b) un medio de detección para el complejo inmunológico. En una realización preferida, el medio de detección usado en el kit de la invención consta de anticuerpos secundarios marcados capaces de reconocer la formación del complejo inmunológico.
En una realización más preferida, el medio de detección usado en el kit de la invención es un reactivo secundario marcado capaz de reconocer la formación del complejo inmunológico.
Otro aspecto más de la invención se refiere al uso de una secuencia de aminoácidos de la invención para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cualquier tipo de reacción alérgica a Anisakis spp. Una realización preferida de la invención se refiere a la composición farmacéutica tal cual.
Como se usa en este documento, "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a cualquier polímero de nucleótidos compuesto por dos o más subunidades que son desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, unidas entre sí por puentes fosfodiéster. "Acidos nucleicos" o "moléculas de ácido nucleico" incluyen ácido desoxirribonucleico (ADN) , ácido ribonucleico (ARN) , oligonucleótidos y fragmentos generados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o por otros métodos tales como ligamiento, escisión, acción de endonucleasas y acción de exonucleasas. Como se usa en este documento, el término "nucleótido" significa una unidad monomérica de ADN o ARN que contiene un resto de azúcar (pentosa) , un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. Las cuatro bases del ADN son adenina ("A") , guanina ("G") , citosina ("C") y timina ("T") . Las cuatro bases del ARN son A, G, C y uracilo ("U") .
Como se usa en este documento, una "molécula de ácido nucleico aislada" es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Dicha molécula de ácido nucleico puede separarse del ADN genómico de una célula, puede producirse usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación por PCR, clonación, etc.) o puede sintetizarse químicamente. La molécula de ácido nucleico aislada puede obtenerse de su fuente natural como gen completo o una parte del mismo capaz de formar un híbrido estable con ese gen. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria.
Como se usa en este documento, "cebador" se refiere a un oligonucleótido natural o sintético (que varia preferiblemente de 15 a 40 nucleótidos de longitud) que puede hibridar con un molde de ADN o ARN complementario para formar un dúplex entre el cebador y el molde. Típicamente, un cebador es un oligodesoxirribonucleótido monocatenario, y sirve como punto de inicio de la síntesis de ácido nucleico por una polimerasa después de la hibridación con una cadena de ADN o ARN.
Como se usa en este documento, la expresión "secuencia de nucleótidos que codifica" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que dirige la expresión de un péptido, polipéptido o proteína específica. Las secuencias de ácido nucleico comprenden la secuencia de la cadena de ADN que se transcribe en ARN y también la secuencia de ARN que se traduce en una proteína. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención incluyen tanto secuencias de ácido nucleico de longitud completa como secuencias truncadas (que no tienen la longitud completa) derivadas de la proteína de longitud completa. También están comprendidas las variantes de la secuencia de nucleótidos que codifican el mismo péptido, polipéptido o proteína que la secuencia nativa, que puede construirse para proporcionar una preferencia de codones en una célula hospedadora específica.
Como se usa en este documento, "el complemento de" se refiere al concepto de una correspondencia inversa entre regiones de dos cadenas polinucleotídicas o entre dos nucleótidos a través de la formación de pares de bases. En consecuencia, una "secuencia de bases complementarias" se refiere a una cadena polinucleotídica en la que todas las bases pueden formar pares de bases con una secuencia de bases en otra cadena polinucleotídica. Como se sabe, un nucleótido de adenina puede formar pares de bases con timina (A-T) o uracilo (A-U) , mientras que un nucleótido de citosina puede formar pares de bases con guanina (C-G) .
Como se usa en este documento, un "vector de expresión" se refiere a un conjunto que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia o gen de interés. De acuerdo con la presente invención, el vector de expresión puede ser cualquier vector de expresión de ADN o ARN capaz de expresar antígenos de Anisakis spp., tal como un plásmido o un fago. Preferiblemente, el vector de expresión de acuerdo con la presente invención es un plásmido (por ejemplo, pQE 31 y pTARGET) .
Como se usa en este documento, el término "plásmido" se refiere a cualquier molécula de ADN circular autónoma capaz de replicarse en una célula independientemente del ADN cromosómico, e incluye tanto los tipos de expresión como los tipos de no expresión.
Como se usa en este documento, el término "recombinante" se refiere a una molécula de ADN compuesta preparada fuera de células vivas uniendo artificialmente fragmentos de ADN naturales o sintéticos a moléculas de ADN que pueden replicarse en una célula viva, o moléculas que son el resultado de su replicación. El término "recombinante" también se refiere en este documento a un péptido, polipéptido o una proteína que se expresa usando una molécula de ADN recombinante.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de forma indistinta en este documento para designar una secuencia lineal de aminoácidos conectados entre sí por enlaces amida entre el grupo alfa-amino de un aminoácido y un grupo alfa-carboxi del aminoácido adyacente. Los polipéptidos con una longitud de veinticinco aminoácidos o menos se consideran "péptidos". Preferiblemente, un polipéptido que está codificado por un cistrón se considera una "proteína".
Como se usa en este documento, la expresión "fragmento de la secuencia de aminoácidos" significa una porción de aminoácidos contiguos del péptido, polipéptido, proteína o secuencia de aminoácidos especificada.
Como se usa en este documento, un "péptido, polipéptido o proteína aislada" es un péptido, polipéptido o proteína que está esencialmente exenta de contaminantes celulares, tales como lípidos, carbohidratos u otras impurezas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. Un péptido, polipéptido o proteína aislada puede purificarse de su medio natural por técnicas cromatográficas convencionales. Los péptidos, polipéptidos y proteínas aisladas también pueden obtenerse por métodos recombinantes, o por síntesis química. Típicamente, se obtiene un "polipéptido sustancialmente purificado" cuando se separa de al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 75% y aún más preferiblemente al menos el 90% de otros polipéptidos con los que coexiste de forma natural en una célula, tejido u organismo.
Como se usan en este documento, los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-alfa-aminoácidos de origen natural o sus restos. La siguiente Tabla (Tabla 1) muestra el código de tres letras y el código de una letra (recomendado por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB) para la denominación de los aminoácidos naturales:
Como se usa en este documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, ratones, ratas, mamíferos marinos y animales domésticos y de granja. Preferiblemente, el mamífero en este documento es el ser humano.
Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a glicoproteínas de la familia de las inmunoglobulinas, caracterizadas porque tienen propiedades de unión a antígenos, y se producen por células plasmáticas. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos tanto monoclonales como policlonales que pertenecen a cualquier clase de anticuerpos, por ejemplo, IgG, IgD, IgM, IgA, IgE o derivados de los mismos.
