Método analítico para la medida de la actividad κ- caseinolítica de enzimas.
El método permite detectar y cuantificar la actividad κ- caseinolítica de enzimas de interés en la industria quesera y en la investigación biológica. Las enzimas que producen la coagulación de la leche y que, por tanto, permiten obtener masas queseras, son aquellas proteasas que actúan sobre la κ- caseína de la leche. El método se basa en la medición de la cantidad de κ- caseína degradada. La κ- caseína es marcada con el fluorocromo isotiocianato de fluoresceína. El método es preciso y permite determinar el grado de purificación de las proteasas a partir de mezclas enzimáticas de origen animal, vegetal, microbiano y recombinante. Debido a su sensibilidad es útil para la caracterización y purificación de enzimas con capacidad κ- caseinolítica.
Estado de la técnica
Las caseínas constituyen una familia de fosfoproteínas (α1, α2, β, κ) que forman casi el 80% de las proteínas de la leche bovina (Lucey et al., 2003, J. Dair y Sci. 86:2725-2743) . Son proteínas que se encuentran en la leche formando micelas solubles. La solubilidad de las micelas se debe a las moléculas de κ- caseína, que recubren y estabilizan la estructura.
Básicamente, existen tres modelos que intentan explicar la disposición espacial de las caseínas en las micelas (Dalgleish, 1998, J Dair y Sci. 81:3013-3018) . Uno de ellos propone que el núcleo de las micelas está compuesto por multitud de submicelas y que la periferia consiste en microvellosidades de κ- caseína (Walstra, 1970, J. Dair y Res. 46:317-322; Lucey, 2002, J. Dair y Sci. 85:281-294) . Otro de los modelos sugiere que el núcleo está formado por fibras de caseína interconexionadas (Holtz, 1992, Adv. Protein Chem. 43:51-63) . Finalmente, el modelo más reciente (Home, 1998, Internat. Dair y J. 8:171-177) , propone una doble conexión entre las caseínas que hace que las micelas sean estables. Los tres modelos consideran las micelas de la leche como partículas coloidales formadas por agregados y recubiertas por las moléculas solubles de κ- caseína.
El proceso de coagulación de la leche consiste principalmente en tres fases (Carlson, et al., 1987, Biotechnol. Bioeng. 29:582-589) : i) la degradación enzimática de la κ- caseína, ii) la floculación de las micelas, y iii) la formación del gel. Cada una de las fases sigue una cinética diferente, siendo la degradación de la κ- caseína la fase limitante en el proceso de coagulación de la leche. El proceso entero está influenciado por factores físico-químicos, tales como el pH o la temperatura (Esteves et al., 2003, J. Dair y Sci. 86:2558-2567; Vasbinder et al., 2003, J. Dair y Sci. 86:1556-1563) .
Las proteasas coagulantes de la leche actúan sobre la porción soluble de las micelas, la κ- caseína, produciendo una estructura inestable que origina la formación de una masa quesera (Vasbinder et al., 2003, J. Dair y Sci. 86:1556-1563) . La quimosina (E.C. 3.4.23.4) es una proteasa aspártica que hidroliza el puente proteico fenilalanina105 - metionina106 de la κ- caseína y está considerada como la proteasa más eficiente en la industria quesera (Rao et al., 1998, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:597-635) . Sin embargo, existen otras proteasas capaces de desencadenar la coagulación de la leche, rompiendo otro tipo de enlaces diferentes de la κ- caseína (Lucey, 2002, op. cited; Esteves, 2003, op. cited) . Este efecto permite la obtención de quesos con una gran variedad de propiedades reológicas y organolépticas.
El método convencional para cuantificar una enzima coagulante de leche (Poza et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30:691-698) utiliza leche como sustrato, y determina el tiempo transcurrido hasta que aparece el coágulo lácteo. Sin embargo, como la coagulación de la leche puede verse influida por variaciones fisicoquímicas (Lucey, 2002, op. cited; Lucey, 2003, op. cited; Vasbinder, 2003, op. cited) , puede llegar a ocurrir sin la participación de ningún enzima. Como consecuencia, se pueden obtener resultados confusos e irreproducibles, particularmente cuando se trabaja con enzimas con poca actividad. Por otra parte, la medición del tiempo de coagulación no es suficientemente precisa, dado que el momento exacto de la formación del coágulo lácteo es difícil de observar y es subjetivo, lo cual dificulta una determinación precisa de las unidades enzimáticas.
