Método y kit para la detección e identificación de estirpes de Escherichia coli diarreagénicos.
La invención pertenece al campo de los biosensores de microorganismos basados en el reconocimiento molecular específico entre ácidos nucleicos, y concretamente en el campo de los microarrays o biochips de ADN.
Estado de la técnica
Escherichia coli Diarreagénicos (ECDI)
E. coli es la especie predominante de la flora normal aerobia y anaerobia facultativa del tubo digestivo en la mayor parte de los mamíferos, y se elimina por las heces al exterior. Se puede encontrar en el medio ambiente ya que es capaz de sobrevivir durante cierto tiempo en el agua y los alimentos, de manera que su aislamiento es un indicador de contaminación fecal reciente.
Algunas cepas de E. coli son patógenas y pueden producir infecciones entéricas (diarrea, disentería, colitis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico y enfermedad de los edemas) o extraintestinales (infecciones del tracto urinario, bacteriemias o septicemias, meningitis, peritonitis, mastitis, e infecciones pulmonares y de heridas) . E. coli provoca en seres humanos del orden de 630 millones de casos de diarrea en el mundo y aproximadamente 775.000 muertes al año, afectando fundamentalmente a la población infantil del tercer mundo. Además, es el patógeno oportunista más frecuentemente asociado con infecciones urinarias y septicemias en seres humanos. En animales domésticos las colibacilosis son muy frecuentes, incidiendo esencialmente en animales de pocos días de edad y en recién destetados, y ocasionan importantes pérdidas económicas en las explotaciones de ganado bovino, porcino y ovino, así como en la cría intensiva de aves y conejos. Mientras que en terneros, lechones, corderos y gazapos E. coli suele producir diarrea, en aves provoca fundamentalmente infecciones respiratorias (aerosaculitis) y septicemias. Además E. coli puede causar en rumiantes, ganado porcino, perros y gatos colisepticemias en neonatos hipoganmaglobulinémicos, infecciones urinarias y mamitis.
Aunque las cepas de E. coli que causan infecciones en seres humanos y animales pueden compartir determinados factores de virulencia, en general presentan diferentes serotipos y poseen adhesinas específicas que son responsables de su especificidad de huésped. Por lo tanto, las cepas de E. coli patógenas para seres humanos no suelen producir infecciones en animales y viceversa. No obstante, se ha comprobado que los animales pueden ser un reservorio de E. coli enteropatógenos para las personas. Así, los E. coli verotoxigénicos (ECVT) que causan colitis hemorrágica y el síndrome urémico hemolítico en humanos, forman parte de la flora normal intestinal del ganado bovino y ovino donde se comportan, en la mayor parte de los casos, como comensales. La ingestión de hamburguesas o de leche contaminada ha provocado en los últimos anos numerosos brotes epidémicos en países desarrollados. También se han detectado E. coli uropatogénicos que pueden causar infección cruzada en seres humanos, perros y gatos.
Los E. coli patógenos se han englobado en diferentes grupos o categorías: E. coli enteropatogénicos (ECEP) , E. coli enterotoxigénicos (ECET) , E. coli enteroinvasivos (ECEI) , E. coli verotoxigénicos (ECVT) o enterohemorrágicos (ECEH) , E. coli enteroagregativos (ECEA) , E. coli con adherencia difusa (ECAD) , E. coli uropatogénicos y E. colt bacteriémicos o septicémicos. Las cepas de estos grupos presentan mecanismos de patogénesis específicos, serotipos distintos y producen infecciones y síndromes diferentes (3, 4, 5) .
Factores de virulencia de E. coli diarreagénicos humanos
E. coli Verotoxigénicos (ECVT)
Los ECVT, y muy especialmente los enterohemorrágicos altamente virulentos del serotipo O157:H7, son importantes patógenos emergentes que causan patologías muy severas en seres humanos: colitis hemorrágica (CH) y el síndrome urémico/hemolítico (SUH) (1, 8, 6, 9) . Los rumiantes constituyen el principal reservorio de este tipo de microorganismos, siendo la carne picada, las hamburguesas y los productos lácteos sin pasteurizar los principales vehículos de transmisión (2, 14) . El ECVT del serotipo O157:H7 ha provocado en los últimos años un gran número de brotes de CH, la mayoría de los cuales han tenido lugar en los países anglosajones (Reino Unido, EE.UU. y Canadá) y en Japón. En España los ECVT del serotipo O157:H7 han provocado siete brotes. El brote que afectó a un mayor número de individuos tuvo lugar en el ano 2000 en cinco centros escolares situados en la provincia de Barcelona. La toxiinfección alimentaria afectó a 158 personas (la mayoría niños menores de cinco anos) , de las cuales seis desarrollaron el SUH (15) .
Las verotoxinas (Shiga toxins) son potentes citotoxinas que destruyen las células Vero y están relacionadas estructural e inmunológicamente con la toxina Shiga producida por Shigella dysenteriae tipo 1. Existen dos tipos de verotoxinas, VT1 (Stx1) y VT2 (Stx2) , y diversas variantes de ambas toxinas (VT1, VT1c, VT1d, VT2, VT2c, VT2d, VT2e, VT2f, VT2g) (16, 17, 19) . Establecer las variedades de VT resulta importante, ya que determinadas variedades se ha relacionado con una mayor virulencia para humanos, y otras variedades se han detectado exclusivamente en cepas de origen animal. Todas las verotoxinas se encuentran codificadas en el genoma de profagos integrados en el cromosoma bacteriano (20) . Los ECVT, además de producir verotoxinas, presentan factores de virulencia adicionales que incrementan su poder patógeno. Así, los ECVT se unen al epitelio del intestino grueso a través de unas fimbrias codificadas en el plásmido pO157 (60 MDa) y posteriormente barren el microvilli intestinal por la acción de unas proteínas presentes en su membrana externa que están controladas por el gen cromosómico eae y reciben el nombre de intiminas (5) .
E. coli Enteropatogénicos (ECEP) típicos y atípicos
En los países en vías de desarrollo los ECEP son considerados como una de las principales causas de diarrea infantil, predominado especialmente los serotipos O111:H2 y O119:H6. Los ECEP provocan una diarrea acuosa con dolores abdominales y fiebre moderada (5, 7) .