Como se usa en este documento, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpos que tiene una población de anticuerpos homogénea. No pretende limitarse a una fuente particular del anticuerpo o a la forma en la que se produce, e incluye anticuerpos y fragmentos de los mismos producidos por fusión celular o por técnicas recombinantes.
Como se usa en este documento, el término "antígeno" se refiere a cualquier molécula o agente capaz de inducir la producción de anticuerpos específicos cuando se introduce en un hospedador inmunocompetente. Como se usa en este documento, el término "antígeno" también se refiere a cualquier molécula o agente susceptible de reconocerse por un anticuerpo específico. Típicamente, pueden reconocerse como antígenos péptidos, polipéptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o combinaciones de estas moléculas. Estos antígenos también pueden contener grupos químicos orgánicos e inorgánicos unidos.
Como se usa en ese documento, el término "epítopo" se refiere a la porción de un antígeno que se reconoce por un anticuerpo (monoclonal o policlonal) o por el receptor con especificidad de antígeno de una célula. Cuando el antígeno es un péptido, polipéptido o una proteína, sus epítopos pueden ser fragmentos de al menos 5 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos primaria, pero también regiones expuestas en la superficie de la proteína plegada madura (estructura terciaria tridimensional) compuestas por 5 o más aminoácidos. Típicamente, los epítopos pueden clasificarse como epítopos de células B y epítopos de células T basándose en los tipos de respuesta inmune que provocan.
Como se usa en este documento, el término "muestra biológica" se aplica a cualquier muestra de tejido o fluido biológico que contiene uno o más de los ácidos nucleicos, anticuerpos, péptidos, polipéptidos o proteínas de la presente invención. En la presente invención, el término "muestra biológica" también se aplica a cualquier muestra de tejido o fluido biológico que pueda usarse como fuente para la determinación de anticuerpos anti-Anisakis. Dichas muestras incluyen, pero sin limitación, tejidos aislados, sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, líquido ascítico, líquido sinovial, saliva, orina o heces. Las muestras biológicas también pueden incluir secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas para fines histológicos. Una muestra biológica puede obtenerse a partir de cualquier organismo eucariota, y preferiblemente de un mamífero tal como una rata, ratón, conejo, mamíferos marinos, o un ser humano.
Como se usa en este documento, el término "muestra alimentaria" se refiere a cualquier muestra obtenida de la amplia gama de materiales comestibles. Estas muestras incluyen, pero sin limitación, trozos de pescado crudo, ahumado y cocinado y alimentos que tienen materiales de pescado en su composición. El término "muestra alimentaria" también incluye alimentos para la nutrición de niños.
Como se usa en este documento, la expresión "anticuerpos anti-Anisakis" se refiere a cualquier clase o subclase de anticuerpos presentes en una muestra capaz de reconocer al menos un epítopo que esté presente en los antígenos de cualquiera de las especies del género Anisakis. La expresión incluye anticuerpos producidos durante infecciones naturales o experimentales de seres humanos y animales con el parásito, así como anticuerpos monoclonales y policlonales producidos después de la inmunización de seres humanos o animales con antígenos recombinantes o sintéticos no purificados o sustancialmente purificados, obtenidos a partir de especies del género Anisakis. La expresión también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos producidos por técnicas recombinantes, síntesis química o técnicas equivalentes.
Como se usa en este documento, la expresión "porcentaje de identidad" se refiere al porcentaje de aminoácidos o nucleótidos que ocupan la misma posición relativa cuando dos secuencias de aminoácidos, o dos secuencias de ácido nucleico se alinean una al lado de la otra. Para los fines de la presente invención, un método adecuado para calcular el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos es usar el programa lalign de William Pearson que aplica el algoritmo de Huang y Miller, publicado en Adv. Appl. Math. (1991) 12: 337-357, e incorporado en este documento como referencia. Este programa puede procesarse on line en la dirección: [http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html].
Como se usa en este documento, el término "inmunoensayo" se refiere a un método para detectar un analito en una muestra por medio de una reacción antígeno-anticuerpo. Los analitos pueden ser moléculas pequeñas (haptenos) o moléculas grandes, tales como muchas proteínas plasmáticas. Con mucha frecuencia, el analito es un anticuerpo que puede detectarse por medio de la unión específica entre el anticuerpo y un ligando. Como se usa en este documento, el término "inmunoensayo enzimático" (EIA) se refiere a un tipo amplio de inmunoensayos, caracterizados porque al menos uno de los reactivos está marcado con una enzima. Son EIA típicos los ensayos de inmunoabsorción vinculados a enzimas (ELISAs) de los cuales hay una serie de variantes. Si se desea una clasificación, o una descripción detallada de formatos de inmunoensayo, véase: Price y Newman (1997) Principles and Practice of Immunoassay, Macmillan Reference LTD, New York; Tijssen (1985) Practice and theor y of enzyme immunoassays, En: Laborator y Techniques in Biochemistr y and Molecular Biology (R.H. Burdon and PH van Knippenberg, eds) , Elsevier, Amsterdam; Deshpande (1996) Enzyme immunoassays, from concept to product development, Chapman & Hall, New York.
Como se usa en este documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una composición química o biológica que es adecuada para administrarse a un individuo mamífero. Típicamente, una composición farmacéutica comprende una cantidad de un agente activo farmacológicamente eficaz y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se describen ejemplos de vehículos y formulaciones farmacéuticas adecuadas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 20ª edición, Mack Publishing Company, Easton, 2000. Una composición farmacéutica puede formularse específicamente para la administración por diferentes vías incluyendo, pero sin limitación, la vía oral, parenteral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intranasal, sublingual y similares.
Como se usa en este documento, la expresión "método de diagnóstico" se refiere a un método para la identificación de un estado patológico en un animal o en un individuo. Cuando dicho estado patológico se produce por un agente infeccioso, frecuentemente el diagnóstico puede realizarse usando un inmunoensayo (véase anteriormente) que permite la detección de los antígenos liberados por el patógeno, o de los anticuerpos inducidos en el hospedador por dicho patógeno. Los métodos de diagnóstico de la presente invención incluyen ensayos in vitro (tales como un ensayo ELISA, o el test de liberación de histamina de los basófilos) y ensayos in vivo tales como las pruebas cutáneas, por ejemplo, pero sin limitación, el ensayo de pinchazo en la piel (prick-test) , intradermorreacciones, o las pruebas epicutáneas (por ejemplo, el ensayo de parche) , que se usan frecuentemente para el diagnóstico de alergias. La expresión "métodos de diagnóstico" también incluye a las pruebas de provocación, consistentes en la administración controlada y gradual de la sustancia sospechosa de provocar un cuadro alérgico a través de diferentes vías: oral, conjuntival, nasal, bronquial, etc., para comprobar su tolerancia. Una descripción más detallada de estos últimos métodos, puede verse en: Comité de Reacciones Adversas a Alimentos: Metodología diagnóstica en la alergia a alimentos. Alergología e Inmunología Clínica, 14: 50-52 (1999) , así como en diversos manuales de la especialidad de Alergología e Inmunología Clínica.