Además, aunque está descrito que la hidrólisis de la κ- caseína sigue una cinética clásica de Michaelis-Menten (Carlson, et al., 1987, Biotechnol. Bioeng. 29:582-589) , es difícil de determinar midiendo el tiempo de la coagulación. Cuando se trabaja con enzimas poco activas, el tiempo que tarda en formarse el coágulo se puede alargar durante horas, siendo posible que tenga lugar una coagulación espontánea de la leche por aumento de la temperatura o por bajada del pH.
Para solucionar estos problemas y mejorar el estudio del proceso, se han propuesto diversos métodos: la determinación del diámetro de halos en placas de agar-leche (Poza, op. cited) ; la determinación colorimétrica (Hull, 1947, J. Dair y Sci. 30:881-884) ; y la determinación de la degradación de la caseína marcada previamente con un marcador radioactivo (Christen, 1987, J. Dair y Sci. 70:1807-1814) , o con un compuesto fluorocrómico (Twining, 1984, Anal. Biochem. 143:30-34) . Todos estos métodos utilizan caseína como sustrato para detectar la actividad proteolítica y, en algunos casos, la actividad coagulante.
El isotiocianato de fluoresceína (FITC) es una sustancia fluorescente, que se une a grupos amino, utilizada para el marcaje de proteínas (Schreiber, A.B., y Haimovich, J., 1983, Methods Enzymol., 93:147-155) . El grupo isotiociantato reacciona con los grupos amino terminal y las aminas primarias de la proteína, formando un derivado tiocarbamoil, tiocarbamoil de fluoresceína (FTC) (Twining, 1984, op. cited) que queda unido a la proteína.
Descripción de la invención
La característica novedosa esencial del método propuesto, consiste en la sustitución de la caseína como sustrato por otro sustrato más específico, la κ- caseína, marcado con el fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC) . El cambio de sustrato permite la cuantificación de las moléculas de κ- caseína degradadas de un modo preciso y específico, detectando aquellos enzimas que son capaces de actuar sobre el sustrato formado FTC-κ- caseína.
El método analítico para la medida de la actividad κ- caseinolítica de enzimas comprende las siguientes etapas:
a) Elaboración del sustrato: Se incuba κ- caseína en tampón carbonato y NaCl a pH 9.5, con el fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC) , durante una hora en agitación. El sustrato resultante, FTC-κ- caseína, se dializa varias veces frente a carbón activo, tampón Tris-HCl, pH 8.5 y frente a Tris-HCl, pH 7.5. Por último, el sustrato, FTC-κ- caseína, se congela a -20ºC en alícuotas de 1 mL.
b) Preparación de la mezcla de reacción: Se incuba la muestra enzimática, en presencia de FTC-κ- caseína con el tampón adecuado para la muestra. Se deja reaccionar en agitación a la temperatura óptima de la enzima. Se detiene la reacción por adición de ácido tricloroacético (TCA) frío y en agitación. Mediante centrifugación, se eliminan las proteínas precipitadas y se guarda el sobrenadante.
c) Medición de la fluorescencia: Se diluye parte del sobrenadante con tampón Tris-HCl, pH 8.5. La cantidad de fluorocromo liberado se mide empleando un fluorímetro robotizado. Se realizan controles negativos sustituyendo la enzima por el tampón; el valor basal de fluorescencia obtenido se resta al obtenido tras la reacción.
d) Construcción de una recta patrón: Se incuban cantidades crecientes del sustrato, FTC-κ- caseína, con una proteasa un tiempo suficiente hasta la completa degradación del sustrato de origen. Así, se obtiene la relación entre la fluorescencia y la cantidad de FTC-κ- caseína degradada.
Se define la unidad enzimática como la cantidad de enzima necesaria para degradar 1 μg de FTC-κ- caseína en 1 h a 37ºC.
e) Interpolación de los datos: A partir de la recta patrón obtenida, se deducen los datos de actividad de la proteasa, a través de la cantidad de fluorescencia emitida.