Actualmente se conocen bastante bien los mecanismos de patogénesis de los ECEP típicos. Poseen una adhesina BFP (bundle-forming pilus) codificada en el plásmido EAF (EPEC adherence factor) . Dicha adhesina es responsable de la adhesión a distancia de la bacteria al enterocito y de la adhesión localizada a células HEp-2. Presentan también la isla de patogenicidad LEE (locus of enterocyte effacement) con los genes: eae, tir, esp y sep. El gen eae codifica una proteína de la membrana externa denominada intimina que es responsable de la adhesión íntima de la bacteria al enterocito. El gen tir (translocated intimin receptor) codifica el receptor celular al que se une la intimina. La bacteria, después de unirse a distancia al enterocito mediante las fimbria BFP, excreta el recerptor Tir que se fija al enterocito y a continuación la bacteria se une intimamente al enterocito al fijarse la intimina al receptor Tir. Los genes esp (E. coli secreted proteins) codifican proteínas necesarias para la producción de la lesión de adhesión y borrado (attaching and effacing) del microvilli intestinal y la condensación de la actina del citoesqueleto celular, que provoca la aparición de un pedestal en forma de copa sobre el que descansa la bacteria. Los genes sep (secretion of E. coli proteins) codifican las proteínas que constituyen un sistema de secreción de proteínas tipo III (5) . Los ECEP típicos generalmente presentan las intiminas alfa 1, beta 2, delta/kappa y my. Los ECEP atípicos, al igual que los ECEP típicos presentan el gen eae, pero carecen del gen bfp presente en el plásmido EAF de los ECEP típicos.
E. coli Enterotoxigénicos (ECET)
Los ECET son considerados en la actualidad, junto con los E. coli enteropatogénicos (ECEP) y los rotavirus, los patógenos que con mayor frecuencia causan gastroenteritis infantil, diarrea colérica y diarrea del viajero en países con condiciones higiénico/sanitarias deficientes. El agua y los alimentos contaminados han sido implicados como vehículos en la mayoría de los brotes. Los ECET sintetizan las enterotoxinas LT y/ó STa y poseen los factores de colonización intestinal CFA/I, CFA/II, CFA/III ó CFA/IV (3) . En España predomina las cepas de los serotipos O25:H- (STa CFA/III) , O153:H45 (STa CFA/I) , O169:H41 o H- (STa CFA/IV) (21, 22) .
E. coli Enteroinvasivos (ECEI)
Los ECEI son muy parecidos a los microorganismos del género Shigella ya que generalmente son incapaces de fermentar la lactosa, no son móviles, son lisina descarboxilasa negativos y además poseen antígenos O que presentan reacción cruzada con los de Shigella. Los genes necesarios para la invasividad son llevados por un plásmido (pInv) de 120 MDa en Shigella sonnei y por un plásmido de 140 MDa en las otras especies de Shigella y en E. coli. Además, también están implicados genes cromosómicos que regulan la transcripción de algunos de los genes plasmídicos. Los ECEI producen una enterotoxina de 63 kDa (ShET2) que se encuentra codificada en el gen plasmídico sen. Los ECEI pertenecen a un número reducido de serotipos. El serotipo más frecuente es el O124:H- (5, 3) .
E. coli Enteroagregativos (ECEA)
Los ECEA (o ECEAgg) se han asociado con la diarrea infantil en países en vías de desarrollo, y están particularmente asociados con la diarrea persistente de más de 14 días de duración. La bacteria produce una enterotoxina termoestable (EAST1, enteroaggregative ST1) de 4.100 Da y una citotoxina de 108 KDa que pueden ser responsables de la diarrea y de las lesiones histopatológicas (acortamiento de el villi) . La enterotoxina EAST1 y los factores de colonización AAF/I y II se encuentran codificados en plásmidos.
E. coli con adherencia difusa (ECAD)
Aunque su papel enteropatogénico no está claramente demostrado, se piensa que pueden causar diarrea en niños mayores de un ano de edad y en adultos. Se han descrito dos tipos de adhesinas: la fimbria F1845 y una proteína de la membrana externa conocida como AIDA-I (adhesin involved in diffuse adherence) . La detección de los ECAD se realiza fenotípicamente determinando si la cepa aislada presenta el patrón de adherencia difusa en células Hep-2 o genéticamente detectando las secuencias que codifican la fimbria F1845 (3, 5) .
Métodos de diagnóstico rápido
Las muestras a procesar deben ser representativas del tipo de infección y pueden ser de heces (coprocultivo) , orina (urocultivo) , sangre (hemocultivo) , exudado ó pus de una herida, una muestra de un líquido orgánico (ascítico, pleural, líquido cefalorraquideo) , bilis ó leche maternal. Los medios más frecuentemente utilizados para el aislamiento de E. coli son el agar MacConkey con lactosa y el medio eosina azul de metileno (EMB ó LEVINE) . Se trata de medios selectivos que diferencian las colonias en lactosa positivas y negativas. Aunque la mayoría de las cepas de E. coli son lactosa positivas, no se deben descartar el estudio de las colonias lactosa negativas, ya que entre el 5% de los E. coli que no son fermentadores de la lactosa se pueden encontrar cepas patógenas. Así, la mayor parte de los ECEI son lactosa negativos. En los urocultivos y hemocultivos también se emplea una placa de un medio no selectivo como el agar sangre. Recuentos superiores a 105 unidades formadoras de colonias por ml de orina son indicativos de una ITU (bacteriuria) . En muestras procedentes de lugares ó líquidos (sangre, líquido cefalorraquideo, etc...) habitualmente estériles cualquier crecimiento es indicativo de infección. El biotipado se puede realizar con una serie corta de pruebas bioquímicas: indol (+) , rojo metilo (+) , VP (-) , citrato (-) , SH2 (-) y ureasa (-) . No obstante, hay que tener en cuenta que hay cepas atípicas: indol (-) , citrato (+) , SH2 (+) ó ureasa (+) .