Como se usa en este documento, la expresión "repeticiones de secuencia" se refiere a motivos repetitivos en la secuencia de una proteína dada o de una molécula de ácido nucleico. Las repeticiones de secuencia en las secuencias polipeptídicas de la presente invención se realizaron usando el programa RADAR (véase el Ejemplo Nº 12) .
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un especialista habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. En la práctica de la presente invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento. A lo largo de toda la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Otros objetos, ventajas y características de la invención serán evidentes para los especialistas en la técnica tras el examen de la descripción o pueden aprenderse por la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
Aislamiento de ARNm y construcción de una biblioteca de expresión a partir de Anisakis simplex
Se extrajeron manualmente larvas de Anisakis simplex en la fase larvaria L3 (L3) de las vísceras y cavidad peritoneal de la bacaladilla (Micromesistius poutassou) y se almacenaron en nitrógeno líquido antes de comenzar la construcción de la biblioteca de ADNc. Se obtuvo el ARN mensajero (ARNm) total a partir de 1 g de larvas L3 de Anisakis simplex congeladas usando el kit de aislamiento de ARNm Fast Track 2.0 (Invitrogen S.A., Barcelona, España) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se usaron cinco microgramos del ARN poli (A) + obtenido para construir la biblioteca de ADNc de Anisakis usando el kit ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (Stratagene, La Jolla, CA) , siguiendo las instrucciones del fabricante. De acuerdo con las instrucciones proporcionadas, el ARN poli (A) + de Anisakis simplex se convirtió primero en ADNc bicatenario, después se ligó al vector de expresión lambda-ZAP y el vector se empaquetó usando extractos de empaquetamiento Gigapack III. Se usó como hospedador la cepa XL1-Blue MRF' de E. coli. La biblioteca resultante se amplificó, y contenía aproximadamente 1, 3 x 1010 pfu/ml y un 1% de fagos no recombinantes.
Exploración de la biblioteca de ADNc de Anisakis simplex
Una vez amplificada, la biblioteca de ADNc de A. simplex se sometió a un cribado inmunológico usando anticuerpos monoclonales UA3. Siguiendo las recomendaciones proporcionadas en el ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (Stratagene) , se dejaron crecer células hospedadoras XL1-Blue MRF' en caldo LB con suplementos, se centrifugaron a 1000 x g, y el sedimento se resuspendió en sulfato de magnesio 10 mM. A esta suspensión se le añadió una alícuota de los fagos recombinantes y la mezcla se incubó 15 minutos a 37ºC para permitir que los fagos se unieran a las células. Después, la suspensión celular con los fagos adheridos se mezcló con agar NZY fundido (enfriado a aproximadamente 55ºC) , y la mezcla se extendió uniformemente sobre una placa de 150 mm de diámetro, que contenía agar NZY recién vertido. Después de un tiempo de incubación de aproximadamente 3 h a 42ºC para permitir que comenzaran a formarse placas de fagos, se indujo la expresión de proteínas recombinantes recubriendo las placas con filtros de nitrocelulosa previamente impregnados en isopropil tio-beta-D-galactósido (IPTG) 10 mM en agua (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) . Después, las placas se incubaron a 37ºC durante 3, 5 h, después de lo cual se retiraron cuidadosamente los filtros de nitrocelulosa que contenían las placas de fago adsorbido y se bloquearon con BSA al 3% en TBS (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7, 5) a 37ºC durante 30 minutos y después se incubaron con anticuerpos monoclonales (AcM) IgGilkappa UA3 (dilución 1:10.000 en TBS) a 4ºC durante una noche. Los filtros de nitrocelulosa se lavaron en TBS que contenía Tween 20 al 0, 05% (TBS-T) , y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente con IgG de cabra anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina a 1:10.000 (Pierce, Rockford, IL, USA) . Después de lavar otra vez, se visualizaron los complejos inmunes usando NBT (nitroazul de tetrazolio) y BCIP (fosfato de p- toluidina-5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) (Sigma Chemical Corp., St Louis, MO, USA) .
Escisión in vivo de un único clon y secuenciación de ADNc
Después de identificar un ADNc que codificaba una proteína reconocida por el AcM UA3 mediante el cribado inmunológico sobre el vector lambda-ZAP intacto, se purificó la placa de fago correspondiente (clon UAR-H5) . De acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (Stratagene) , se transfirió la porción central de las placas positivas para el fago seleccionadas a un tubo de microcentrifuga y se liberaron las partículas de fago recombinante en tampón SM. Después, se realizó la escisión in vivo del fagémido pBluescript del vector lambda-ZAP mediante coinfección de células hospedadoras XL1-Blue MRF' con el fago recombinante y el fago auxiliar ExAssist proporcionado con el kit. Al final de este procedimiento, el fagémido pBluescript escindido, obtenido empaquetado como partículas de fago filamentosas, se usó para infectar células hospedadoras SOLR. Se obtuvieron colonias de células SOLR transfectadas que contenían el fagémido pBluescript bicatenario con el inserto de ADN donado de interés dejando crecer las células en placas de agar Luria-Bertani (LB) que contenían ampicilina (100 microgramos/ml) . Se dejaron crecer colonias bacterianas individuales en caldo LB-ampicilina y se purificó el ADN del fagémido pBluescript usando un kit Perfectprep Plasmid Maxi (Eppendorf) . Se usaron los cebadores M13 directo (5' SEC ID Nº 19 3') e inverso (5' SEC ID Nº 20 3') de la secuencia de pBluescript SK, así como varios cebadores internos, para la secuenciación automática del ADN del fagémido usando el Big-Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PE Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador de ADN Applied Biosystems 377 (PE Biosystems) . Se realizaron comparaciones de la secuencia de ADN y de la secuencia deducida de aminoácidos con los bancos de datos EMBL y SWISS-PROT usando el paquete de software ExPASy (el Expert Protein Analysis System) , servidor World Wide Web (http://www.expasy.org/) , del Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., 2003) . La secuencia de nucleótidos descrita comprende una secuencia de 3288 nucleótidos, representada por la secuencia de la SEC ID Nº: 1, y codifica una secuencia de aminoácidos deducida de 1096 aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2.
