Inhibidores de la óxido nítrico sintasa (NOS) con actividad neuroprotectora.
Sector de la técnica
La presente invención se refiere al diseño, síntesis y actividad biológica de compuestos químicos.
Objeto de la invención
Esta invención tiene por objeto la síntesis de una nueva familia de compuestos químicos identificados como 5- (2, 5-disustituido-fenil) -1-disustituido-1H- pirrol-2-N- sustituido-carboxamida, que muestran interesantes propiedades biológicas como inhibidores de distintas isoformas de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS) y que, consecuentemente, encuentran aplicación en el tratamiento de procesos inflamatorios y por su capacidad neuroprotectora, para poder ser usados en animales y humanos.
Estado de la técnica
Óxido Nítrico: Consideraciones generales
El óxido nítrico (NO) es un radical libre en estado gaseoso, reconocido como un mensajero fisiológico con importantes funciones reguladoras en los sistemas nervioso, inmune y cardiovascular.
El NO es vasodilatador y es el mediador responsable de la relajación vascular [Waldman, S. A.; Murad, F. Pharmacol. Rew., 1987, 39, 163]. Una producción insuficiente de NO podría ser la causa de accidentes cardiovasculares severos, incluidas ciertas formas de hipertensión [Kojda, G.; Harrison, D. Cardiovascular Research, 1999, 43, 562-571].
Además de su papel en la musculatura vascular lisa, el NO inhibe la agregación plaquetaria [Radonski, M.W.; Palmer, R.M.; Moncada, S. Brit. J. Pharmacol., 1987, 92, 181].
Por otro lado, a pesar de su simplicidad, el NO es un importante neurotransmisor que interviene en el proceso de señalización especializada de regulación y comunicación neuronal.
Por último, el NO actúa como agente citotóxico en el sistema inmune, a través de su rápida reacción con otras especies de oxígeno reactivas, especialmente el peroxinitrito [Radi, R.; Bedkman, J.S.; Bush, K.M.; Freeman, B.A. J. Biol. Chem., 1991, 266, 4244].
Biosíntesis de Óxido Nítrico
El NO se sintetiza en diversos tipos de células, tales como neuronas [Bredt, D.S..; Sny der, S.H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1990, 87, 682] células endoteliales [Pollock, J.S.; Förstermann, U.; Mitchel, J.A.; Warner, T.D.; Schmidt, H.W.; Nakane, M.; Murad, F. Proc. Natl. acad. Sci. USA., 1991, 88, 10480] y macrófagos [Hevel, J.M.; White, K.A.; Marietta, M.A. J. Biol. Chem., 1991, 266, 22789], mediante la acción de una familia de isoenzimas denominadas óxido nítrico sintasa (NOS) .
El precursor biológico del NO es la L-arginina. Se acepta que el NO se genera por oxidación del nitrógeno guanidínico terminal de la L-arginina en una reacción que implica dos fases: en la primera de ellas se forma un intermedio identificado como Nw- hidroxi-L-arginina (NHA) , que evoluciona para dar los productos finales del proceso, L-citrulina y NO [Griffith, O. W.; Stuehr, D. J., Annu. Rew. Physiol., 1995, 57, 707], siendo necesaria la participación del cofactor nicotinamida adenosina dinucleótido (NADPH) [Kwon, N.S.; Nathan, C.F.; Stuehr, D.J. J. Biol. Chem., 1989, 264, 20496].
Isoformas de Óxido Nítrico Sintasa (NOS)
Se había postulado la existencia de tres isoenzimas de la NOS responsables de la síntesis de NO los diferentes tejidos y células. Cada una de las tres isoformas presenta propiedades bioquímicas similares y catalizan la misma reacción, pero difieren en su estructura primaria, pesos moleculares y funciones. Su denominación está en función de dónde se localizan: nNOS o neuronal, iNOS o inducible y eNOS o endotelial.
No obstante, se han descubierto otras dos isoformas en la mitocondria; una constitutiva (mtcNOS) , similar a la forma nNOS, y otra inducible (mtiNOS) , similar a la iNOS [López, L.C.; Escames, G.; Tapias, V.; Utrilla, M. P.; León, J.; Acuña-Castroviejo, D. Int. J. Biochem. Cell Biol. en prensa, 2005].
Las isoformas eNOS y nNOS requieren de la unión a la calcio-calmodulina (CaCaM) para su activación [Dawson, T.M.; Synder, S.H. J. Neurosci., 1994, 14, 5147] y son constitutivas en el organismo. En cambio, en la iNOS, la calmodulina (CaM) es una subunidad de la enzima, la cual se activa fuertemente a niveles de calcio basales. Diversos agentes inductores como los lipopolisacáridos bacterianos (LPS) y citoquinas, entre las que se destacan el interferón Y (IFN) y el factor de necrosis tumoral α (TNF) , inducen la formación de iNOS [Nathan, C.; Xie, QW. Cell., 1994, 78, 915].
La nNOS se encuentra en el tejido neuronal [Bredt, D. S.; Hwang, P. M.; Glatt, C. E.; Lowestein, C.; Reed, R. R.; Sny der, S. H. Nature. 1991, 351, 714.]; el tejido neuronal periférico tipo NANO (neuronas no adrenérgicas/no colinérgicas) , esquelético, en el páncreas y en algunas células epiteliales [Bredt, D. S.; Sny der, S. H. Annu. Rev. Biochem., 1994, 63, 175].