La muestra clínica más difícil de valorar para el microbiólogo clínico es la procedente de personas ó animales con diarrea, ya que al sembrar las heces en el agar MacConkey lactosa nos va a crecer casi siempre un abundante número de colonias de E. coli. Entonces, el problema consiste en diferenciar entre las cepas diarreagénicas de las no patógenas que forman parte de la microbiota normal del intestino grueso. Actualmente, la técnica más frecuentemente empleada para detectar los E. coli diarreagénicos es hacer una PCR múltiple capaz de detectar los genes de virulencia más representativos de los ECEP, ECET, ECEI, ECVT, ECEA y ECAD. Conviene probar una mezcla de al menos 10 colonias antes de descartar que el coprocultivo es negativo. Recordar que si se quiere recuperar el ECVT del serotipo O157:H7 se debe emplear una placa de MACSTC. A efectos epidemiológicos es muy importante determinar el serotipo O:H de la cepa aislada. En el caso de aislar un ECVT O157:H7 convendría determinar su fagotipo y patrón de electroforesis en campos pulsantes (PFGE) . Solamente en determinados laboratorios de investigación de referencia se realiza el serotipado completo, el fagotipado y la técnica de PFGE.
Los métodos genéticos (PCR convencional, PCR en tiempo real y microarrays de ADN) para el diagnóstico rápido de ECDI se basan en el estudio de los genes de virulencia e islas de patogenicidad.
La PCR clásica (revelada por electroforesis) es un método rápido, sensible, específico y económico que puede ponerse a punto en la mayoría de los laboratorios debido a que no requiere una infraestructura en aparatos muy costosa. No obstante, la PCR clásica presenta algunas limitaciones, como son:
•\vtcortaunaLa aparición de bandas inespecíficas que pueden ocasionar falsos positivos. •\vtcortaunaEl número máximo de genes que detectables en una PCR múltiple suele ser de 4 ó 5. •\vtcortaunaSe puede detectar el microorganismo problema pero no se puede cuantificar. •\vtcortaunaEl tiempo requerido oscila entre 3 y 4 horas. La PCR cuantitativa en tiempo real tiene dos importantes ventajas con respecto a la clásica:
•\vtcortaunaAcorta el tiempo del ensayo a tan solo 45 minutos, lo que permite procesar un mayor número de muestras por jornada de trabajo y obtener los resultados mucho antes. •\vtcortaunaTambién permite cuantificar, lo cual es especialmente importante en la microbiología de los alimentos para saber si la concentración de microorganismos presente en el alimento alcanza la dosis mínima infectiva. Los microarrays de ácidos nucleicos con respecto a las dos versiones de PCR presentan ventajas adicionales muy importantes:
•\vtcortaunaLa posibilidad de detectar conjuntamente los cientos de genes de virulencia encontrados en los diferentes tipos de E. coli causantes de infecciones intestinales y extraintestinales en seres humanos y animales en una sola prueba. •\vtcortaunaPermiten el análisis comparativo a nivel genómico entre estirpes, de manera que comparaciones entre estirpes patógenas y no patógenas pueden dar como resultado la identificación de nuevos genes de virulencia. •\vtcortaunaAdemás, se pueden emplear en experimentos de expresión génica y averiguar si se están expresando los genes de virulencia, por hibridación del ARNm específico. En cualquier caso, casi siempre es necesaria una etapa de amplificación y enriquecimiento mediante cultivos partir de las muestras originales. A veces es necesario aplicar técnicas de concentración inmunomagnética, según la cual anticuerpos contra diferentes serotipos son inmobilizados en soportes sólidos (como esferas magnéticas o de agarosa) y separados de la mezcla por atracción mágnética. Los métodos inmunológicos son específicos y sensibles pero a menudo se basan en la detección de un único epítopo, haciendo dificil la discriminación de diferencias sutiles específicas de estirpe. Puesto que la tecnología de microarrays de ADN permite la inmovilización de miles de sondas específicas en pocos centímetros cuadrados (1-4) , presenta un potencial enorme para proporcionar la detección e identificación de patógenos de una manera relativamente económica, flexible y específica. Existen varios trabajos ya publicados que emplean la tecnología de microarrays de ADN para la discriminación entre estirpes de E. coli patógenas y no patógenas. Así, la patente US2003119014 está relacionada con un biochip de oligonucleótidos para la detección de Escherichia coli K12.2.1. Por otra parte, la solicitud W09116446 trata sobre un método de amplificación de ADN con la enzima ADN polimerasa del bacteriófago Phi 29.
En el trabajo de Wu et al. (12) se construyó un microarray de ADN con fragmentos amplificados por PCR de genes específicos de E. coli patógenos O157:117, genes no patógenos de E. coli K12, genes comunes, y controles negativos. Tras el marcaje fluorescente de ADN bacteriano de diferentes muestras se distinguieron estirpes patógenas de no patógenas gracias al patrón de puntos fluorescentes del array. Así mismo se demostró la utilidad de esta metodología para detectar marcadores presentes en bacterias modificadas genéticamente. En Chizhikov y col. (10) se construyó un microarray de oligonucleótidos para la detección de factores de virulencia en E. coli. Concretamente se evaluó la presencia de seis genes (egea, sltl, sltll, clic, rfbE, e ipaH) que codifican determinantes antigénicos y factores de virulencia en 15 estirpes de E. coli, Salmonella, y Shigella. El ensayo se hizo mediante amplificación por multiplex PCR, y amplificación y marcaje fluorescente y posterior incubación con el microarray para comparar ambas metodologías. El análisis electroforético de los amplificados por PCR resultó ambiguo al aparecer bandas inesperadas, mientras que el resultado de la hibridación con el array fue mucho más específico. Otros trabajos en la misma línea describen la detección rápida con microarrays de estirpes patogénicas de E. coli a través de los genes de virulencia mediante el marcaje fluorescente de ADN total bacteriano y su posterior hibridación con un microarray (13) . En este trabajo el microarray de DNA contenía 105 fragmentos de PCR diferentes de genes de diferentes patotipos de E. coli. La combinación de métodos inmunomagnéticos y genéticos mejora la sensibilidad y especificidad. Así, las células obtenidas por separación inmunomagnética pueden ser sometidas a cultivo adicional o directamente a amplificación de ADN por PCR, ADN genómico y posterior análisis por microarrays (23) . Una aproximación genómica también es posible para analizar la diversidad de aislados patogénicos y comensales (11) . Se trata de usar un array genómico conteniendo todas las fases de lectura posibles de la estirpe MG1655 no patógena de E. coli K12 para experimentos de hibridación genómica comparativa (CGH) . Hasta un 10% de las ORFs de E. coli k-12 no fueron detectadas en los genomas de otras estirpes de E. coli, lo que pone de manifiesto la tremenda heterogeneidad genómica y diversidad genética entre las estirpes de E. coli.
