Procedimiento para la estimación del contenido en globulinas 7S y 11S en habas de soja por cromatografía líquida de alta eficacia en fase inversa de perfusión.
Sector de la técnica
El procedimiento desarrollado permite la estimación del contenido de globulinas 7S y 11S en habas de soja. Supone un gran avance al permitir la posibilidad de estimar separadamente los contenidos de las globulinas mencionadas que poseen distintas características y distintas propiedades funcionales de modo que dicha estimación permitiría seleccionar adecuadamente la variedad de haba de soja más adecuada para la elaboración de un alimento determinado según la propiedad funcional que sea más necesaria para dicha elaboración. Además, el método es muy rápido ya que las condiciones cromatográficas utilizadas permiten obtener el cromatograma de un haba de soja en menos de 3 min.
Estado de la técnica
Las proteínas de soja están constituidas mayoritariamente por las globulinas 7S y 11S. Estas proteínas juegan un papel muy importante cuando la soja se utiliza para elaborar alimentos [Endres, H. G. Soy protein products. Characteristics, nutritional aspects, and utilization. AOAC press and the Soy Protein Council, Champaign, Illinois, 2001]. De hecho, estas proteínas son responsables de la calidad de los alimentos elaborados a base de soja, y en particular de sus propiedades físicas y nutritivas [Mori, T., Utsumi, S., Inaba, H., Kitamura, K., Harada, K., J. Agric. Food Chem., 1981, 29, 20-23] [Murphy, P. A., Resurreccion, P., J. Agric. Food Chem., 1984, 32, 911-915].
Las características de las globulinas 7S y 11S son distintas. La proteína 7S es una glicoproteína mientras que la 11S no lo es. En cuanto a la composición aminoacídica, la proteína 11S es más rica en aminoácidos sulfurados que la 7S. Además, la globulina 7S tiene un mayor carácter antioxidante que la globulina 11S. Además de estas características nutritivas diferentes, también las proteínas 7S y 11S tienen distintas propiedades funcionales [Murphy, P. A., Resurreccion, P., J. Agric. Food Chem., 1984, 32, 911-915] [Bian, Y., Myers, D. J., Dias, K., Lihono, M. A., Wu, S., Murphy, P. A., JAOCS, 2003, 80, 545-549]. La globulina 11S presenta un mayor poder gelificante por lo que es más adecuada en la preparación de alimentos que requieren una gran capacidad de formación de geles, como por ejemplo, el tofu [5-8] mientras que la proteína 7S tiene mayor capacidad que la proteína 11S para formar emulsiones estables, siendo entonces muy adecuada para las aplicaciones que requieren un gran poder emulsionante como es la elaboración de productos cárnicos tratados con calor [9].
Por otra parte, el contenido en globulinas 7S y 11S en habas de soja varía dependiendo de la variedad de que se trate. En general, la relación 11 S/7S suele estar comprendida entre 0.5 y 3.0 [Murphy, P. A., Resurreccion, P., J. Agric. Food Chem., 1984, 32, 911-915] [Hughes, S. A., Murphy, P. A., J. Agric. Food Chem., 1983, 31, 376-379]. Según esta relación, unos cultivos de habas de soja serán más adecuados que otros para determinadas aplicaciones alimentarias 1 [Kim, Y., Wicker, L., Journal of the Science of Food and Agriculture, 2005, 85, 2514-2518] [Mujoo, R., Trinh, D. T., Ng, P. K. W., Food Chem., 2003, 82, 265-273] [Hughes, S. A., Murphy, P. A., J. Agric. Food Chem., 1983, 31, 376-379] [Tezuka, M., Taira, H., Igarashi, Y., Yagasaki, K., Ono, T., J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 1111-1117]. Por tanto, la determinación del contenido en globulinas 7S y 11S presenta un gran interés porque permitiría la selección del cultivo de soja más adecuado para una aplicación alimentaria determinada.
Solo existe en la bibliografía un artículo científico en el que se ha estimado la relación 11S/7S utilizando RP-HPLC pero la separación cromatográfica requería un tiempo de 90 min [Mujoo, R., Trinh, D. T., Ng, P. K. W., Food Chem., 2003, 82, 265-273]. Además, no se han estimado los contenidos de cada una de las fracciones sino sólo su relación.
En esta invención se ha utilizado la RP-HPLC de perfusión para estimar los contenidos en globulinas 7S y 11S en habas de soja ya que las características propias de las fases estacionarias perfusivas permiten la reducción considerable de los tiempos de análisis [García, M. C. Marina, M. L., Torre, M., J. Chromatogr. A. 2000, 880, 169-187].