La eNOS se encuentra en el endotelio vascular [Griffith, O. W.; Stuehr, D. J. Annu. Rew. Physiol., 1995, 57, 707], en células epiteliales tubulares de riñón [Tracey, W. R.; Pollock, J. S.; Murad, F.; Nakane, M.; Förstermann, U. Am. J. Physiol., 1994, 266-C 22], en plaquetas [Sase, K.; Mitchel, T. Trends in Cardiovascular Medicine., 1997, 7, 28] y en neuronas tipo CAI del hipocampo [Odell, T. J.; Huang, P. L.; Dawson, T. M.; Dinerman, J. L.; Sny der S. H.; Kandel, E. R.; Fishman, M. C. Science., 1994, 265, 542], donde ejerce un papel presumiblemente ligado a fenómenos relacionados con los procesos de memoria y aprendizaje [Williams, J. H. J. Lipid Mediators Cell. Signalling., 1996, 14, 331]. Una deficiencia en esta isoforma estaría relacionada con la hipertensión y con la patología vascular [Awolesi, M. A.; Sessa, W, C.; Sumpio, B. E. J. Clin. Invest., 1995, 96, 1449].
La isoforma inducible (iNOS) ha sido identificada en macrófagos, [Yui, Y.; Hattori, R.; Kosuga, K.; Eizawa, H.; Hiki, K, ; Kawai, C. J. Biol. Chem., 1991, 266, 12544.] hepatocitos [Geller, D. A.; Lowestein, C. J.; Shapiro, R. A.; Nussler, A. K.; Disil Vio, M.; Wang, S. C.; Nakayama, D. K.; Simmon, R. L.; Sny der, S. H.; Billiar, T. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1993, 90, 3491.], endotelio vascular [Gross, S. S.; Levi, R. J. Biol. Chem., 1992, 267, 25722], miocardio [Schulz, R.; Nava, E.; Moncada, S. Br. J. Pharmacol., 1992, 105, 575], microglía [Liu, J.; Zhao, M. L.; Brosnan, C. F.; Lee, S. C. J. Immunol., 1996, 157, 3569], y astrocitos [Arbones, M. L.; Ribera, J.; Agullo, L.; Baltrons, M. A.; Casanovas, A.; Riveros Moreno, V.; Garcia, A. Glia., 1996, 18, 224] una vez expresada, la iNOS se encuentra activada permanentemente y proporciona una fuente de NO con alto rendimiento, constituyendo una respuesta del sistema inmune frente a agentes invasores patógenos o células tumorales.
Por último, las isoformas mitocondriales (mtNOS) se encuentran en la membrana interna y matriz de la mitocondria, próximas a la cadena de transporte electrónico [López, L. C.;Escames, G.; Tapias, V.; Utrilla, M. P.; León, J.; Acuña-Castroviejo, D. Int. J. Biochem. Cell Biol. en prensa, 2005.] [Giulivi, C.; Poderoso, J. J.; Boveris, A. J. Biol. Chem., 1998, 273, 11038-11043]. El NO sintetizado por estas isoformas participa en la regulación fisiológica de la respiración (mtcNOS) , o en la redistribución de oxígeno dentro de la célula [Acuña-Castroviejo, D.; Escames, G.; López, L. C.; Hitos, A. B.; León, J. Endocrine 27 (2) :159-168, 2005.] Además, el aumento de NO en la mitocondria (mtiNOS) está relacionado con el proceso de apoptosis.
Las isoenzimas NOS son complejas y actúan como dímeros. Cada monómero contiene un dominio oxigenasa en su extremo N-terminal y un dominio reductasa en su extremo C-terminal, interconectados a través de la cadena de transporte electrónico (CTE) . El dominio reductasa es homólogo al citocromo P450 en un 60%. Las tres isoenzimas contienen sitios de unión específicos en este dominio para los grupos prostéticos flavina mononucleótido (FMN) , flavina adenina dinucleótido (FAD) , NADPH y CaCaM. El dominio oxigenasa contiene sitios de unión para tetrahidrobiopterina (BH4) , para una protoporfirina XI (grupo hemo) y para la L-arginina. [Bredt, D. S.; Sny der, S. H. Annu. Rev. Biochem., 1994, 63, 175.]
Neurodegeneración y enfermedades inflamatorias
Las enfermedades neurodegenerativas producidas por la muerte neuronal progresiva (Parkinson, Alzheimer, Huntington y la esclerosis lateral amiotrófica, etc.) representan uno de los problemas sanitarios y económicos más frecuentes. [Dorheim, M.A.; Tracey, W.R.; Pollock, J.S.; \hbox{Grammas, P. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 205, 659.].}
Entre los mecanismos moleculares conducentes a la muerte neuronal destaca el aumento de calcio intracelular, que conduce a la activación de proteasas intracelulares, lipasas, nucleasas y de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS) , la cual cataliza la formación de óxido nítrico (NO) . [Siesjo, B.K.; Bengtsson, F. J. Cereb. Blood. Flow. Metab., 1989, 9, 127-149], Otra causa de degeneración es la excesiva formación de radicales libres [Jaswinder, S.; Christopher, A.S. Brain Research Rewiev., 1997, 25, 335-358.]