Descripción de la invención
Clínicamente es muy importante identificar la cepa de E. coli diarreagénica ya que unas son más virulentas que otras o están asociadas a epidemias más o menos difíciles de controlar.
La metodología clásica para identificar las cepas de E. coli causantes de diarrea se basa en cultivos de laboratorio (24, 25) a partir de las muestras clínicas (heces, orina, exudados, sangre, etc) . Los medios más frecuentemente utilizados para el aislamiento de E. coli son el agar MacConkey con lactosa y el medio eosina azul de metileno (EMB ó LEVINE) . Se trata de medios selectivos que diferencian las colonias en lactosa positivas y negativas. Aunque la mayoría de las cepas de E. coli son lactosa positivas, no se deben descartar el estudio de las colonias lactosa negativas, ya que entre el 5% de los E. coli que no son fermentadores de la lactosa se pueden encontrar cepas patógenas. Así, la mayor parte de los ECEI son lactosa negativos. La muestra clínica más dificil de valorar para el microbiólogo clínico es la procedente de personas o animales con diarrea, ya que al sembrar las heces en el agar MacConkey lactosa crecen casi siempre un abundante número de colonias de E. coli. Entonces, el problema consiste en diferenciar entre las cepas diarreagénicas de las no patógenas que forman parte de la microbiota normal del intestino grueso. Para la identificación de cepas O157:H7 se emplea agar con medio Sorbitol-MacConkey, en el cual estas cepas que no fermentan eficientemente el sorbitol y aparecen colonias sin color entre otras de color rosado que sí fermentan el azúcar. Para evitar falsos positivos se confirma con pruebas inmunológicas para detectar los antígenos O157 y H7, o las toxinas Shiga (verotoxinas) . Pero algunas cepas O157 pueden ser H7 o no H7, y pueden tener sólo la toxina 1, la 2 o ambas.
Actualmente, la técnica más frecuentemente empleada para detectar los E. coli diarreagénicos es hacer una PCR múltiple capaz de detectar los genes de virulencia más representativos de los ECEP, ECET, ECEI, ECVT, ECEA y ECAD. Conviene probar una mezcla de al menos 10 colonias antes de descartar que el coprocultivo es negativo. Para recuperar el ECVT del serotipo O157:117 se debe emplear una placa de MACSTC. A efectos epidemiológicos es muy importante determinar el serotipo O:H de la cepa aislada. Y existen diferentes serotipos dentro de cada grupo de ECDI. Además, para los ECVT O157:117 es importante determinar su fagotipo y patrón de electroforesis en campo pulsante (PFGE) . Solamente en determinados laboratorios de investigación de referencia se realiza el serotipado completo, el fagotipado y la técnica de PFGE.
Por tanto, la presente invención aporta soluciones más rápidas y eficaces en cuanto a sensibilidad y fiabilidad (con menos falsos positivos) . La posibilidad que ofrecen los microarrays de ADN para rastrear la presencia de cientos a miles de genes simultáneamente es sin duda una herramienta que puede contribuir al análisis clínico de las múltiples cepas de E. coli tanto patógenas como no patógenas. El diseño y construcción de microarrays con sondas específicas para los diferentes grupos de ECDI agilizará tremendamente los análisis de muestras clínicas.
Por tanto, la presente invención se refiere al desarrollo de una o más sondas específicas así como de microarrays de ácidos nucleicos para la detección e identificación de los diferentes grupos de E. coli diarreagénicos (ECDI) así como la detección e identificación de las diferentes estirpes dentro de cada grupo, basado en la especificidad de los principales genes de virulencia para cada grupo de ECDI (ver tabla 1) .
Una realización particular de la invención es el desarrollo de un microarray para tipar las múltiples variedades de los genes eae, tir, espA, espB y espD de la isla de patogenicidad LEE de los ECVT y ECEP, capaz de identificar las nuevas intiminas recientemente descubiertas por el grupo dirigido por el Dr. Jorge Blanco: beta2 (AJ715407) , μψ (AJ705049) , νψ (AJ705050) , ξψ (AJ705051) , omicrón (AJ584840) , π (pi) (AJ705052) , ρ (ρηo (AJ748082) y σ (AJ781125) . (El grupo del doctor Blanco (coautor de la invención) es el centro de referencia de E. coli en España) .
En una realización particular de la invención se describe un método de ensayo basado en la amplificación y marcaje fluorescente del ADN cromosómico bacteriano extraído de cultivos, muestras clínicas, veterinarias, ambientales (aguas, suelos, excrementos animales, etc.) .
Diseño de un microarray de ADN para la detección de grupos de ECDI
Tras una búsqueda bibliográfica y en las bases de datos (por ejemplo: Genebank) , así como de los resultados obtenidos en nuestros laboratorios (Universidad de Santiago de Compostela y Hospital Xeral-Calde, Lugo) se obtuvo la secuencia de los genes específicos de cada grupo ECDI (ver número de acceso en la tabla 1) , así como las variantes genéticas de cada locus. Contamos con una extensa colección de cepas de referencia para verificar nuestros ensayos.
Con el fin de hacer una colección de sondas específicas de cada variante, se obtuvo la secuencia de todas las variantes de cada locus y se hicieron alineamientos usando los programas bioinformáticos más frecuentes (Clustal W, por ejemplo) .
Para cada locus definimos una sonda "universal" suficientemente conservada entre todas las variantes que permite identificar dicho locus, y una sonda específica de cada variante génica.
Se define sonda como una secuencia de bases nitrogenadas de entre adenina (A) , citosina (C) , guanina (G) , timina (T) o uracilo (U) , dispuestas en un polímero lineal que es total o parcialmente complementaria (apareamientos del tipo Watson y Crick: A-T/U o G-C) a otra presente en la muestra a analizar. Tales sondas pueden ser de ácidos nucleicos (ADN, ARN) , ácido nucleico peptídico (PNA) , u otros ácidos nucleicos sintéticos capaces de hibridar con otros ácidos nucleicos mediante apareamientos del tipo de Watson y Crick.
Dichas sondas pueden ser o un fragmento de ADN amplificado por PCR, o un oligómero de bases nitrogenadas (sintético u obtenido por digestión enzimática u otro medio químico o físico de un polímero existente) .
En una realización particular de la invención las sondas son oligonucleótidos sintéticos que llevan modificaciones en uno o en los dos extremos para facilitar la inmovilización a soportes sólidos. En la tabla 1 todas las sondas con las secuencias SEC. ID. NO. 1- SEC. ID. NO. 186 están modificadas con un grupo amino en 5' seguido de una cola de 10 timidinas.
