. casei lisogénico. Sería suficiente con tomar una única muestra del cultivo tratado, siempre que se hiciera después de las tres horas de incubación, ya que los valores de Ct permanecen esencialmente constantes a partir de ese momento y reflejan el efecto de cada concentración del agente sobre la escisión del profago A2 (Fig. 5) . En el caso de lambda, sin embargo, únicamente a la hora de incubación los valores de Ct varían con la concentración del agente genotóxico (Fig. 6) .
2) El tandem E. coli - lambda, sería el más útil a concentraciones muy altas del agente, ya que se detecta el efecto genotóxico cuando la respuesta de L. casei - A2 esta ya completamente bloqueada.
El experimento complementario de microescrutinio (producción de viriones del fago lambda como consecuencia de la inducción de su ciclo lítico) refleja los datos ya comentados para la liberación del ADN aunque, a bajas concentraciones de mitomicina C, el ritmo de aparición de nuevos virus fue muy lento (Fig. 7) .
Ejemplo 3
Detección y análisis del efecto genotóxico de la radiación ultravioleta sobre el ciclo lítico de los fagos A2 y lambda
La luz U.V. ejerció un efecto inductor de la respuesta SOS, determinada como liberación de los profagos, muy notable tanto en L. casei como en E. coli, incluso a intensidades tan bajas como 1 J/m2 (Figs. 8 y 9, respectivamente) . Dicha respuesta se mantuvo en valores máximos independientemente de la intensidad de la radiación aplicada (hasta, al menos, 50 J/m2) . La evaluación de la producción de nuevos fagos dio resultados semejantes (Figs. 10 y 11) .
Ejemplo 4
Detección y análisis del efecto genotóxico de la ciprofloxacina y el etopósido sobre el ciclo lítico de los fagos A2 y lambda
La ciprofloxacina provoca la inducción del fago lambda pero no la de A2 (Fig. 12, y 13) debido a que la cepa de L. casei lisogénica es resistente al antibiótico, presumiblemente porque presenta una ADN - girasa a la que no se puede unir. La liberación del profago parece ser más sensible que la generación de nuevos viriones (compárense las curvas obtenidas a la concentración 10 nM de ciprofloxacina) .
El etopósido indujo el ciclo lítico del fago A2 pero no el de lambda, porque E. coli es impermeable al quimioterápico (Figs 14 y 15) .
Estos últimos ejemplos ilustran la capacidad de la utilización combinada de las dos asociaciones fago - bacteria para aumentar el rango de compuestos genotóxicos evaluables.
En la tabla 1 se presenta el efecto inductor de una serie de compuestos en relación con la mitomicina C.
TABLA 1 Capacidad inductora de la respuesta SOS de diversos agentes genotóxicos, medida por la liberación de los profagos A2 y lambda de cultivos lisogénicos de L. casei y E. coli respectivamente 