Ejemplo 2
Subclonación de un fragmento de la secuencia de ADNc (SEC ID Nº: 1) de Anisakis simplex en el vector pQE-31
En una realización preferida, se subclonó un fragmento de ADN recombinante interno (SEC ID Nº: 15) que corresponde a las posiciones de nucleótidos 1303 y 2139 de la SEC ID Nº 1, que codifica una secuencia polipeptídica de 279 aminoácidos (SEC ID Nº: 16) , en el vector de expresión pQE-31 usando un kit QlAexpress Type IV (Qiagen, IZASA S.A., Barcelona, España) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y usando los sitios de restricción Sal I y Hind III en el sitio de clonación múltiple de pQE-31. Está disponible otra metodología similar en manuales tales como: Molecular Cloning: a Laborator y Manual (Sambrook et al., 2001) o Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1998) .
Antes de la clonación, se amplificó la secuencia del fragmento de ADNc que corresponde a la SEC ID Nº: 15 mediante PCR, y los extremos de la secuencia se modificaron usando el fagémido pBluescript recombinante como molde y un conjunto de cebadores directo (5' SEC ID Nº 21 3') e inverso (5' SEC ID Nº 22 3') , que contenían sitios de restricción Sal I y Hind III. Esta modificación mediante PCR proporcionó secuencias de nucleótidos específicas para las enzimas de restricción Sal I y Hind III para que el inserto recombinante tuviera extremos cohesivos con respecto al plásmido digerido. Las condiciones de PCR para la amplificación y modificación de la secuencia del fragmento de ADN correspondiente a la SEC ID Nº: 15 comprendió: un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 4 minutos seguido por 35 ciclos de (30 s de desnaturalización a 94ºC; 30 s de hibridación a 55ºC; y un minuto de elongación a 72ºC) , y un ciclo de elongación final de 72ºC durante 7 minutos. Después de que acabara la PCR, se purificó el ADN recombinante de Anisakis amplificado usando un kit de purificación en gel QiaQuick (Qiagen) . A continuación, un microgramo del ADN plasmídico y 2 microgramos del ADN que codificaba el fragmento a insertar se digirieron con las enzimas de restricción Sal I y Hind III, de acuerdo con el tampón y las condiciones de incubación recomendadas por el fabricante (Invitrogen S.A., Barcelona, España) . Finalmente, tanto el vector digerido como el inserto de ADN se purificaron con el kit de purificación en gel QiaQuick (Qiagen) y se ligaron en una proporción 1:3 entre el vector y el inserto, usando ADN ligasa de T4 a 16ºC durante una noche. La inserción del ADN recombinante de Anisakis simplex de la SEC ID Nº: 15 entre los sitios Sal I y Hind III del sitio de clonaje múltiple de pQE-31 originó un marco abierto de lectura (ORF) plasmídico de 915 nucleótidos (SEC ID Nº: 3) , que codificó la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, la cual incluye la SEC ID Nº: 16 de Anisakis (porción central) y dos secuencias de aminoácidos adicionales (colas) : SEC ID Nº 23 y SEC ID Nº 24, localizadas, respectivamente, en las porciones amino y carboxilo terminales de la secuencia de Anisakis clonada. La presencia de la señal de 6 x Histidina en la porción amino del polipéptido codificado puede facilitar la purificación de polipéptidos recombinantes, pero también pueden usarse otros vectores y métodos de purificación según convenga.
Ejemplo 3
Transformación de células M15 (pREP4) con pQE-31 recombinante
La transformación de células M15 [pREP4] de E. coli con el vector pQE-31 recombinante se realizó de acuerdo con las instrucciones proporcionadas en el manual (The QIAexpresionist: A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins) del fabricante (Qiagen) . De acuerdo con este protocolo, se incubaron una alícuota de células M15 competentes preparadas previamente y una alícuota de la mezcla de ligamiento en hielo durante 20 minutos y después se incubaron a 42ºC durante 90 minutos. Después de dichas incubaciones, las células se resuspendieron en caldo Psi y se incubaron durante 90 minutos a 37ºC. Después, las células M15 se sembraron en placas de agar LB que contenían 25 microgramos por mililitro de kanamicina y 100 microgramos de ampicilina y se incubaron durante una noche a 37ºC. Una colonia positiva se dejó crecer en caldo LB suplementado con kanamicina y penicilina, se centrifugó y las células sedimentadas se almacenaron en medio SOB que contenía glicerol a -80ºC.
Ejemplo 4
Expresión del polipéptido recombinante de Anisakis simplex
Para producir el polipéptido recombinante de Anisakis recombinante del Ejemplo 2, las células M15 transformadas se descongelaron y dejaron crecer a 37ºC en caldo LB, complementado con kanamicina y ampicilina, con agitación orbital (200 r.p.m.) hasta alcanzar una DO600 de 0, 5. Después se indujo la expresión del polipéptido añadiendo IPTG 1 mM, y las células se incubaron durante 4 h adicionales a 37ºC con las mismas condiciones de agitación. Posteriormente, las células se centrifugaron a 5000 x g y se almacenaron congeladas a -30ºC hasta la purificación del polipéptido expresado, según se describe en el Ejemplo 5. En estas condiciones de cultivo, las células M15 producen el polipéptido recombinante de la SEC ID Nº: 4 precipitado en forma de cuerpos de inclusión.
Ejemplo 5
Purificación de polipéptido recombinante de Anisakis simplex
En una realización preferida, los cuerpos de inclusión de las células M15 sedimentadas, obtenidas a partir de un cultivo de 250 ml, se purificaron de acuerdo con las siguientes etapas: a) el sedimento bacteriano se resuspendió en 15 ml de reactivo B-PER (Pierce, Rockford, IL, USA) y se agitó suavemente durante 10 minutos; b) la muestra se centrifugó a 15.000 x g y el sobrenadante, que contenía proteínas solubles, se desechó; c) el sedimento que contenía los cuerpos de inclusión se resuspendió en otros 15 ml de B-PER y a la suspensión celular se le añadió lisozima a una concentración final de 200 microgramos (Sigma-Aldrich, Madrid, España) y se incubó a TA durante 5 minutos; d) la suspensión se diluyó con 100 ml de una dilución 1:10 de B-PER y las células se resuspendieron empleando un agitador vortex; e) la suspensión celular se centrifugó a 15.000 x g durante 15 minutos y el sedimento se resuspendió en otros 100 ml de B-PER y se agitó en el vortex; f) la suspensión que contenía B-PER diluido se centrifugó a 15.000 x g y el sedimento se resuspendió en 50 ml de un tampón de desnaturalización que constaba de NaH2PO4 100 mM, Tris.Cl 10 mM y Urea 6 M, pH 8, 0, y después se agitó en el vortex; g) la suspensión se centrifugó a 15.000 x g durante 20 minutos y se disolvió en 10 ml de un tampón de desnaturalización que constaba de NaH2PO4 100 mM, Tris.Cl 10 mM y Urea 8 M, pH 8, 0 (tampón de carga) ; h) a la solución que contenía el péptido, se le añadieron 2, 5 ml de una suspensión de resina Ni- NTA al 50% (Qiagen) y la mezcla se agitó en un agitador orbital durante 30 minutos a TA. Después la suspensión de resina se cargó en una columna vacía, y se lavó con dos volúmenes del tampón de carga; i) los polipéptidos retenidos se eluyeron con una solución que contenía Tris.Cl 0, 15 M, pH 10, 5, que contenía imidazol 250 mM, y se almacenó congelada a -30ºC hasta su uso.