Las sondas se diseñan y se construyen de tal forma que su secuencia de bases sea única para la variedad que representa, y de tal forma que las discrepancias (nucleótidos no complementarios) entre dos o más variantes suelen estar en las zonas centrales de los oligonucleótidos.
La longitud de los oligonucleótidos puede variar entre 5 o más bases, siendo preferentemente entre 11 y 30 nucleótidos la longitud más apropiada para discriminar entre dos secuencias muy similares pero no idénticas de ácidos nucleicos.
Una vez obtenida la colección de oligonucleótidos y/o fragmentos obtenidos por amplificación por PCR (amplicones) , se inmovilizarán en soportes sólidos convenientemente activados con grupos químicos como epoxy, amino, carboxilo, etc. Dichos soportes pueden ser de vidrio, nylon, silicio, plástico, oro, nitrocelulosa u otro polímero y pueden estar en formato bidimensional como los portas de microscopio, u obleas de silicio u oro, mallas tridimensionales, geles, coloides o en forma de micro y nanoesferas. En una realización particular, los soportes son portas de microscopio, que pueden estar activados con grupos epoxy por su eficiencia en la unión de moléculas y la rapidez con que ello ocurre (tan solo 10 minutos después de la impresión el array está listo para usar) , así como por la sencillez del tratamiento post-impresión. Las sondas se imprimen o colocan en el soporte, en forma de matriz ordenada ("arrays") uno o más arrays por porta, lo cual permite al menos dos análisis en paralelo. Puesto que el número de puntos no excederá de 100 o 200, es posible imprimir entre 1 y 18 arrays por porta, de tal forma que se pueden analizar hasta 18 muestras a la vez en un mismo chip.
Una vez impresos los arrays se procederá a comprobar su calidad mediante el análisis de estirpes tipo de cada uno de los grupos. Para ello se extrae el ADN cromosómico de un cultivo de cada cepa y se marca fluorescentemente (por incorporación de Cy5- dUTP o Cy5-dCTP por ejemplo, por la enzima ADNpol (Klenow) . La incubación posterior con el chip, lavado y escaneado rinde una imagen que es analizada por un software (Axon GenePix, por ejemplo) que permite la cuantificación relativa de la fluorescencia en cada punto. Los puntos fluorescentes por encima del fondo y de los controles negativos indican la presencia del gen correspondiente en la preparación de ADN y por tanto de la estirpe que lo originó.
Una vez comprobada la especificidad de cada sonda, se procede a determinar los límites de detección de cada una en mezclas complejas pero de composición conocida. En el caso de que alguna de las sondas dé resultados ambiguos se sustituirá por otra nueva hasta encontrar la adecuada.
Por último los chips se probarán con preparaciones de ADN de muestras clínicas. El ADN total bacteriano (plasmídico o cromosómico) se extrae mediante los métodos al uso en el arte.
Una realización particular de la invención comprende el análisis de múltiples cepas de E. coli diarreagénicas mediante microarrays de ADN a partir de muestras clínicas mediante los siguientes pasos:
a. Extracción de ADN de muestras clínicas, veterinarias o ambientales
b. Amplificación del ADN
c. Fragmentación del ADN
d. Marcaje del ADN
e. Hibridación con un microarray
f. Lavado
g. Lectura
h. Interpretación
Las muestras clínicas pueden ser de heces, coprocultivos, orina, pus, esputos, aislados, etc; las muestras veterinarias pueden ser heces animales, leche, alimentos, carnes (1 célula de E. coli/g es suficiente para provocar una infección) , etc; y las muestras ambientales pueden ser aguas (residuales o no) , suelos, etc. El ADN se puede extraer con cualquiera de los métodos conocidos y descritos para tal fin.
En caso de que la cantidad de ADN obtenida sea limitante, se procede a una amplificación por métodos de amplificación de ADN como el llamado método de amplificación por desplazamiento múltiple (MDA por "Multiple Displacement Amplification") . En particular, tal amplificación se puede hacer con la ADN polimerasa del bacteriófago phi29 (patente nº US5001050, WO9116446) . A partir del ADN total, amplificado o no, se procede a una amplificación del gen o los genes objeto de análisis mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . La reacción de PCR puede ser simple (un solo gen amplificado) , múltiple (multiplex PCR) si se amplifican varios genes a la vez, o PCR de largo alcance para amplificar un fragmento relativamente largo de ADN (de 5 a 50 kpb) que contenga grupos de genes objeto de análisis.
Cuando el ADN es de tamaño grande (más de 5 kpb) se requiere una fragmentación en tamaños de entre 0, 5 a 3 kpb para favorecer los procesos de hibridación. La fragmentación puede ser por métodos físicos (presión, cizalla, ultrasonidos, etc.) , químicos (modificación química de algunas bases y corte con piperidina, por ejemplo) , o bioquímicos (cortes con enzimas de restricción) . En una realización particular de la invención el ADN se fragmenta mediante la aplicación de ultrasonidos durante 10 a 60 segundos por inmersión de un tubo con la muestra en un baño de agua situado sobre una sonda de ultrasonidos. La frecuencia de los ultrasonidos y el tiempo de sonicación determinan el tamaño de los fragmentos de ADN que se obtiene.
El marcaje del ADN puede ser con compuestos fluorescentes, con radioisótopos (32P, 33P, 35S, etc.) , con biotina, con bromo, o con cualquier otro compuesto marcador. Dicho marcaje se puede realizar por incorporación directa de nucleótidos ya modificados en las reacciones de amplificación. En una realización particular se emplean dUTP o dCTP previamente marcados con fluorocromos como Cy3, Cy5, Alexa 647, Alexa 488, etc. en las reacciones de amplificación con PCR o por extensión al azar con la ADN polimerasa "Klenow". En una realización particular el marcaje se hace por incorporación química de reactivos (como átomos de Bromo) a las bases del ADN, en concreto en la posición 7 de las guaninas, como funciona el método comercial ULYSES (Molecular Probes) . En una realización particular el marcaje se hace por incorporación enzimática de precursores nucleotídicos previamente marcados con radioisótopos (32P, 33P, 35S, etc) o con biotina.