Actualmente, se están estudiando antagonistas de los receptores de glutamato, depuradores de radicales libres y bloqueantes de los canales voltaje-dependientes, buscando agentes terapéuticos selectivos que ayuden a luchar contra la neurodegeneración. Se considera esencial el desarrollo de nuevos fármacos que ejerzan su efecto en sitios comunes y cruciales de la complicada cascada neurotóxica para que manifiesten una neuroprotección eficaz [Shimojo, M.; Takasugi, K.; Yamamoto, I.; Funato, H.; Mochizuki, H.; Shinichi, K. Brain Research., 1999, 815, 131 - 139].
La investigación y desarrollo de agentes neuroprotectores eficaces pasa por la síntesis de nuevos fármacos que interfieran en algún punto de la compleja señalización química de la que forma parte la NOS, incluyendo la inhibición de la propia enzima. Se sabe que el NO participa en la regulación de diversas funciones fisiológicas y que una exposición prolongada al mismo inhibe una gran cantidad de enzimas y procesos, como la aconitasa, la fosforilación oxidativa y la producción de adenosina trifosfato (ATP) . Por otro lado, la inhibición que provoca sobre la ribonucleótido reductasa produce una alteración en la síntesis de ADN.
El óxido nítrico actúa como neurotransmisor en el SNC, regulando diferentes procesos enzimáticos. Se degrada por oxidación o por transformación en compuestos tales como el superóxido o la oxihemoglobina. Todo esto confirma que no se trata de un neurotransmisor clásico [Tzeng, T.B.; Fung, H.L. J. Pharmacokinet Biopharm. 1992, 20, 227-251] [Lancaster, J.R. Neuropharmacology, 1994, 33, 1235-1244]
Su papel fisiológico es el de neurotransmisor retrógrado, viajando desde la membrana postsináptica a la presináptica, y está involucrado en la actividad neuronal a largo plazo (LTP) ; por ejemplo, en los procesos de plasticidad neuronal, aprendizaje y memoria. Este papel se bloquea con inhibidores de la NOS o mediante hemoglobina que elimina NO [Vanderkooi, J.M.; Wright, W.W.; Erecinska, M. Biochem. Biophys. Acta, 1994, 1207, 249-254] [Schuman, E.M.; Madison, D.V. Science, 1991, 254, 1503-1506].
Además, puede ejercer un papel neurotóxico desencadenando diferentes patologías [Dawson, T.M.; Dawson, V.L.; Sny der, S.H. Ann. Neurol., 1992, 32, 297]. Un incremento de la producción de glutamato estimula los receptores NMDA (N-metil-D-Aspartato) y provoca una entrada masiva de iones calcio en las células, los cuales activan las enzimas NOS a través de la activación de la CaCaM. El NO difunde fuera de la célula y entra en la célula presináptica, donde se une a la enzima guanilato ciclasa y provoca una nueva síntesis de glutamato. Cuando se produce una activación persistente de este mecanismo se produce la neurotoxicidad, que puede corregirse mediante inhibidores de NOS. Este mecanismo está sobreestimulado en diferentes enfermedades neurodegenerativas [Meldrum, B.; Garthwaite, J. Trends Pharmacol. Sci., 1990, 11, 379]
La excitotoxicidad del glutamato produce una reacción inflamatoria en el tejido neuronal, como consecuencia de la inducción de la iNOS, lo que aumenta el NO y produce más excitotoxicidad y muerte neuronal [Liberatore, G.T, Jackson-Lewis, V, Vukosavic, S., Mandir, A.S., Vila, M. Mcauliffe, W.G., Dawson, V.L., Dawson, T.M., Przedborski, S. Nature Medicine 1999, 5, 1403-1409].
Existen otros desórdenes neurológicos en los que está implicado el NO, como son nitrosilación de ácidos nucléicos, rotura del ADN e inactivación de enzimas con centros ferrosulfurados que alteran los procesos energéticos celulares [Gross, S. S.; Wolin, M. S. Annu. Rev. Physiol., 1995, 57, 737-769].
Otras patologías en las que se ha demostrado la implicación de niveles excesivos de NO son la sepsis y el choque séptico [Petros, A.; Bennett, D.; Valiance, P. Lancet., 1991, 338, 1157], así como la artritis reumatoide [McCarney-Francis, N.; Allen, J.B.; Mizel, D.E.; Albina, J.E.; Xie, Q.; Nathan, C.F.; Wahl, S.M. J. Exp. Med., 1993, 178, 749].
Una producción insuficiente de NO provoca una disfunción endotelial y podría ser la causa de accidentes cardiovasculares severos, incluidas ciertas formas de hipertensión [Kojda, G.; Harrison, D. Cardiovascular Research, 1999, 43, 562-571].
Otra acción directa del NO serían la estimulación de la ciclooxigenasa en los macrófagos, bloqueo de varias enzimas mitocondriales (citotoxicidad) y la actuación como neurotransmisor en diversas áreas del SNC (sistema límbico, áreas olfatorias, nociceptivas y de memoria) o del SNP [Waldman, S. A.; Murad, F., Pharmacol. Rew., 1987, 39, 163]. Dichas vías intervienen en procesos de vasodilatación neurogénica y su actividad neuromuscular en el tracto gastrointestinal, genitourinario y respiratorio.
Enfermedades tan diversas tienen un factor común en su causa: la producción excesiva y descontrolada de NO. El NO se produce en diversos tipos de células a partir del aminoácido L-arginina, y dependiendo de dónde se produzca la disfuncionalidad de las isoformas de la enzima NOS, las consecuencias serán diferentes.
