- 60 pmol ADN de control interno de amplificación (CIA) por muestra. Las concentraciones anteriores pueden modificarse dentro de los rangos de: 1-2, 5 mM de MgCl2, 150-300 μM de desoxinucleótidos trifosfato, 0, 5-2 U Taq polimerasa y 10-100 pmol ADN de control interno de amplificación (SEQ ID NO: 15) .
Finalmente, en una realización preferente de dicho procedimiento para la detección y tipificación de microorganismos del género Salmonella en muestras alimentarias objeto de la presente solicitud de patente, el revelado de la amplificación de bandas se realiza mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2, 5% en tampón TBE (peso/volumen) teñido con 2 μg de bromuro de etidio por ml, y posterior visualización con luz ultravioleta. Pudiendo realizarse también en un gel de agarosa de concentraciones comprendidas entre 1, 5-3% y cuya concentración de bromuro de etidio se encuentre entre 1 y 4 μg por ml. Como alternativa puede utilizarse una tinción con menor riesgo químico basada en el uso de colorantes intercalantes no mutagénicos, como azul de metileno o violeta cristal, aunque con menor sensibilidad de detección en el ensayo.
El principio básico de la PCR múltiple es la amplificación (hasta un millón de veces) de las secuencias de ADN específicas de interés. Los productos de amplificación (amplicones) se separan en función de su tamaño mediante electroforesis en gel. Este método puede realizarse en pocas horas. La posibilidad de tener un resultado en un tiempo tan corto puede traducirse en un mejor control de la salud pública puesto que los alimentos industriales contaminados pueden eliminarse de la cadena alimentaria en periodos menores de tiempo previniendo las intoxicaciones. Se trata de un método muy sencillo capaz de detectar lufc. Esta sensibilidad no se ve alterada por la presencia de otras bacterias, como puede comprobarse en el Ejemplo 3 descrito más adelante.
Por otro lado, la presente invención se refiere a un oligonucleótido definido en las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 12. Así como al uso de al menos una pareja de dichos oligonucleótidos para la detección de Salmonella según el procedimiento previamente descrito.
Por último, la presente invención también se refiere a un kit para la detección y tipificación de microorganismos del género Salmonella en muestras alimentarias, caracterizado porque comprende los reactivos necesarios para llevar a cabo el procedimiento objeto de la presente invención. En una realización preferente, este kit contiene los oligonucleótidos previamente definidos, los tampones y reactivos citados, así como recipientes, y las instrucciones para su correcto uso.
Modo de realización de la invención
A continuación se describen, con carácter ilustrativo, unos ejemplos de realización de la invención, en modo alguno limitativo de la misma.
Ejemplo 1
Detección de Salmonella enterica serotipo Typhimurium en carne bovina cruda
Se realizaron tres inoculaciones en tres días separados. Cada día se realizaron tres extracciones, dando como resultado nueve ensayos de PCR múltiple.
En un primer paso del método según la presente invención, se lleva a cabo un paso de enriquecimiento. Porciones de 25 g de carne bovina cruda se añaden a 225 ml de BPW, se procesan en un homogeneizador digestor durante 2 minutos y posteriormente se incuban a 37ºC durante 24 horas.
El nivel de inoculación de Salmonella enterica serotipo Typhimurium fue de 200 ufc por 25 g. El ADN molde empleado en la PCR múltiple se obtiene a partir del homogeneizado de carne bovina cruda empleando un método de extracción de ADN, basado en la utilización de resinas. Estas resinas poseen una elevada afinidad por los iones metálicos polivalentes y se emplean para superar los inhibidores de PCR presentes en el ADN de la muestra. 1, 5 g de resina fue resuspendida en 25 ml de H2O bidestilada. Las muestras fueron centrifugadas a 10.000 g y 4ºC durante 5 min. Los depósitos resultantes fueron resuspendidos en 300 μl de la resina al 6% mediante vórtex y fueron incubados a 56ºC durante 20 min. A continuación se someten a vórtex a alta velocidad durante 10 segundos. Los tubos fueron situados en una placa térmica o un baño a 100ºC durante 8 min. Después fueron vortexeadas durante 10 segundos a alta velocidad y enfriados inmediatamente en hielo. Los tubos fueron centrifugados durante 5 min a 14.000 g a 4ºC y los sobrenadantes fueron transferidos a tubos nuevos.