La muestra de ADN marcada se pone en contacto con las sondas inmovilizadas en un soporte para que tenga lugar la hibridación entre ácidos nucleicos. El proceso se lleva cabo utilizando las soluciones y los procedimientos al uso en el arte. En una realización particular de la invención una misma muestra es dividida e incubada simultáneamente en varios arrays en tampones con concentraciones crecientes de agentes desestabilizadores de la hibridación (formamida, DMSO, etc.) . En otra realización particular, la muestra es incubada en varios arrays con el mismo tampón pero en temperaturas crecientes. De esta forma se obtienen patrones dinámicos de hibridación que ayudan a identificar las hibridaciones específicas.
Después de la incubación del ADN marcado con los arrays de sondas, los chips son lavados con las soluciones y tampones al uso, y el resultado de la hibridación es leído con los dispositivos técnicos adecuados según el sistema de marcaje que se empleó. En una realización particular el ADN se marca con un compuesto fluorescente y el resultado de la hibridación se lee con un dispositivo óptico (cámara CCD, escáner, etc.) . Si el marcaje se hace con un compuesto radiactivo, el resultado se revela con una película de radiosensible. Si el ADN se marca con biotina, o con bromo, el resultado se puede revelar con un anticuerpo anti-biotina o anti-bromo fluorescentes, streptavidina fluorescente, o cualquiera de los dos anteriores acoplados a una enzima (como "horse radish preoxidase" o HRP, fosfatasa alcalina, etc.) para generar un producto medible en presencia de un sustrato adecuado.
Una realización particular de la invención comprende el análisis de múltiples cepas de E. coli diarreagénicos mediante microarrays de ADN a partir de muestras clínicas mediante los siguientes pasos:
a. Enriquecimiento de la muestra mediante cultivos en medios selectivos
b. Extracción de ADN de muestras de cultivos
c. Amplificación del ADN (si es necesario)
d. Fragmentación del ADN (si es necesario)
e. Marcaje del ADN
f. Hibridación con un microarray
g. Lavado
h. Lectura
i. Interpretación
En una realización particular de la invención el ADN sin marcar se incuba directamente con las sondas del array y la lectura se realiza mediante métodos espectrométricos (por ejemplo, espectrometría de masas) , o por resonancia de plasmon en superficie ("surface plasmon resonance") .
Una realización particular de la invención comprende el análisis de múltiples cepas de E. coli diarreagénicos mediante PCR con oligonucleótidos específicos a partir de muestras clínicas mediante los siguientes pasos:
a. Extracción de ADN de una muestra clínica o de un coprocultivo b.Amplificación por PCR con al menos uno de los oligonucleótidos específicos que se muestran en la tabla 1. El ADN puede extraerse mediante cualquiera de los métodos al uso, o bien mediante una lisis rápida de la muestra en un tubo con agua. El ADN así liberado es usado como molde para la amplificación por PCR con oligonucleótidos específicos. Cuando las muestras biológicas están suficientemente concentradas es posible realizar el proceso de liberación del ADN y la PCR en un mismo tubo, simplemente tomando una pequeña muestra de células y añadiéndolas al mismo tubo que contiene los reactivos para la reacción de PCR. La reacción de PCR puede ser sencilla o múltiple, clásica o en tiempo real.
Otro objeto de la presente invención, se refiere a un kit para la detección e identificación de diferentes estirpes de Escherichia coli diarreagénicos, presentes en muestras clínicas, veterinarias, aguas, suelos, heces, piensos, y en general cualquier tipo de muestras, que comprende:
a. Uno o más biochips conteniendo uno o más microarrays con al menos uno de los oligonucleótidos con las secuencias SEC. ID. NO. 1- SEC. ID. NO. 350. b. Al menos un tipo de ADN de alguna estirpe de E. coli diarreagénico como control c. Al menos un juego de oligonucleótidos de entre los que figuran en las tablas 2 (SEC. ID. NO. 187- SEC. ID. NO. 350) y 3 que sirvan de iniciadores para amplificar por PCR al menos uno de los genes de la isla LEE d. Medios para el aislamiento de ADN total bacteriano e. Medios para la amplificación de ADN bacteriano f.Medios para la amplificación y marcaje simultáneos de una parte o de todo el ADN bacteriano. g. Medios para el marcaje y purificación de ADN h. Medios para la hibridación del ADN con los microarrays i. Software para la interpretación de los resultados Otro objeto de la presente invención, se refiere a un kit para la detección e identificación de diferentes estirpes de Escherichia coli diarreagénicos, presentes en muestras clínicas, veterinarias, aguas, suelos, heces, piensos, y en general cualquier tipo de muestras, que comprende:
a. Medios para el aislamiento de ADN total bacteriano b. Al menos un tipo de ADN de alguna estirpe de E. coli diarreagénico como control. c. Medios para la amplificación de ADN total bacteriano d. Al menos un oligonucleótido con las secuencias SEC. ID. NO. 1-SEC. ID. NO. 350 que sirvan de iniciadores para la amplificación específica de al menos uno de los genes de la isla LEE mediante PCR clásica, PCR en tiempo real, RT-PCR, etc. (Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Secuencias de las diferentes sondas de oligonucleótidos del microarray STEC-EPEC descrito en la presente invención. (Lista de todas las sondas de oligonucleótidos que van incluidas en los biochips descritos en la presente invención o que sirven como iniciadores para reacciones de PCR) 
TABLA 2 Cebadores para PCR y condiciones de amplificación específica de los genes de virulencia de E. coli verotoxigénicas y enteropatogénicas 
TABLA 3 Serotipos y genes de virulencia de las estirpes caracterizadas por los métodos de la presente invención. (Resultados de las amplificaciones por PCR con oligonucleótidos específicos para el genotipado de estirpes de E. coli diarreagénicos) 
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Ejemplo de dos microarrays conteniendo sondas específicas de 16 variantes del gen eae, 4 del gen tir, 4 de espA, 3 de espB y 3 de espD. Resultados obtenidos tras la hibridación con los fragmentos amplificados por PCR de las estirpes tipo de las variantes eae-λ y eae-μ.
Figura 2. Microarray hibridado con los productos de una PCR múltiple (multiplex PCR) para los cinco genes de la isla LEE de la estirpe tipo para eae-η (FV3671) .
Figura 3. Microarray hibridado con el producto de una PCR de largo alcance (LR-PCR) que comprende los 5 genes de la isla LEE de la estirpe FV3671.