Todo esto da idea de la importancia que tiene la búsqueda de inhibidores de la NOS, tanto para su utilidad terapéutica en el campo clínico como para definir el papel exacto de sus distintas isoformas en el sistema biológico [Lee, Y.; Martasek, P.; Roman, J.L.; Masters, B.S.S.; Silverman, R.B. Imidazol-containing amoni acids as selective inhibitors of nitric oxide synthases. Biorg. Med. Chem., 1999, 7, 1941-1951].
Descripción de la invención
Compuestos objeto de la invención
Los compuestos objeto de esta invención corresponden a los representados por la fórmula general A.
Dentro de la familia representada por la fórmula general A, los compuestos se individualizan mediante los descriptores estructurales R1, R2, R3 y R4.
El sustituyente R1 es un grupo amino (-NH2) o nitro (-NO2) . El sustituyente R2 puede ser cualquier grupo funcional, tal como -H, OCH3, -Cl, etc. El sustituyente R3, R4 y R5 presentan naturaleza variada ya que pueden ser hidrógeno, cualquier grupo alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.) , cicloalquilo (ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc.) , fenilo o arilo, fenilalquilo o arilalquilo, o bien fenilcicloalquilo o arilcicloalquilo.
Síntesis general de los compuestos de objeto de la invención
Síntesis general de los compuestos de la familia A: 5- (2-aminofenil) -1H- pirrol-2-sustituido-carboxamidas [ó 5- (2-amino-5-clorofenil) -1H-pirrol-2-sustituido-carboxamidas ó 5- (2-amino-5-metoxifenil) -1H- pirrol-2-sustituido-carboxamidas]
Se adicionan 0.200-0.400 g (3.613-7.227 mmol) de hierro en polvo y 0.100-0.200 g (0.607-1.321 mmol) de sulfato ferroso, sobre una suspensión de 0.607-1.321 mmol de 5- (2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-alquilcarboxamida [ó 5- (5-cloro-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-alquilcarboxamida ó 5- (5-metoxi-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-alquilcarboxamida] en 15-30 ml de agua, a 70-100ºC. La mezcla de reacción se mantiene en agitación a esta temperatura entre 3 y 5 horas. Transcurrido dicho tiempo, se deja enfriar a temperatura ambiente, se filtra a través de celita y ésta se lava varias veces con diclorometano. La fase acuosa se extrae con diclorometano (3 × 15 ml) y acetato de etilo (3 × 15 ml) . Los extractos orgánicos reunidos se lavan con salmuera, se secan (Na2SO4) y concentran al rotavapor. El sólido resultante se purifica mediante recristalización de éter etílico/hexano para dar la amida aromática correspondiente con un rendimiento variable, dependiendo de cada compuesto en cuestión.
El producto de partida, 5- (2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-alquilcarboxamida [o 5- (5-cloro-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-alquilcarboxamida ó 5- (5-metoxi-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-alquilcarboxamida], se prepara a su vez de la siguiente forma: A una solución de 2-4 mmol de la alquilamina apropiada en 3-6 ml de CH2Cl2 seco, provista de un sistema de agitación y bajo atmósfera de argón, se le adicionan 3-6 mmol de trietilamina, se mantiene 20-50 minutos en agitación a temperatura ambiente para adicionarle, a continuación, 1-2 mmol de cloruro de 5- (2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-carbonilo [ó cloruro de 5- (5-cloro-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-carbonilo, ó cloruro de 5- (5-metoxi-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-carbonilo], disuelto también en 10-20 ml de CH2Cl2 seco. Se mantiene la mezcla en dichas condiciones durante 3-6 horas, se lava con agua varias veces y las fases acuosas se extraen con CH2Cl2. Las fases orgánicas combinadas se secan (Na2SO4) , se filtran y concentran al rotavapor.
El cloruro de ácido, a su vez, se prepara de la siguiente forma: Se disuelven 1-2 mmol de ácido 5- (2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-carboxílico [ó ácido 5- (5-cloro-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-carboxílico ó ácido 5- (5-metoxi-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-carboxílico] en CH3CN, seguidamente se le adicionan 11-22 mmol de SOCl2, que supone un gran exceso. La mezcla de reacción se mantiene en agitación y a una temperatura de 40-80ºC durante 2-10 horas. Transcurrido el tiempo se concentra al rotavapor el CH3CN y el SOCl2 en exceso, para obtener un sólido marrón oscuro correspondiente al cloruro de ácido que, por ser muy inestable y reactivo, debe utilizarse inmediatamente sin ser aislado.
Actividad biológica como inhibidores de las isoenzimas nNOS e iNOS
La principal importancia de los compuestos objeto de la invención es su actividad biológica como inhibidores de las isoenzimas nNOS e iNOS. Para el estudio de su capacidad de inhibición de las enzimas nNOS e iNOS se han seguido métodos experimentales publicados previamente (Carrión, M. D.; Camacho, M. E.; León, J.; Escames, G.; Tapias, V.; Acuña-Castroviejo, D. Gallo, M. A.; Espinosa, A. Tetrahedron 2004, 60 4051-4069) . Los ensayos se han realizado a concentraciones 1 mM del inhibidor y los resultados se expresan como porcentaje de inhibición a esa concentración.
Las siguiente tabla indica, a título de ejemplo y no con carácter excluyente, los resultados obtenidos en algunos de los compuestos objeto de esta invención.