Ejemplo 6
Subclonación del fragmento de la secuencia de ADNc de Anisakis simplex de la SEC ID Nº: 17 en el vector pTARGET y transformación de células JM109 competentes
En otra realización preferida, un fragmento interno de 834 aminoácidos (SEC ID Nº: 17) correspondiente a las posiciones de nucleótidos 1306-2139 de la SEC ID Nº:1, que codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido representado por la SEC ID Nº: 18, se subclonó en el vector pTARGET (Promega) . Para ello, la SEC ID Nº: 17 seamplificó mendiante PCR empleando un conjunto de cebadores directo (5' SEC ID Nº 25 3') y reverso (5' SEC ID Nº 26 3') y el vector pQE-31 transformado del Ejemplo 3 como molde. Las condiciones de PCR fueron: un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos de (45 segundos de desnaturalización a 94ºC; 45 segundos de hibridación a 55ºC; y 1, 5 minutos de elongación a 72ºC) , y un ciclo de elongación final de 10 minutos a 72ºC. Los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa al 2% y después se donaron en el vector pTARGET. El ligamiento de pTARGET y el inserto de Anisakis, y la transformación de células JM109 competentes se realizaron como se indica en las instrucciones del uso del producto. Se seleccionaron transformantes JM 109 positivos por selección de colonias blancas usando placas de agar LB suministradas con ampicilina/IPTG/X-Gal como se describe por el fabricante.
En las condiciones experimentales descritas, la Subclonación de la secuencia de ADNc correspondiente a la SEC ID Nº: 17 en el vector pTARGET originó un ORF plasmídico de 846 nucleótidos (SEC ID Nº: 5) que codifica para la secuencia de 282 aminoácidos de la SEC ID Nº: 6, que incluye el polipéptido de Anisakis de la SEC ID Nº: 17, y una secuencia adicional de 4 aminoácidos (SEQ ID Nº: 24) situada en la porción carboxilo terminal de la SEC ID Nº: 17.
Ejemplo 7
Aislamiento del ADN del plásmido recombinante de células JM109 y vacunación de ratones con ADNplasmídico
Se dejó crecer una colonia positiva de células JM109 en caldo LB-ampicilina, se centrifugó a 15.000 x g durante 15 minutos y el sedimento se usó para la extracción del ADN plasmídico usando el kit Plasmid Maxi (Qiagen) . Se inoculó un total de 50 microlitros (concentración de un microgramo por microlitro) de ADN plasmídico sin endotoxinas en el músculo cuádriceps de las dos patas de ratones Balb/c de 10-20 semanas de edad. Las inoculaciones se realizaron usando una jeringa de insulina como se describe por Leiro et al. (2002) .
Ejemplo 8
Inmunoensayos para la determinación de anticuerpos anti-Anisakis en sueros de pacientes infectados
Un inmunoensayo de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier inmunoensayo capaz de detectar la presencia de anticuerpos anti-Anisakis en cualquier fluido biológico procedente de un individuo o especie ani- mal.
Los ejemplos de tipos de inmunoensayos incluyen inmunoensayos en fase líquida y fase sólida, e inmunoensayos competitivos y no competitivos en un formato directo o indirecto.
Típicamente, la medición de los niveles de anticuerpos anti-Anisakis específicos en un fluido biológico, como por ejemplo en suero o plasma, puede realizarse por métodos ELISA, como son los métodos ELISA descritos en este ejemplo.
a) Muestras de suero
Las muestras de suero usadas en los métodos ELISA de este ejemplo se obtuvieron a partir de individuos no infectados (donantes de sangre sanos) y de individuos infectados con el parásito Anisakis simplex. Los sueros se consideraron positivos cuando se obtuvieron a partir de individuos que tenían una historia reciente de haber comido pescado crudo y la presencia del parásito pudo confirmarse por examen endoscópico.
b) ELISA de captura con antígenos O- desglicosilados y anticuerpos monoclonales UA3
Se describe un método ELISA de captura (UA3-ELISA) basado en la captura de antígenos O- desglicosilados de Anisakis spp. específicos por anticuerpos monoclonales UA3 inmovilizados.
El antígeno O- desglicosilado usado en este inmunoensayo se obtuvo como se ha descrito previamente, y se basa en el tratamiento de antígenos de Anisakis enteros con NaOH 0, 02 M a 50ºC durante 16 h, y neutralización adicional del pH con HCl.
Para realizar el ELISA de captura, se realizaron las siguientes etapas: a) acoplamiento de anticuerpos monoclonales UA3 purificados (100 microlitros/pocillo; concentración de anticuerpos de 10 microgramos/ml) durante una noche; b) aspiración, y después lavado de la placa ELISA con PBS tres veces; c) aspiración, y después bloqueo de los pocillos de ELISA durante 1 h a 37ºC con una solución de PBS que contenía leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0, 2% (PBS-TM) ; d) aspiración, y después incubación durante 1, 5 h a 37ºC con 100 microlitros de suero humano no diluido; e) lavado tres veces con 200 microlitros por pocillo de PBS que contenía Tween-20 al 0, 2% (PBS-T) ; f) incubación con 100 microlitros de una dilución 1:2500 de anticuerpos monoclonales anti-IgE humana marcados con FITC (Ingenasa, Madrid, España; el marcaje con FITC se llevó a cabo de acuerdo con el método de Liddel y Cr y er, 1991) ; g) aspiración y lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de PBS-T; h) aspiración, e incubación con 100 microlitros de una dilución 1:1.500 de anticuerpos de conejo anti-FITC conjugados con peroxidasa (Dako, Barcelona, España) ; i) aspiración, y lavado con 200 microlitros por pocillo de PBS-T; j) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma) ; k) lectura de densidades ópticas (DO) a 492 nm en lector multipocillo (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) .
c) ELISA indirecto con el polipéptido recombinante de Anisakis expresado en células M15 transformadas
En una realización preferida, el polipéptido recombinante de la SEC ID Nº: 4 se usó para realizar un ELISA indirecto para medir anticuerpos anti-Anisakis en sueros de individuos infectados con Anisakis.