Figura 4. Microarray hibridado con el ADN cromosómico total de la estirpe tipo de eae-ι (FV3676) .
Figura 5. Microarray hibridado con el ADN genómico amplificado a partir de 10 pg del ADN de la cepa tipo para eae-ι.
Ejemplos de realización de la invención
Desarrollo de un biochip para la detección e identificación de variantes de intiminas de ECVT
Se diseñó y se construyó un biochip con una o más sondas para cada una de las variantes de los genes de intiminas conocidas hasta el momento. El biochip contenía sondas específicas para las variantes eae- α1, α2, β1, β2, γ1, γ2, δ, \varepsilon, ζ, η, ι, λ, μ, ν, ξ, así como sondas universales para el gen eae y otras universales y específicas para los genes espA, espB, espD y tir (tabla 2) . Las sondas son oligonucleótidos sintéticos con una amina alifática (6 C) en 5' seguida de un oligo-dT (10T) y de la secuencia específica (entre 15 y 30 nucleótidos) . Las sondas se imprimieron en una concentración de 60 microM en portas de vidrio activados con grupos epoxy utilizando robots de impresión de microarrays (micromatrices) comerciales. Se imprimieron al menos dos micromatrices por porta para poder realizar al menos dos ensayos por porta. Se procedió como sigue:
Se extrajo el ADN cromosómico de cada una de las estirpes tipo de ECVT recibidas de la colección del Centro Nacional de Referencia de E. coli.: FV3480; FV3481; FV3482; FV3489; FV3490; FV3491; FV3492; FV3493; FV3514b; FV3515; EPEC8; IH2498a; EPEC4; FV359; O157-156; VTB351; EPEC9; VTB286; VTO-50; FV3671; FV3676; 68-4; FV380; IH1229a; B49a; IH1301a; IH2997f.
Se partió de un cultivo de 5 ml en medio LB donde inoculó la noche anterior la cepa correspondiente a partir del medio de transporte en el que se recibió. El cultivo creció a 37ºC 12 h y con agitación de 200 rpm. Utilización del kit de extracción de DNA, GNOME de Q-BIOgene, número de catálogo 2010-400.
Ejemplo 1
Amplificación y marcaje por PCR de los genes de la isla LEE. Hibridación en un microarray de oligonucleótidos
a. Se amplificó por PCR un fragmento de cada gen utilizando un oligonucleótido universal y otro específico de cada estirpe. Cada fragmento se marcó fluorescentemente mediante la incorporación de Cy3- o Cy5-dUTP en la misma reacción de amplificación. Dicha amplificación se llevó a cabo como sigue: 1 ug de ADN molde, 3 mM de MgCl2, 100 μM de dATP, dCTP, y dGTP, 50 μM de dTTP, 50 μM de Cy5-dUTP (Amersham Biosciences) , 200 μM de cada par de primer iniciador (EAE- 1 como directo, y EAE- A, EAE- A2R, EAE- D3R, EAE- ep2R, EAE- C1, EAE- C2, EAE- et2R, LP-7, EAE- L2R, FV373-R, EAE- N2R, IH2997f-R, EAE- RB, EAE- Z2R como reverse para eae- α1, α2, δ, γ1, \varepsilon, γ2, η, ι, λ, μ, ν, o, ξ y ζ respectivamente; cebador directo EAE- F y reversos EAE- B8R y EAE- B5R para eae- β1, y β2 respectivamente; pares de cebadores TIR- I1 F/TIR- I1 R, TIR- II1 F/TIR- II1 R, TIR- III1 F/TIR- III1 R, y TIR- IV 1 F/TIR- IV 1R para tir- α1, β1, γ1, y γ2 respectivamente; ESPA-1 como directo y ESPA-I1R, ESPA-II1R, ESPA-III1R, y ESPA-IV1R como reversos para espA- α1, β1, β2, y γ1 respectivamente; ESPB-F como directo y ESPB-I1 R, ESPB-II1 R, y ESPB-III1R como reversos para espB- α1, β1, y γ1 respectivamente; y ESPD-4F como directo y ESPD-I 1R, ESPD-II1 R, y ESPD-III 1R como reversos para espD-α1, β1, y γ1 respectivamente) , y 1 unidad de ADN polimerasa Taq Platinum en su tampón de reacción (Invitrogen) . El programa utilizado en el termociclador es el siguiente para todos los casos excepto para eae betal y eae beta2: 95ºC-5 min; (95ºC-20 s; 60ºC-30 s; 68ºC-1 min 30 s) 10X; (95ºC-20 s; 58ºC-30 s; 68ºC-1 min 30 s +5 s/ciclo) 30X; 68ºC-10 min; Mantenido a 4ºC. Para eae betal el programa utilizado es el siguiente: 95ºC-5 min; (95ºC-20 s; 55ºC-30 s; 68ºC-1 min 30 s) 10X; (95ºC-20 s; 53ºC-30 s; 68ºC-1 min 30 s +5 s/ciclo) 25X; 68ºC -10 min; Mantenido a 4ºC. Para eae beta2 el programa utilizado es el siguiente: 95ºC-5 min; (95ºC-30 s; 55ºC-30 s; 72ºC-1 min 30 s) 35X; 72ºC-10 min; Mantenido a 4ºC. b. El fragmento de ADN amplificado se separó del nucleótido no incorporado mediante una purificación en columna comercial. La cantidad y calidad del marcaje se examinó por métodos espectrométricos. c. Se mezcló en un tampón de hibridación, se desnaturalizó por calentamiento a 95ºC durante 5 min y se incubó con los biochips previamente lavados tal y como indica el proveedor (TeleChem international) . Se incubó durante 12 h a 55ºC bajo un cubre y dentro de una cámara de hibridación herméticamente cerrada a su vez sumergida en un baño de agua a la temperatura indicada. d. Se lavó en 2X SSC + SDS 0.1% durante 5 minutos, se secó por centrifugación y se escaneó en un escáner comercial equipado con dos láser para excitar el fluorocromo utilizado en cada ensayo. La imagen se analizó y la intensidad de los puntos fluorescentes se cuantificó con software comercial. El resultado obtenido con las cepas tipo de las variedades eae-mu (FV380) y lambda (68-4) se muestra en la figura 1. Los fragmentos amplificados y marcados de cada estirpe tipo sólo dan una señal fluorescente con las sondas diseñadas para ellas.