Modos de realización de la invención
A título de ejemplo ilustrativo, pero no limitativo, se representan algunos compuestos concretos de esta familia:
Para familia A se representan los compuestos denominados GRQF-121 [5- (2-amino-5-metoxifenil) -1H- pirrol-2-metilcarboxamida, para el que R1 = NH2, R2 = OCH3, R3 = CH3 y R4 = R5= H], y GRQF-134 [5- (2-amino-5-clorofenil) -1H- pirrol-2-butilcarboxamida, para el que R1 = NH2, R2 = Cl, R3 = CH2CH2CH2CH3 y R4 = R5= H].
Modos preferidos de realización
Los ejemplos se proponen a continuación a modo ilustrativo u orientativo, sin que estos sean limitativos:
Ejemplo nº 1
5- (2-aminofenil) -1H- pirrol-2-etilcarboxamida GRQF-112
Características estructurales del compuesto intermedio: 5- (2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-etilcarboxamida: p.f. 207-208ºC; 1H-RMN (300 MHz, DMSO) : δ 11.86 (sa, 1H, H-1) ; 8.10 (t, 1H, -CONH-, J = 5.3 Hz) ; 7.91 (d, 1H, H-3', J3'-4' = 8.1 Hz) ; 7.66 (m, 2H, H-6', H-5') ; 7.51 (pdt, 1H, H-4', J4'-3' = J4'-5' = 8.1 Hz, J4'-6' = 2.7 Hz) ; 6.80 (pt, 1H, H-3, J3-4 = 3.0 Hz) ; 6.15 (pt, 1H, H-4, J4-3 = 3.0 Hz) ; 3.24 (m, 2H, -CH2CH3) ; 1.10 (t, 3H, -CH2CH3, J = 7.1 Hz) . 13C-RMN (75 MHz, DMSO) : δ 160.01 (-CONH-) ; 147.86 (C-2') ; 132.31 (C-5') ; 131.22 (C-6') ; 128.85 (C-5) ; 128.57 (C-2) ; 128.17 (C-4') ; 126.02 (C-1') ; 123.85 (C-3') ; 110.77 (C-4) ; 109.13 (C-3) ; 33.28 (-CH2CH3) ; 14.98 (-CH2CH3) . HR LSIMS: Calculado para C13H13N3O3Na (M + Na) + 282.085461; encontrado 282.085546 (desviación -0.3 Pm) .
Características estructurales del compuesto 5- (2-aminofenil) -1H- pirrol-2-etilcarboxamida GRQF-112: Rendimiento 48%. P.f. 146-145ºC. 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) : δ 10.85 (sa, 1H, H-1) ; 7.27 (d, 1H, H-6', J6'-5' = 7.7 Hz) ; 7.11 (t, 1H, H-4', J4'-5' = 7.5 Hz, J4'-3' = 8.0 Hz) ; 6.80 (t, 1H, H-5', J5'-4' = 7.5 Hz, J5'-6' = 7.7 Hz) ; 6.75 (d, 1H, H-3', J3'-4' = 8.0 Hz) ; 6.61 (pt, 1H, H-3, J3-4 = 3.1 Hz, ) ; 6.41 (pt, 1H, H-4, J4-3 = 3.1 Hz) ; 5.95 (sa, 1H, -CONH-) ; 3.44 (m, 2H, -CH2CH3) ; 1.22 (t, 3H, -CH2CH3, J = 7.2 Hz) . 13C-RMN (100 MHz, CDCl3) : δ 161.03 (-CONH-) ; 143.70 (C-2') ; 133.19 (C-5) ; 128.87 (C-6') ; 128.81 (C-4') ; 126.10 (C-2) ; 119.16 (C-5') ; 118.39 (C-1') ; 116.67 (C-3') ; 109.68 (C-3) ; 108.90 (C-4) ; 34.40 (-CH2CH3) ; 15.18 (-CH2CH3) . HR LSIMS: Calculado para C13H15N3ONa (M + Na) + 252.111282; encontrado 252.111355 (desviación -0.3 ppm) .
Ejemplo nº 2
5- (2-aminofenil) -1H-pirrol-2-bencilcarboxamida GRQF-119
Características estructurales del compuesto intermedio: 5- (2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-bencilcarboxamida: P.f. 137-138ºC. 1H-RMN (300 MHz, CD3OD) : δ 7.82 (d, 1H, H-3', J3'-4' = 8.1 Hz) ; 7.65 (m, 2H, H-5', H-6') ; 7.51 (pdt, 1H, H-4', J4'-3' = J4'-5' = 8.1 Hz, J4'-6' = 2.3 Hz ) ; 7.32 (m, 5H, H-2 - H-6bencilo) ; 6.88 (d, 1H, H-3, J3-4 = 3.8 Hz) ; 6.26 (d, 1H, H-4, J4-3 = 3.8 Hz) ; 5.78 (sa, 1H, -CONH-) ; 4.54 (s, 2H, -CH2- ) . 13C-RMN (75 MHz, CD3OD) : 8 160.20 (-CONH-) ; 147.86 (C-2') ; 139.77 (C-1bencilo) ; 132.34 (C-5') ; 131.26 (C-6') ; 129.20 (C-5) ; 128.26 (C-4') ; 128.16 (C-2, C-6bencilo) ; 128.16 (C-2) ; 127.10 (C-3bencilo, C-5bencilo) , 126.63 (C-4bencilo) ; 125.95 (C-1') ; 123.87 (C-3') ; 111.21 (C-4) ; 109.24 (C-3) ; 41.84 (-CH2- ) . HR LSIMS: Calculado para C18H15N3O3Na (M + Na) + 344.101111; encontrado 344.102048 (desviación -2.7 ppm) .