A continuación se ilustra más ampliamente la invención mediante ejemplos no limitativos:
Ejemplo 1
Preparación del sustrato FTC-κ- caseína
Para la preparación del sustrato del presente método, 1 g de κ- caseína se disolvió en 100 mL de tampón carbonato 50 mM, pH 9.5 y NaCl 150 mM. Posteriormente, se añadieron 40 mg de isotiocianato de fluoresceína (FITC) . La mezcla se agitó suavemente durante una hora a temperatura ambiente. Durante esta hora tiene lugar la unión del tiocarbamoil de fluoresceína (FTC) , derivado de FITC, y las moléculas de κ- caseína. El FITC no unido se eliminó dializando la muestra frente a 1% de carbón activo en 2 L de agua a 4ºC durante toda la noche. Posteriormente, se dializó frente a tampón 50 mM Tris-HCl, pH 8.5 durante toda una noche, seguido de una diálisis frente a tampón 50 mM Tris-HCl, pH 7.5. La concentración de proteína en la muestra obtenida fue ajustada al 0.5% con tampón 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5. El sustrato fue conservado a -20ºC en alícuotas de 1 mL. La cantidad de FITC unido a la κ- caseína fue de 14.12 μg por mg de sólido. Esta determinación se obtuvo comparando el sustrato con un sustrato comercial de FTC-caseína.
Ejemplo 2
Mezcla de reacción
La mezcla de reacción consistió en 10 μL de la muestra enzimática, 20 μL de tampón adecuado para cada enzima y 20 μL de sustrato de FTC-κ- caseína. La reacción se llevó a cabo en tubos cubiertos de 1, 5 mL en condiciones agitación (180 rpm) a la temperatura óptima de la enzima y un tiempo variable, según las condiciones del experimento. En el caso de las enzimas utilizadas en los ejemplos posteriores (Ejemplos 4 a 7) fueron estas condiciones; 37ºC durante un tiempo que varió entre 15 y 180 min, dependiendo del tipo de ensayo. La reacción se detuvo mediante la adición de 120 μL de ácido tricloroacético (TCA) frío al 5% y agitando fuertemente los tubos. La mezcla se dejó reposar como mínimo 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas insolubilizadas por el TCA se precipitaron mediante centrifugación durante 5 min a 14, 000 rpm. Una alícuota de 60 μL de sobrenadante se diluyó con 400 μL de tampón 0.50 M Tris-HCl, pH 8, 5.
Ejemplo 3
Medición de la fluorescencia
Los valores de fluorescencia se obtuvieron mediante la medición de 350 μL de las muestras obtenidas empleando placas de 96 pocillos especiales para la medición por fluorescencias empleando un fluorímetro robotizado con una apertura de 2.5 y unas longitudes de onda de excitación y emisión de 490 y 525 nm, respectivamente.
Los niveles de fluorescencia basales fueron substraídos de los valores de las mediciones para determinar la cantidad de fluorocromo liberado. Se realizaron controles negativos sustituyendo la enzima por el tampón empleado en la reacción.
Ejemplo 4
Diseño de la recta patrón
Se realizó una recta patrón que relacionó la cantidad de fluorescencia con la cantidad de FTC-κ- caseína degradada. Esto se consiguió incubando concentraciones crecientes del sustrato (de 0 mg/mL a 43 mg/mL de FTC-κ- caseína) en presencia de tripsina (100 μg/mL) hasta conseguir la degradación completa. Esto permitió obtener la relación entre la fluorescencia y la cantidad de FTC-κ- caseína degradada.
Se definió la unidad enzimática como la cantidad de enzima necesaria para degradar 1 pg de FTC-κ- caseína en 1 h a 37ºC.
Ejemplo 5
Estudio comparativo de la acción de la tripsina y de la enzima coagulante de la leche de R. miehei sobre los sustratos FTC-κ- caseína y FTC-caseína
Se llevó a cabo una recta patrón de FTC-caseína degradada del mismo modo descrito en el ejemplo 4. Con estos valores y los obtenidos en el ejemplo 4 se llevó a cabo una recta patrón que relacionó la cantidad de FTC-κ- caseína y FTC-caseína degradadas (Tabla 1) .
Se realizaron mediciones con el sustrato comercial FTC-caseína y con el sustrato FTC-κ- caseína del modo descrito en los ejemplos 2 y 3.
Se incubó 1 μg/mL de tripsina en presencia de los dos sustratos. Los valores obtenidos en el experimento, tal como era de suponer, fueron muy similares, no encontrándose diferencias significativas con un a de 0, 05% (Tabla 1) .
Se incubaron 5 μg/mL de la proteasa coagulante de leche procedente de R. miehei, que sólo actúa sobre la κ- caseína, en presencia de los dos sustratos. Se obtuvieron valores de actividad 2.65 veces más elevados empleando el método aquí propuesto y empleando FTC-κ- caseína como sustrato que cuando se empleó FTC-caseína como sustrato, tal como se puede observar en la Tabla 1.