En este ejemplo se describe un método ELISA para la determinación de anticuerpos IgE en muestras de suero humano, pero también pueden medirse otras clases (IgA, IgG, IgM) y subclases (IgAl, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) de anticuerpos cambiando la especificidad de los anticuerpos anti-humano secundarios. Del mismo modo, el inmunoensayo también puede adaptarse para determinaciones de anticuerpos en fluidos biológicos de otras especies animales (por ejemplo, otros mamíferos, aves o peces) eligiendo los anticuerpos secundarios anti-especie apropiados.
En una realización preferida, el método para realizar el ELISA indirecto (rUA3-ELISA) del presente ejemplo se realizó de acuerdo con las siguientes etapas: a) acoplamiento de las placas de ELISA con el antígeno recombinante de Anisakis de la SEC ID Nº: 4 en Tris.Cl 0, 1 M, pH 10, 5; b) aspiración, y después lavado de la placa de ELISA con PBS tres veces; c) aspiración, y después bloqueo de los pocillos de ELISA durante 1 h a 37ºC con una solución de solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0, 2% (TBS-TM) ; d) aspiración, y después incubación de las placas durante 1, 5 h a 37ºC con 100 microlitros de suero humano no diluido; e) lavado tres veces con 200 microlitros por pocillo de TBS que contenía Tween-20 al 0, 2% (TBS-T) ; f) incubación con 100 microlitros de una dilución 1:2500 de anticuerpos monoclonales anti-IgE humana marcados con FITC (Ingenasa; marcado con FITC de acuerdo con el método de Liddel y Cr y er, 1991) ; g) aspiración, y después lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS-T; h) aspiración, y después incubación con 100 microlitros de una dilución 1:1500 de anticuerpos de conejo anti-FITC conjugados con peroxidasa (Dako) ; i) aspiración, y después lavado con 200 microlitros por pocillo de PBS-T; j) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma) ; k) lectura de las densidades ópticas (DO) a 492 nm en lector multipocillo (Molecular Devices) .
La siguiente Tabla I muestra la comparación de los valores de IgE obtenidos para 22 muestras de suero positivas de pacientes infectados con el nematodo Anisakis simplex, ensayadas por los métodos de ELISA de captura (UA3-ELISA) y ELISA indirecto (rUA3-ELISA) descritos en el Ejemplo 8 de la presente invención. La tabla muestra los valores medios de absorbancia, medidos a 492 nm, para cada suero. Los valores de corte (cut-off) para las determinaciones de IgE fueron DO = 0, 105 para el método UA3-ELISA y DO = 0, 049 para el método rUA3-ELISA. Nótese que la muestra 2 fue sólo positiva por el método rUA3-ELISA. Estos resultados demuestran que tanto el método UA3-ELISA (sensibilidad del 95, 45%) como el método rUA3-ELISA (sensibilidad del 100%) son métodos válidos para serodiagnóstico de infecciones humanas por Anisakis spp.
TABLA I 
Ejemplo 9
Producción de anticuerpos en ratones transfectados con el vector pTARGET recombinante que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 6
En este ejemplo, se extrajo sangre de ratones transfectados con pTARGET recombinante que codificaba el polipéptido de la SEC ID Nº: 6 (véase el Ejemplo 7) con anestesia, y el suero obtenido se ensayó en ELISA indirecto para determinar la presencia de anticuerpos IgG1 reactivos con el polipéptido de la SEC ID Nº: 4 inmovilizado en la placa de ELISA. El método ELISA fue el mismo descrito en el Ejemplo 8b, con la excepción de que se usaron anticuerpos de cabra anti-IgG de ratón marcados con peroxidasa (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA; dilución 1:3000) en lugar de reactivos anti-humano secundarios. En este ejemplo, se ensayaron sueros de ratón a una dilución 1:100.
La siguiente Tabla II muestra la respuesta de anticuerpos IgG1 obtenida en ratones BALB/c después de la vacunación (por vía parenteral) con 100 microgramos/ratón del plásmido p- TARGET recombinante que contenía el inserto de ADN de Anisakis simplex que codifica el polipéptido de la SEC ID Nº: 6. La extracción de sangre de los ratones se hizo un mes después de la inmunización. La tabla muestra los valores medios de absorbancia ± SD para cada suero, medidos a 492 nm (tres determinaciones independientes) .
Estos resultados demuestran que una vacuna de ADN recombinante que contiene una secuencia de ADN de Anisakis (mostrado en este experimento por la SEC ID Nº: 6 de la presente invención) puede ser útil para la inducción de anticuerpos anti-Anisakis in vivo. La inducción in vivo de anticuerpos por vacunas es de interés para: a) la inducción de protección inmunológica contra agentes infecciosos, y b) para la prevención de reacciones alérgicas.
TABLA II 
Ejemplo 10
Marcaje y aplicaciones de péptidos y polipéptidos recombinantes de Anisakis simplex de la presente invención
El marcaje de los péptidos y polipéptidos de la presente invención con una biomolécula o molécula química detectable es útil para fines tales como diagnóstico in vivo e in vitro e investigación de laboratorio. Hay muchos marcadores y métodos diferentes para el marcaje conocidos por los especialistas en la técnica (por ejemplo, Kessler (Ed) . Nonradiactive labeling and detection of biomolecules. Springer-Verlag, Berlin 1992) ; Walker (Ed) . The protein protocols handbook. Humana Press, Totowa, New Jersey (1996) ) .
Los ejemplos de los tipos de marcadores que pueden usarse en la presente invención incluyen enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes y sustancias cromogénicas incluyendo partículas coloreadas tales como oro coloidal y partículas de látex.
En una realización preferida, los péptidos y polipéptidos de la presente invención están radiomarcados con, pero sin limitación, 32P, 14C, 3H, 35S, 125I o 131I. Los péptidos marcados pueden detectarse por métodos tales como recuento de centelleo, espectrometría de rayos gamma o autorradiografía.
En otra realización preferida, los péptidos y polipéptidos de la presente invención pueden marcarse con la luciferina de luciérnaga. El compuesto bioluminiscente puede estar unido covalentemente al péptido o polipéptido seleccionado por métodos convencionales, y el péptido o polipéptido marcado se puede detectar cuando una enzima, por ejemplo, luciferasa, cataliza una reacción con ATP que hace que la molécula bioluminiscente emita fotones de luz.
Los fluorógenos también son de amplio uso como marcadores. Los ejemplos de fluorógenos incluyen fluoresceína y derivados, rodamina, Rojo Texas, ficoeritrina, ficocianina y otros. Generalmente, las moléculas de fluorógeno se detectan por un detector de fluorescencia.