Características estructurales del compuesto 5- (2-aminofenil) -1H- pirrol-2-bencilcarboxamida GRQF-119: Rendimiento 52%. P.f. 178-180ºC. 1H-RMN (400 MHz, (CD3) 2CO) : 8 11.40 (sa, 1 H, H-1) ; 8.55 (t, 1H, -CONH-, J = 5.9 Hz) ; 7.26 (m, 6H, H-6', H-2 - H-6bencilo) ; 7.27 (pdt, 1H, H-4', J4'-6' = 1.4 Hz, J4'-5' = 7.5 Hz, J4'-3' = 8.0 Hz) ; 6.89 (d, 1H, H-3, J3-4 = 3.5 Hz) ; 6.82 (d, 1H, H-3', J3'-4' = 8.2 Hz) ; 6.68 (t, 1H, H-5', J5'-4' = 7.5 Hz, J5'-6' = 7.7 Hz) ; 6.35 (d, 1H, H-4, J4-3 = 3.5 Hz) ; 5.75 (sa, 2H, -NH2) ; 4.38 (d, 2H, -CH2- , J = 6.0 Hz) . 13C-RMN 100 MHz, (CD3) 2CO) : δ 160.36 (-CONH-) ; 140.00 (C-2' y C-1bencilo) ; 132.45 (C-5) ; 129.06 (C-6') ; 128.31 (C-2 y C-6bencilo) ; 128.00 (C-4') ; 127.27 (C-3, C-5bencilo) ; 126.76 (C-4B, ) , 126.56 (C-2) ; 118.43 (C-5' y C-1') ; 116.68 (C-3') ; 111.88 (C-3) , 108.32 (C-4) ; 41.98 (-CH2- ) . HR LSIMS: Calculado para C18H17N3ONa (M + Na) + 314.126932; encontrado 314.127148 (desviación -0.7 ppm) .
Análisis Elemental (C18H17N3O) : Teórico (%) C 74.21, H 5.88, N 14.42; Obtenido (%) C 73.95, H 5.53, N 14.09.
Ejemplo nº 3
5- (2-amino-5-metoxifenil) -1H- pirrol-2-metilcarboxamida GRQF-121
Características estructurales del compuesto intermedio 5- (5-metoxi-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-metilcarboxamida: P.f. 137-139ºC. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) : δ 10.60 (sa, 1H, H-1) ; 7.90 (d, 1H, H-3', J3'-4' = 9.1 Hz) ; 6.99 (d, 1H, H-6', J6'-4' = 2.8 Hz) ; 6.87 (dd, 1H, H-4' J4'-3' = 9.1 Hz, J4'-6' = 2.8 Hz) ; 6.54 (pt, 1H, H-3, J3-4 = 3.7 Hz) ; 6.30 (pt, 1H, H-4, J4_3 = 3.7 Hz) ; 6.02 (m, 1H, -CONH-) ; 3.86 (s, 3H, -OCH3) ; 2.85 (d, 3H, -CH3, J = 4.9 Hz) . 13C-RMN (75 MHz, CDCl3) : δ 162.50 (C-5') ; 161.72 (-CONH-) ; 141.68 (C-2') ; 130.37 (C-5) ; 129.55 (C-1') ; 127.47 (C-2) ; 127.26 (C-3') ; 116.39 (C-6') ; 113.55 (C-4') ; 111.12 (C-4) ; 109.71 (C-3) ; 56.05 (-OCH3) ; 26.21 (-CH3) . HR LSIMS: Calculado para C13H13N3O4Na (M + Na) + 298.080376; encontrado 298.080186 (desviación 0.6 ppm) .
Características estructurales del compuesto 5- (2-amino-5-metoxifenil) -1H- pirrol-2-metil-carboxamida GRQF-121: Rendimiento 48%. P.f. 202-204ºC. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) : δ 10.05 (sa, 1H, H-1) ; 6.87 (d, 1H, H-6', J6'-4' = 1.5 Hz) ; 6.72 (m, 2H, H-3', H-4') ; 6.58 (dd, 1H, H-3, J3-4 = 3.6 Hz, J3-1 = 2.4 Hz) ; 6.42 (dd, 1H, H-4, J4-3 = 3.6 Hz, J4-1 = 2.7 Hz) ; 5.98 (ps, 1H, -CONH-) ; 3.75 (s, 3H, -OCH3) ; 2.95 (d, 3H, -CH3, J = 5.3 Hz) . 13C-RMN (75 MHz, CDCl3) : δ 161.79 (-CONH-) ; 153.51 (C-5') ; 136.77 (C-2') ; 133.28 (C-5) ; 126.07 (C-2) ; 119.98 (C-1') ; 118.96 (C-3') ; 114.94 (C-4') ; 113.64 (C-6') ; 109.77 (C-3) ; 109.03 (C-4) ; 55.90 (-OCH3) ; 26.27 (-CH3) . HR LSIMS: Calculado para C13H15N3O2Na (M + Na) + 268.106197; encontrado 268.106589 (desviación -1.5 ppm) . Análisis elemental (C13H15N3O2) : Teórico (%) C 63.66, H 6.16, N 17.13; Obtenido (%) C 63.02, H 5.74, N 16.90.