TABLA 1 Valores de actividad enzimática de la tripsina y de la enzima prodecente de R. miehei, usando como sustratos FTC-caseína o FTC-κ- caseína 
Ejemplo 6
Determinación de la actividad enzimática, actividad específica y parámetros cinéticos (Vmáx y Km) de muestras enzimáticas de uso industrial
Se incubaron las siguientes muestras enzimáticas del modo descrito en los ejemplos anteriores.
La proteasa comercial producida por R. miehei (13 μg/mL) , la quimosina obtenida a partir de un cuajar de búfalo lactante (164 μg/mL) , la proteasa procedente de una infusión de flores de Cynara cardunculus (13 μg/mL) y la quimosina comercial recombinante producida por Escherichia coli (5 μg/mL) .
Las diluciones de las muestras fueron incubadas frente a concentraciones crecientes de sustrato FTC-κ- caseína (de 0 a 1, 47 mg/mL) y las mezclas se incubaron durante 1 h a 37ºC. Se midió la actividad y la cantidad de proteína del modo anteriormente descrito. Con estos valores se realizó la gráfica de Michaelis-Menten (Figura 1) y la representación de Lineweaver-Burk (Figura 2) , lo cual permitió la obtención de los valores de Km y Vmáx de dichas enzimas (Tabla 2) .
TABLA 2 Valores de unidades enzimáticas, actividad específica, concentración de proteína y Vmáx y Km de todas las muestras enzimáticas probadas. Las reacciones se llevaron a cabo a 37ºC durante 1 h 
Ejemplo 7
Estudio de la linealidad y el límite de detección del método
Con el objetivo de observar la linealidad de la degradación de FTC-κ- caseína, la reacción se prolongó en el tiempo. Las muestras enzimáticas consistieron en dos diluciones de la enzima coagulante procedente de R. miehei (7 y 13 μg/mL) y el sustrato fue FTC-κ- caseína, preparado del modo descrito en los ejemplos anteriores.
Las reacciones se incubaron durante un tiempo variable, desde 5 minutos hasta 3 horas y se realizaron por triplicado (Figura 3) .
Con el objeto de observar linealidad en la degradación de κ- caseína cuando la reacción tiene lugar empleando distintas concentraciones de enzima, se realizaron ensayos del mismo modo descrito en ejemplos anteriores, donde las reacciones fueron incubadas durante 1 h y se varió la concentración de la muestra enzimática (de 44 a 440 μg/mL) procedente de R. miehei (Figura 4) .
Tal como se puede observar en las figuras 3 y 4, los resultados originaron una representación lineal en ambos casos. De la figura 3 se extrajo el dato de que el método detecta cantidades mínimas de enzima (tales como 2, 6 ng en reacción) . Esto lo hace ideal para ser empleado durante la purificación de enzimas; aunque se tenga poca actividad o poca cantidad de enzima, el método permite detectar la enzima.
El método analítico para la medida de la actividad κ- caseinolítica de enzimas detecta actividad sobre la κ- caseína en cantidades que no consiguen originar la coagulación de la leche sin que pueda intervenir factores fisicoquímicos, tales como el pH y la temperatura.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática de las muestras procedentes de: quimosina recombinante (\sqbullet) , R. miehei (o) , B. arnee bubalis (\blacktriangle) y C. cardunculus (◊enge) . Las barras de error corresponden a la desviación estándar de la media.
Figura 2. Representación de Lineweaver-Burk de la actividad enzimática de las muestras procedentes de: quimosina recombinante (y = 0.072x + 0.629; R2 = 0.995) (\sqbullet) , R. miehei (y = 0.041x + 0.087; R2 = 0.996) (o) , B. arnee bubalis (y = 0.095x + 0.045; R2 = 0.997) (\blacktriangle) y C. cardunculus (y = 0.058x + 0.256; R2 = 0.993) (◊enge) .
Figura 3. Efecto del tiempo de incubación y el valor de dilución sobre la actividad enzimática de la proteasa procedente de R. miehei. Factor de dilución 1/1, 000 (Y = 0.071X + 0.574; R2 = 0.995) (\Box) y factor de dilución 1/10, 000 (Y = 0.020X - 0.431; R2 = 0.995) (\sqbullet) . Las barras de error corresponden a la desviación estándar de la media.
Figura 4. Actividad específica de la proteasa procedente de R. miehei. (Y = 46.093X + 4.497; R2 = 0.984) (\Box) . Las barras de error corresponden a la desviación estándar de la media.