En otra realización preferida, los péptidos y polipéptidos de la presente invención (por ejemplo, el polipéptido de la SEC ID Nº: 4) pueden marcarse con biotina y capturarse en un soporte sólido por un ligando de biotina específico como avidina o estreptavidina. Una vez que se ha inmovilizado el polipéptido marcado en el soporte sólido (por ejemplo, el pocillo de una placa de ELISA) , puede usarse para detectar anticuerpos contra el polipéptido seleccionado realizando las incubaciones típicas y etapas de lavado como las descritas en el Ejemplo 8b de la presente invención.
Como alternativa, los péptidos y polipéptidos de la presente invención pueden marcarse con enzimas (por ejemplo, peroxidasa, fosfatasa alcalina y otras enzimas que proporcionan una reacción cromogénica o fluorogénica después de la adición del sustrato apropiado) . Pueden usarse péptidos y polipéptidos marcados con enzimas seleccionadas, por ejemplo, para detectar anticuerpos específicos que reconocen dichos péptidos o polipéptidos en un método ELISA de captura, donde el anticuerpo a detectar se captura primero por otro anticuerpo inmovilizado en un soporte sólido y el péptido o polipéptido marcado, más el sustrato apropiado, se usan para revelar que tuvo lugar la unión anticuerpo-polipéptido.
En otra realización preferida más, los péptidos y polipéptidos de la presente invención pueden marcarse con oro coloidal para su uso en ensayos de inmunocromatografia de flujo lateral, de acuerdo con métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, se describen métodos para producir partículas de oro de diversos tamaños y para la conjugación de oro con proteínas en: Dykstra (Ed) . A manual of applied techniques for biological electron microscopy. Plenum Press. New York (1993) .
Además, en otra realización preferida, la molécula de marcaje puede ser micropartículas magnéticas y el sistema inmovilizado un imán.
Ejemplo 11
Marcaje y aplicaciones de moléculas de ácido nucleico de Anisakis simplex de la presente invención
Pueden usarse moléculas de ácido nucleico marcadas como sondas para detectar secuencias diana complementarias en una mezcla de ácido nucleico compleja por métodos de hibridación específicos tales como transferencia de Southern, de Northern, slot blot y dot blot, hibridación in situ (ISH) y micromatrices (microarrays) . Los métodos para marcar moléculas de ácido nucleico son bien conocidos en la técnica y pueden realizarse usando diferentes agentes de marcaje incluyendo, pero sin limitación: agentes radiactivos, colorantes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes; micropartículas; enzimas; marcadores colorimétricos (tales como, por ejemplo, colorantes, oro coloidal y similares) ; marcadores magnéticos y haptenos (tales como, por ejemplo, biotina, dioxigenina (DIG) y otros para los que están disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales) .
Las sondas marcadas de la presente invención pueden usarse como herramientas de diagnóstico, por ejemplo, para la detección de ADN de Anisakis spp. en tejidos humanos y/o animales infectados, y para investigación.
En una realización preferida, las secuencias de ácido nucleico seleccionadas de la presente invención pueden marcarse con DIG por amplificación por PCR usando nucleótidos marcados con DIG (Boehringer-Mannheim, Alemania) .
Como ejemplo, puede obtenerse una sonda de secuencia de nucleótidos marcada con DIG seleccionada (482 pares de bases) , que corresponde a las posiciones de los nucleótidos 1490 y 1971 de la SEC ID Nº: 1, usando el vector pQE-31 transformado del Ejemplo 3 como molde, y un conjunto de cebadores directo (5' SEC ID Nº: 27 3') e inverso (5' SEC ID Nº: 28 3') . Las muestras tisulares a analizar, obtenidas a partir de biopsias humanas o de animales infectados, pueden fijarse en paraformaldehído al 4%, y después analizarse para detectar la presencia de ADN de Anisakis spp. usando métodos ISH y la sonda marcada con DIG anterior. Una descripción detallada de un método para realizar el ISH del presente ejemplo ha sido descrita por Leiro et al. (2001) , que se incorporó en este documento como referencia.
Ejemplo 12
Análisis de secuencias peptídicas sintéticas que inhiben la unión de anticuerpo monoclonal UA3 con péptidos y polipéptidos de Anisakis simplex de la presente invención
En un aspecto de la presente invención, se describen secuencias peptídicas que se reconocen por el anticuerpo monoclonal UA3. Dichas secuencias peptídicas se reconocieron como "repeticiones" de aminoácidos analizando la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 usando el programa RADAR http://www.ebi.ac.uk/Radar/ en el EMBL-EBI (European Bioinformatics Institute) . Se sintetizaron químicamente secuencias seleccionadas de 12 aminoácidos a partir de estas "repeticiones" y se ensayaron en ELISA competitivo con respecto a la inhibición de la unión de anticuerpos monoclonales UA3 con el polipéptido recombinante de la SEC ID Nº: 4, inmovilizado en los pocillos de una placa de ELISA.
La actividad inhibidora de péptidos que corresponden a las secuencias de aminoácidos Nº: 7-11 se ensayaron en un ELISA de captura, siguiendo las siguientes etapas típicas: a) unión del polipéptido de la SEC ID Nº: 4 a los pocillos de una placa de ELISA durante una noche; b) aspiración, y después bloqueo de los pocillos de ELISA durante 1 h a 37ºC con tampón TBS que contenía leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0, 2% (TBS-TM) ; d) aspiración, y después incubación durante 2 h a 37ºC con 100 microlitros de la dilución apropiada de mAb UA3 preincubado con el péptido inhibidor a ensayar; d) lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS que contenía Tween-20 al 0, 2% (TBS-T) ; e) incubación con 100 microlitros de una dilución 1:3000 en PBS-TM de IgG de cabra anti-ratón conjugada con peroxidasa (Nordic Immunological Laborator y , Tilburg, The Netherlands) ; f) aspiración, y lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS-T; g) aspiración, y lavado con 200 microlitros/pocillo de PBS-T; h) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma) ; i) lectura de las densidades ópticas (DO) a 492 nm en lector multipocillo (Molecular Devices) .
La siguiente Tabla III muestra los valores de inhibición obtenidos para los péptidos sintéticos de las SEC ID Nº: 7-11 (ensayados a tres concentraciones) sobre la unión del anticuerpo monoclonal UA3 al polipéptido de la SEC ID Nº: 4 inmovilizado en una placa de ELISA. Los resultados se expresaron como el porcentaje de inhibición para cada dilución de péptido con respecto al control (sin inhibición) . ND: No hecho. Como se dedujo de los resultados observados, el anticuerpo monoclonal UA3 tiene preferencia por péptidos de las SEC ID Nº: 7 y 8, que difiere solamente en un aminoácido.