Ejemplo nº 4
5- (2-amino-5-clorofenil) -1H-pirrol-2-ciclopropilcarboxamida GRQF-135
Características estructurales del compuesto intermedio 5- (5-cloro-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-ciclopropilcarboxamida: P.f. 164-166ºC. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) : δ 10.50 (sa, 1H, H-1) ; 7.74 (d, 1H, H-3', J3'-4' = 8.7 Hz) ; 7.58 (ps, 1H, H-6') ; 7.37 (dd, 1H, H-4' J4'-3' = 8.7 Hz, J4'-6' = 1.4 Hz) ; 6.52 (sa, 1H, H-3) ; 6.34 (sa, 1H, H-4) ; 6.09 (sa, 1H, -CONH-) ; 2.78 (m, 1H, H-1cicloprop.) ; 0.78- 0.57 (m, 4H, H-2, H-3cicloprop.) . 13C-RMN (75 MHz, CDCl3) : δ 163.53 (-CONH-) ; 148.07 (C-2') ; 139.86 (C-5') ; 132.25 (C-6') ; 129.82 (C-5) ; 129.51 (C-4', C-1') ; 129.42 (C-2) ; 127.18 (C-3') ; 113.17 (C-3) ; 111.53 (C-4) ; 24.07 (C-1cicloprop.) ; 8.24 (C-2, C-3cicloprop.) . HR LSIMS: Calculado para C14H12N3O3ClNa (M + Na) + 328.046489, encontrado 328.046513 (desviación -0.1 ppm) .
Características estructurales del compuesto 5- (2-amino-5-clorofenil) -1H- pirrol-2-ciclopropilcarboxamida GRQF-135: Rendimiento 68%. P.f. 166-161ºC. 1H-RMN (300 MHz, (CD3) 2CO) : 6 10.95 (sa, 1H, H-1) ; 7.47 (sa, 1H, CONH-) ; 7.30 (d, 1H, H-6', J6'-4' = 2.5 Hz) ; 7.00 (dd, 1H, H-4' J4'-3' = 8.5 Hz, J4'-6' = 2.5 Hz) ; 6.82 (m, 2H, H-3', H-3) ; 6.41 (dd, 1H, H-4, J4-3 = 3.6 Hz, J4-1 = 2.8 Hz ) ; 4.81 (sa, 2H, -NH2) ; 2.82 (m, 1H, H-1cicloprop.) ; 0.68 - 0.49 (m, 4H, H-2, H-3cicloprop.) . 13C-RMN (75 MHz, (CD3) 2CO) : δ 161.91 (-CONH-) ; 144.18 (C-2') ; 131.68 (C-5) ; 128.28 (C-6') ; 127.70 (C-4') ; 127.37 (C-2) ; 121.47 (C-5') ; 119.42 (C-1') ; 117.32 (C-3') ; 110.64 (C-3) ; 108.75 (C-4) ; 22.46 (C-1cicloprop.) ; 5.59 (C-2, C-3cicloprop.) . HR LSIMS: Calculado para C14H14N3OClNa (M + Na) + 298.072310, encontrado 298.072359 (desviación -0.2) . Análisis Elemental (C14H14N3OCl) : Teórico (%) C 60.98, H 5.12, N 15.24; Obtenido (%) C 60.51, H 4.72, N 14.90.
En resumen, en la presente invención se proponen los compuesto siguientes: Un compuesto que representa la fórmula general A:
Donde,
R1 representa NH2, NO2;
R2 representa H, Cl, OMe, o cualquier otro grupo polar;
R3, R4 y R5 representan, independientemente el uno del otro, un radical seleccionado del grupo formado por H y C1-10 alquilo.
R3, R4 y R5 representan, independientemente el uno del otro, un radical seleccionado del grupo formado por C3-7 cicloalquilo.
R3, R4 y R5 representan, independientemente el uno del otro, un radical seleccionado del grupo formado por fenilo, C1-6- Ph fenilalquilo ó C3-7- Ph fenilcicloalquilo.
R3, R4 y R5 representan, independientemente el uno del otro, un radical seleccionado del grupo formado por arilo, C1-6- arilo arilalquilo ó C3-7- arilo arilcicloalquilo.