Descripción de la invención
Los cromatogramas para las habas de soja se han obtenido con en cromatógrafo de líquidos de alta presión provisto de un sistema de desgasificación, una bomba cuaternaria, un compartimento de columna termostatizado, un inyector automático y un detector de absorción ultravioleta de longitud de onda variable y que permitía realizar gradientes de composición de fase móvil. La columna utilizada es una columna con un relleno de perfusión en la modalidad de fase inversa.
La separación se lleva a cabo con una columna perfusiva de fase inversa con unas dimensiones de 50 x 4.6 mm de diámetro interno empaquetada con partículas de poliestireno entrecruzado con divinilbenceno con un tamaño de 10 μm. El método cromatográfico consiste en un gradiente binario lineal: de 5 a 25% de fase móvil (FM) B en 1.7 min y de 25 a 45% FM B en 1.3 min seguido de un gradiente inverso de 45 a 5% FM B en 1 min para equilibrar la columna con las condiciones iniciales entre análisis. Las fases móviles se preparan con agua-ácido trifluoroacético al 0.1% (v/v) (fase móvil A) y acetonitrilo-ácido trifluoroacético al 0.1% (v/v) (fase móvil B) . El flujo de fase móvil es de 3 mL/min, la temperatura 60ºC, y la detección UV se lleva a cabo a 254 nm. Las fases móviles se filtran en filtros PVDF (0.45 μm) y se desgasifican continuamente por vacío. El volumen de inyección es de 20 μL.
La preparación de las disoluciones de las habas de soja se realiza disolviendo la cantidad apropiada de muestra molida en un volumen de agua Milli-Q adecuado seguido de sonicación a 25ºC durante 5 min y centrifugación (3362 g) durante 10 min.
Las ventajas principales del procedimiento inventado son las siguientes:
\ding{226} El procedimiento objeto de la invención es accesible a la mayor parte de los laboratorios de análisis ya que se puede llevar a cabo con una instrumentación básica. \ding{226} El procedimiento supone una separación cromatográfica utilizando una columna de perfusión y es capaz de separar los picos cromatográficos de las proteínas de soja correspondientes a la globulina 11S y a la fracción (globulina 7S + proteínas del suero) en muestras de habas de soja. \ding{226} La medida del área de los picos cromatográficos correspondientes a la globulina 11S y la fracción (globulina 7S + suero) junto con la medida del área total de picos y el valor del contenido total en proteínas del haba de soja, permite estimar el contenido de cada una de las globulinas mayoritarias en el haba de soja. Descripción de la figura
Figura 1
Cromatograma correspondiente a un haba de soja comercial. Los picos 1 a 6 se asignan a la fracción (globulina 7S + suero) y los picos 7 a 9 a la globulina 11S. Condiciones experimentales: Flujo, 3 mL/min; temperatura de la columna, 60ºC: Gradiente, 5 a 25% FM B en 1.7 min y de 25 a 45% FM B en 1.3 min seguido de un gradiente inverso para equilibrar la columna con las condiciones iniciales entre análisis (de 45 a 5% FM B en 1 min) : Fases móviles, agua-ácido trifluoroacético al 0.1% (v/v) (FM A) y acetonitrilo-ácido trifluoroacético al 0.1% (v/v) (FM B) : volumen de inyección, 20 μL: detección, 254 nm.
Modo de realización
Preparación de las muestras
La disolución del haba de soja se prepara disolviendo una cantidad apropiada de la muestra molida en un volumen adecuado de agua Milli-Q. A continuación, dicha disolución se sonica a 25ºC durante 5 min, se centrifuga a 3362 g durante 10 min y el sobrenadante se inyecta en el sistema cromatográfico.
Estimación del contenido de las, fracciones 11S y 7S + suero en el haba de soja
La Figura 1 muestra el cromatograma correspondiente a un haba de soja. Los picos cromatográficos 1 a 6 se asignan a la globulina 7S más otras proteínas minoritarias en la soja (inhibidores de proteasas, lectivas, lipoxigenasa, etc) . A estas proteínas minoritarias se les denomina proteínas del suero ya que se encuentran en el suero que se obtiene tras la precipitación isoeléctrica de las globulinas 11S y 7S. El contenido de la globulina 11S se estima mediante la ecuación siguiente:
Siendo A1, A2, A3, A4, A5 y AT las áreas de los picos 1 al 5 y el área total, respectivamente, y CP el contenido en proteínas de las habas en porcentaje.
El contenido en globulina 7S se estima como fracción 7S + suero asumiendo que el contenido en las proteínas minoritarias es despreciable con respecto al de la globulina 7S. Se calcula a partir de la ecuación siguiente:
Siendo A7, A8 y A9 las áreas de los picos 7, 8 y 9 respectivamente.
A modo de ejemplo, en la tabla I se muestran algunos resultados obtenidos para la estimación de las globulinas 11S y 7S para distintos cultivos de soja.