TABLA III 
Ejemplo 13
Importancia de las secuencias de aminoácidos sintéticas de las SEC ID Nº: 7-11 como diana para anticuerpos IgE anti-Anisakis presentes en sueros de pacientes infectados
En otra realización preferida, se ensayó la actividad inhibidora de la secuencias de aminoácidos (SEC ID Nº: 7-11) sobre la unión de anticuerpos IgE humanos anti-Anisakis al polipéptido de la SEC ID Nº: 4 en un ELISA indirecto competitivo del siguiente modo: a) unión del polipéptido de la SEC ID Nº: 4 a los pocillos de una placa de ELISA durante una noche; b) aspiración, y después bloqueo de los pocillos de ELISA durante 1 h a 37ºC con tampón TBS que contiene leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0, 2% (TBS-TM) ; d) aspiración, y después incubación durante 2 h a 37ºC con 100 microlitros de una dilución 1:1 del suero del paciente correspondiente y la solución peptídica en TBS (1, 5 X 10- 3 M, concentración final para cada uno de los péptidos anteriores) ; d) lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS que contiene Tween-20 al 0, 2% (TBS-T) ; e) incubación con 100 microlitros de una dilución 1:2500 de anticuerpos monoclonales anti-IgE humana marcados con FITC; f) aspiración, y después lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de TBS-T; g) aspiración, y después incubación con 100 microlitros de una dilución 1:1500 de anticuerpos de conejo anti- FITC conjugados con peroxidasa (Dako) ; h) aspiración, y después lavado con 200 microlitros/pocillo de PBS-T; i) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma) ; j) lectura de las densidades ópticas (DO) a 492 nm en un lector multipocillo (Molecular Devices) .
La siguiente Tabla IV muestra la actividad inhibidora de una mezcla de los péptidos sintéticos que corresponden a las SEC ID Nº: 7-11 sobre la unión de anticuerpos IgE presentes en sueros de cinco pacientes infectados al polipéptido de la SEC ID Nº 4 inmovilizado en placas de ELISA. La mezcla peptídica se ensayó a una concentración final de 1, 5 x 10- 3 M para cada péptido. Los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición de la mezcla peptídica con respecto al control (inhibido con una mezcla de péptidos irrelevantes a la misma concentración final) . Como se observó en la Tabla, las secuencias ensayadas fueron dianas para un intervalo del 25-74 por ciento de todos los anticuerpos IgE anti-Anisakis presentes en los sueros de pacientes infectados. Sin embargo, se entiende que probablemente otros péptidos y polipéptidos recombinantes o sintéticos que comprenden un tramo contiguo de 8 o más aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, o repeticiones de dichas secuencias, también pueden reconocerse por anticuerpos anti-Anisakis de varios isotipos que están presentes en sueros de pacientes infectados.
TABLA IV 
Ejemplo 14
Caracterización de antígenos de larvas de Anisakis en tejidos biológicos
En una realización preferida, los péptidos o polipéptidos de la presente invención pueden usarse para inmunizar un mamífero (tal como, por ejemplo, conejos, ovejas, cabras, ratones o ratas) y los anticuerpos policlonales específicos obtenidos pueden usarse para revelar la presencia de larvas de Anisakis en tejidos infectados de seres humanos o animales. Típicamente, el procedimiento para revelar antígenos de Anisakis en tejidos con parásitos puede realizarse siguiendo un método de inmunohistoquímica convencional de acuerdo con las siguiente etapas generales: a) preparación de los portaobjetos que contienen las secciones de tejidos incluidos en parafina; b) bloqueo de los tejidos con TBS-TM o cualquier otro reactivo de bloqueo; c) etapa de lavado; d) incubación con anticuerpos policlonales anti-Anisakis; e) etapa de lavado; f) incubación con anticuerpos secundarios marcados que reconocen anticuerpos IgG de la especie animal usada para la inmunización (en este ejemplo, la molécula de marcaje preferida es la enzima peroxidasa, pero puede usarse cualquier otro marcador tal como, por ejemplo, los indicados en el Ejemplo 10 de la presente invención, para el marcaje de anticuerpos secundarios) ; g) etapa de lavado; h) incubación con el sustrato enzimático apropiado (tal como, por ejemplo H2O2 + DAB) ; i) observación al microscopio.
En otra realización preferida, puede revelarse la presencia de proteínas de Anisakis spp. que comprenden las secuencias de aminoácidos de la presente invención en tejidos infectados de seres humanos o animales usando el anticuerpo monoclonal UA3 como anticuerpo primario, usando métodos de inmunohistoquímica convencionales.
Ejemplo 15
Detección de la presencia de antígenos de Anisakis en extractos alimentarios empleando anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales de la presente invención
En otra realización preferida, los AcMs (ejemplo el AcM UA3) y los anticuerpos policlonales obtenidos frente a los péptidos, polipéptidos o proteínas de la presente invención pueden ser utilizados para diseñar un método ELISA captura destinado a detectar la presencia de antígenos de Anisakis en extractos alimentarios que contengan pescado en su composición.
En una realización todavía más preferida, el método ELISA captura para la determinación de antígenos de Anisakis en un extracto alimentario se puede llevar a cabo de acuerdo con las siguientes etapas: a) acoplamiento de anticuerpos policlonales anti-Anisakis (100 microlitros/pocillo; concentración de anticuerpos de 10 microgramos/ml) durante una noche; b) aspiración, y después lavado de la placa ELISA con PBS tres veces; c) aspiración, y después bloqueo de los pocillos de ELISA durante 1 h a 37ºC con una solución de PBS que contenga leche descremada en polvo al 3% y Tween-20 al 0, 2% (PBS-TM) ; d) aspiración, y después incubación durante una noche a 4ºC y agitación orbital, con 100 microlitros del correspondiente extracto alimentario (sobrenadante obtenido por homogenización de la muestra en PBS y posterior centrifugación a 3.000 g durante 30 minutos) ; e) lavado tres veces con 200 microlitros por pocillo de PBS que contenga Tween-20 al 0, 2% (PBS-T) ; f) incubación con 100 microlitros de una dilución 1:2500 de anticuerpos monoclonales UA3 marcados con biotina (marcaje realizado según se describe en la referencia Walker (1996) ) ; g) aspiración y lavado 3 veces con 200 microlitros/pocillo de PBS-T; h) aspiración, e incubación con 100 microlitros de una dilución 1:1.500 avidina-peroxidasa (Pierce, Rockford, IL, USA) ; i) aspiración, y lavado con 200 microlitros por pocillo de PBS-T; j) aspiración, e incubación con sustrato para peroxidasa (Sigma Fast OPD, Sigma) ; k) lectura de densidades ópticas (DO) a 492 nm en lector multipocillo (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) .
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