En particular los compuestos:
5. (2-aminofenil) -1H-pirrol-2-carboxamida (GRQF-110)
5. (2-aminofenil) -1H-pirrol-2-metilcarboxamida (GRQF-111)
5. (2-aminofenil) -1H-pirrol-2-etilcarboxamida (GRQF-112)
5. (2-aminofenil) -1H-pirrol-2-propilcarboxamida (GRQF-113)
5. (2-aminofenil) -1H-pirrol-2-butilcarboxamida (GRQF-114)
5. (2-aminofenil) -1H-pirrol-2-ciclopropilcarboxamida (GRQF-115)
5. (2-aminofenil) -1H-pirrol-2-ciclobutilcarboxamida (GRQF-116)
5. (2-aminofenil) -1H-pirrol-2-ciclopentilcarboxamida (GRQF-117)
5. (2-aminofenil) -1H-pirrol-2-ciclohexilcarboxamida (GRQF-118)
5. (2-aminofenil) -1H-pirrol-2-bencilcarboxamida (GRQF-119)
5. (2-amino-5-metoxifenil) -1H-pirrol-2-carboxamida (GRQF-120)
5. (2-amino-5-metoxifenil) -1H-pirrol-2-metilcarboxamida (GRQF-121)
5. (2-amino-5-metoxifenil) -1H-pirrol-2-etilcarboxamida (GRQF-122)
5. (2-amino-5-metoxifenil) -1H-pirrol-2-propilcarboxamida (GRQF-123)
5. (2-amino-5-metoxifenil) -1H-pirrol-2-butilcarboxamida (GRQF-124)
5. (2-amino-5-metoxifenil) -1H-pirrol-2-ciclopropilcarboxamida (GRQF-125)
5. (2-amino-5-metoxifenil) -1H-pirrol-2-ciclobutillcarboxamida (GRQF-126)
5. (2-amino-5-metoxifenil) -1H-pirrol-2-ciclopentilcarboxamida (GRQF-127)
5. (2-amino-5-metoxifenil) -1H-pirrol-2-ciclohexilcarboxamida (GRQF-128)
5. (2-amino-5-metoxifenil) -1H-pirrol-2-bencilcarboxamida (GRQF-129)
5. (2-amino-5-clorofenil) -1H-pirrol-2-carboxamida (GRQF-130)
5. (2-amino-5-clorofenil) -1H-pirrol-2-metilcarboxamida (GRQF-131)
5. (2-amino-5-clorofenil) -1H-pirrol-2-etilcarboxamida (GRQF-132)
5. (2-amino-5-clorofenil) -1H-pirrol-2-propilcarboxamida (GRQF-133)
5. (2-amino-5-clorofenil) -1H-pirrol-2-butilcarboxamida (GRQF-134)
5. (2-amino-5-clorofenil) -1H-pirrol-2-ciclopropilcarboxamida (GRQF-135)
5. (2-amino-5-clorofenil) -1H-pirrol-2-ciclobutilcarboxamida (GRQF-136)
5. (2-amino-5-clorofenil) -1H-pirrol-2-ciclopentilcarboxamida (GRQF-137)
5. (2-amino-5-clorofenil) -1H-pirrol-2-ciclohexilcarboxamida (GRQF-138)
5. (2-amino-5-clorofenil) -1H-pirrol-2-bencilcarboxamida (GRQF-139)
5. (2-aminofenil) -1-metil-1H-pirrol-2-carboxamida (GRQF-140)
Cualquiera de los compuestos mencionados posee actividad como inhibidor de cualquiera de las isoformas de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS) , por lo que pueden formar parte, como ingrediente activo en formulaciones farmacéutica, o ser utilizadas en tratamientos de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo envejecimiento, inflamatorias y cancerosas. También pueden servir para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de las mencionadas enfermedades neurodegenerativas.
Además, parte de esta invención son los métodos de preparación de los compuestos de fórmula general A.
En particular, el procedimiento de preparación de la fórmula general A comprende los siguientes pasos:
- Adición de entre 0.200 y 0.400 g (3.613-7.227 mmol) de hierro en polvo y 0.100-0.200 g (0.607-1.321 mmol) de sulfato ferroso, sobre una suspensión de 0.607-1.321 mmol de 5- (2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-alquilcarboxamida [ó 5- (5-cloro-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-alquilcarboxamida ó 5- (5-metoxi-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-alquilcarboxamida] en una cantidad entre 15 m1 y 30 ml de agua, a una temperatura entre 70ºC y 100ºC. - Agitación de la mezcla entre 3 y 5 horas y enfriado posterior a temperatura ambiente (entre 18º y 25º) - Filtrado de la mezcla a través de celita o cualquier otro tipo de filtro y lavado del mismo con diclorometano. - Extracción de la fase acuosa con diclorometano y acetato de etilo. - Lavado con salmuera de los extractos orgánicos reunidos, secado con (Na2SO4) y concentración al rotavapor. - Purificación del sólido resultante mediante recristalización o, alternativamente, purificación del sólido resultante mediante cualquier técnica cromatográfica, para dar la amida aromática correspondiente con un rendimiento variable, dependiendo de cada compuesto en cuestión. Para la de 5- (2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-alquilcarboxamida [ó 5- (5-cloro-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-alquilcarboxamida ó 5- (5-metoxi-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-alquilcarboxamida], precursores necesarios para la preparación de los compuestos fórmula general A, se sigue un procedimiento que comprende los siguientes pasos:
- Adición sobre una solución de 2-4 mmol de la alquilamina correspondiente en 3-6 ml de CH2Cl2 seco, bajo agitación y atmósfera de argón, de los siguientes reactivos y en este orden: a) 3-6 mmol de trietilamina y se mantiene 20-50 minutos en agitación a temperatura ambiente; b) 1-2 mmol de cloruro de 5- (2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-carbonilo [o cloruro de 5- (5-cloro-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-carbonilo, ó cloruro de 5- (5-metoxi-2-nitrofenil) -1H- pirrol-2-carbonilo], disuelto también en 10-20 ml de CH2Cl2 seco. - Agitación de la mezcla durante 3-6 horas y posterior lavado con agua. - Extracción de la fase acuosa con CH2Cl2, secado de las fases orgánicas combinadas (Na2SO4) , filtrado y concentración al rotavapor. - Purificación del crudo resultante mediante cromatografía para dar lugar a los correspondientes precursores con rendimientos variables.