μl del ADN extraído del homogeneizado de matriz alimentaria fue añadida a la mezcla de reacción de PCR.
La mezcla optimizada consistía en MgCl2 1, 5 mM, 200 μM de cada uno de los desoxinucleótidos trifosfato, 1 U de Taq polimerasa y 60 pmol del ADN control interno de amplificación (CIA) , por muestra en un volumen final de 25 μl. Las secuencias y concentraciones de los oligonucleótidos se encuentran en las tablas 1 a 3. Adicionalmente, se utilizó 1, 25 μl de una solución al 10% de glicerol como facilitador de la PCR en la mezcla de reacción.
El proceso de amplificación se realizó en un termociclador siguiendo las siguientes condiciones: (i) un paso inicial de desnaturalización de 2 min a 95ºC; (ii) 30 ciclos, donde cada ciclo consiste en 1 min a 95ºC, 1 min a 57ºC, y 2 min a 72ºC; y (iii) un paso final de elongación de 5 min a 72ºC.
Los productos de PCR fueron sometidos a una electroforesis en un gel de agarosa al 2, 5% (peso/volumen) , teñido con 2 μg de bromuro de etidio por ml, y fotografiados bajo luz UV. En cada PCR, se añadió un control con ADN no molde para detectar posibles contaminaciones con ADN exógeno. Ver la figura 1.
Un resultado positivo debería dar una banda de 990 pb que corresponde al CIA, una banda de 401 pb que corresponde a la detección de Salmonella enterica serotipo Typhimurium y una banda de 204 pb que corresponde al género Salmonella. Estas bandas fueron observadas en los nueve experimentos.
Ejemplo 2
Detección de Salmonella enterica serotipo Enteritidis en bacalao
Se realizaron tres inoculaciones en tres días separados. Cada día se realizaron tres extracciones, dando como resultado nueve ensayos de PCR múltiple de muestras extraídas en días consecutivos.
En un primer paso del método según la presente invención, se lleva a cabo un paso de enriquecimiento. Porciones de 25 g de bacalao se añadieron a 225 ml de BPW, se procesan en un homogeneizador digestor durante 2 minutos y posteriormente se incuban a 37ºC durante 24 horas.
El nivel de inoculación de Salmonella enterica serotipo Enteritidis fue de 100 ufc por 25 g. El ADN molde empleado en la PCR múltiple se obtiene a partir del homogeneizado de bacalao empleando el método de extracción de ADN. 5 μl del ADN extraído del homogeneizado de matriz alimentaria fue añadida a la mezcla de reacción de PCR.
La mezcla optimizada consistía en MgCl2 1, 5 mM, 200 μM de cada uno de los desoxinucleótidos trifosfato, 1 U de Taq polimerasa y 60 pmol del ADN control interno de amplificación (CIA) , por muestra. Las secuencias y concentraciones de los oligonucleótidos se encuentran en las tablas 1 a 3. Adicionalmente, se utilizó 1, 25 μl de una solución al 10% de glicerol como favorecedor de la PCR en la mezcla de reacción.
El proceso de amplificación se realizó en un termociclador siguiendo las siguientes condiciones: (i) un paso inicial de desnaturalización de 2 min a 95ºC; (ii) 30 ciclos, donde cada ciclo consiste en 1 min a 95ºC, 1 min a 57ºC, y 2 min a 72ºC; y (iii) un paso final de elongación de 5 min a 72ºC.
Los productos de PCR fueron sometidos a una electroforesis en un gel de agarosa al 2, 5% (peso/volumen) , teñido con 2 μg de bromuro de etidio por ml, y fotografiados bajo luz UV. En cada PCR, se añadió un control con ADN no molde para detectar posibles contaminaciones con ADN exógeno. Figura 2.
Un resultado positivo debería dar una banda de 990 pb que corresponde al CIA, una banda de 304 pb que corresponde a la detección de Salmonella enterica serotipo Enteritidis y una banda de 204 pb que corresponde al género Salmonella. Estas bandas fueron observadas en los nueve experimentos.
Ejemplo 3
Detección de Salmonella enterica serotipos Enteritidis y Typhimurium en crema pastelera
Se realizaron tres inoculaciones en tres días separados. Cada día se realizaron tres extracciones, dando como resultado nueve ensayos de PCR múltiple de muestras extraídas en días consecutivos.
En un primer paso del método según la presente invención, se lleva a cabo un paso de enriquecimiento. Porciones de 25 g de crema pastelera se añaden a 225 ml de BPW, se procesan en un homogeneizador digestor durante 2 minutos y posteriormente se incuban a 37ºC durante 24 horas.
En este ensayo se inocularon dos serotipos diferentes de Salmonella enterica, Enteritidis y Typhimurium. Además se inocularon Escherichia coli CECT 679 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Los niveles de inoculación de Salmonella enterica serotipos Enteritidis y Typhimurium fueron 10 y lufc por 25 g, respectivamente. Los niveles de inoculación de Escherichia coli CECT 679 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 fueron de 5 y 60 ufc por 25 g, respectivamente. El ADN molde a utilizar en la PCR múltiple se obtiene a partir de homogeneizado de crema pastelera empleando el método de extracción de ADN. 5 μl del ADN extraído del homogeneizado de matriz alimentaria fue añadido a la mezcla de reacción de PCR.
La mezcla de reacción PCR optimizada consistió en MgCl2 1, 5 mM, 200 μM de cada uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato, 1 U de Taq polimerasa y 60 pmol de ADN IAC por muestra. Las secuencias y concentraciones de los oligonucleótidos se indican en las Tablas 1 a 3. Adicionalmente, se empleó 1, 25 μl de una solución de glicerol al 10% como favorecedor de la mezcla de reacción de PCR.
El proceso de amplificación se realizó en un termociclador siguiendo las siguientes condiciones: (i) un paso inicial de desnaturalización de 2 min a 95ºC; (ii) 30 ciclos, donde cada ciclo consiste en 1 min a 95ºC, 1 min a 57ºC, y 2 min a 72ºC; y (iii) un paso final de elongación de 5 min a 72ºC.
Los productos de PCR fueron sometidos a una electroforesis en un gel de agarosa al 2, 5% (peso/volumen) , teñido con 2 μg de bromuro de etidio por ml, y fotografiados bajo luz UV. En cada PCR, se añadió un control con ADN no molde para detectar posibles contaminaciones con ADN exógeno. Ver la figura 3.
Un resultado positivo debería dar una banda de 990 pb que corresponda al CIA, una banda de 401 pb correspondiente a la detección de Salmonella enterica serotipo Typhimurium, una banda de 304 pb correspondiente a la detección de Salmonella enterica serotipo Enteritidis y una banda de 204 pb que corresponde al género Salmonella. Estas bandas fueron observadas en los nueve experimentos. En el control negativo sólo debería aparecer una banda de 990 pb correspondiente al CIA, indicando la ausencia de inhibición de la PCR y de contaminación por ADN exógeno. Esto ocurrió en todos los experimentos.
TABLA 2 Oligonucléotidos y sus secuencias
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ a \begin{minipage}[t]{150mm} Oligonucleótidos empleados para crear el control interno de amplificación quimérico (CIA) . Los extremos 3' (en mayúsculas) fueron diseñados para amplificar un fragmento del interior de la secuencia del fago lambda, y los extremos 5' (en minúsculas) correspondían a las secuencias SAL-1F y SAL-3R. \cr} TABLA 3 Oligonucléotidos y concentraciones