(Tabla pasa a página siguiente)
Ejemplo 2
Amplificación y marcaje de los genes eae, tir, espA, espB y espD de la estirpe FV3671 mediante multiplex PCR. Hibridación con un microarray de oligonucleótiodos
Varios pares de oligonucleótidos fueron empleados para amplificar y marcar simultáneamente 2 o más genes de la isla LEE (fig 2) . Se realizaron PCRs multiplex con los genes eae, tir, espA, espB y espD. Para ello se utilizaron las cepas FV3671 y
(Tabla pasa a página siguiente)
En la reacción se incorporaron nucleótidos marcados con fluorocromo según la mezcla que se detalla a continuación:
e. El programa utilizado en el termociclador es el siguiente para todos los casos excepto para eae betal y eae beta2: 95ºC - 5 min; (95ºC - 20 s; 50ºC - 30 s; 68ºC - 1 min) IOX; (95ºC - 20 s; 48ºC - 30 s; 68ºC - 1 min +5 s/ciclo) 25X; 68ºC - 10 min; Mantenido a 4ºC. Los fragmentos de ADN amplificados se separaron del nucleótido no incorporado mediante una purificación en columna comercial. La cantidad y calidad del marcaje se examinó por métodos espectrométricos.
f. Se mezclaron en un tampón de hibridación, se desnaturalizaron por calentamiento a 95ºC durante 5 min. y se incubaron con los biochips previamente lavados tal y como indica el proveedor (TeleChem international) . Se incubaron durante 12 h a 55ºC bajo un cubre y dentro de una cámara de hibridación herméticamente cerrada a su vez sumergida en en un baño de agua a la temperatura indicada. g. Se lavó en 2X SSC + SDS 0.1% durante 5 min., se secó por centrifugación y se escaneó en un escáner comercial equipado con dos láser para excitar el fluorocromo utilizado en cada ensayo. La imagen se analizó y la intensidad de los puntos fluorescentes se cuantificó con software comercial. El resultado obtenido con la cepa FV3671 (eae- η) se muestra en la figura 2. Además de las sondas universales, dan señal positiva las sondas específicas diseñadas para cada gen: eae- η, tir-α1, espA-β1, espB-α1, espD-α1. Ejemplo 3
Amplificación y marcaje de varios genes de la isla LEE mediante PCR de largo alcance (LR-PCR)
Aquellos genes que aparecen agrupados en el genoma (como la isla LEE) se pueden amplificar y marcar mediante una sola reacción de amplificación utilizando oligonucleótidos universales a ambos lados de la agrupación génica (cluster) .
Se diseñaron los oligos TIR- UP y espB- DOWN para amplificar por PCR de largo alcance la isla de patogenicidad LEE completa. La enzima utilizada para la amplificación ha sido Expand-Long Template de la casa Roche con Nº de catálogo 1 681 842. Según la siguiente mezcla:
El termociclador empleado fue un GeneAmp PCR system 2700 de Applied Biosystems. El programa utilizado fue el siguiente: 95ºC-5 min; (95ºC-20 s; 55ºC-30 s; 68ºC-10 min) 15X; (95ºC-20 s; 55ºC-30 s; 68ºC-10 min + 20 s/ciclo) 30X; 68ºC 10 min; Hold 4ºC.
h. El fragmento de ADN amplificado se separó del nucleótido no incorporado mediante una purificación en columna comercial. La cantidad y calidad del marcaje se examinó por métodos espectrométricos. i. Se mezcló en un tampón de hibridación, se desnaturalizó por calentamiento a 95ºC durante 5 min. y se incubó con los biochips previamente lavados tal y como indica el proveedor (TeleChem international) . Se incubó durante 12 h a 55ºC bajo un cubre y dentro de una cámara de hibridación herméticamente cerrada a su vez sumergida en un baño de agua a la temperatura indicada. j.Se lavó en 2X SSC + SDS 0.1% durante 5 minutos, se secó por centrifugación y se escaneó en un escáner comercial equipado con dos láser para excitar el fluorocromo utilizado en cada ensayo. La imagen se analizó y la intensidad de los puntos fluorescentes se cuantificó con software comercial. El resultado obtenido con la cepa FV3671 (eae- η) se muestra en la figura 3. Además de las sondas universales, dan señal positiva las sondas específicas diseñadas para cada gen: eae- η, tir-α1, espA-β1, espB-α1, espD-α1.
Ejemplo 4
Fragmentación y marcaje del ADN cromosómico total e hibridación con un microarray de oligonucleótidos específicos
Un volumen de 60 μl de TE 10 mM pH 8 con 100 ng/ml de ADN de cada estirpe se fragmentó por sonicación en un eppendorf de 200 μ1 con el sonicador MISONIX modelo XL2010 utilizando el accesorio "cup horn" durante 10 s a potencia 10. Así, se consiguen fragmentos entre 850 bp y 4000 bp.
Dicho ADN se marcó con Cy3- o Cy5-dUTP y la ADN polimerasa Klenow usando oligonucleótidos hexámeros de secuencia aleatoria como cebadores. La reacción fue como sigue: En un eppendorf de 1, 5 ml se añaden:
•\vtcortauna μl de ADN sonicado (2 μg) •\vtcortauna μl de agua •\vtcortauna μl de buffer ECOPOL •\vtcortauna μl de cebadores random (500 ng/μl) Esta mezcla se lleva a 95ºC durante 5 min y luego se coloca en hielo.
Se añaden a la mezcla 5 μl de 10x dNTP's mix manteniéndolo todo en hielo.
10x dNTP's mix
1, 2 mM de dATP, dCTP, dGTP
0, 6 mM dTTP
mM Tris 8.0 1 mM EDTA
Se añaden 3 μl de Cy5-dUTP (25 nmol) , 1 μl de enzima klenow biolabs (50 U/μl) .
Se incuba a 37ºC de 1 a 2 horas y después se para la reacción con 5 μl de EDTA 0, 5 M pH 8. Se purificaron de los fragmentos marcados, se mezclaron en un tampón de hibridación, se desnaturalizó por calentamiento a 95ºC durante 5 min y se incubó con los biochips previamente lavados tal y como indica el proveedor (TeleChem international) . Se incubó durante 12 h a 55ºC bajo un cubre y dentro de una cámara de hibridación herméticamente cerrada a su vez sumergida en un baño de agua a la temperatura indicada. Se lavó en 2X SSC + SDS 0.1% durante 5 minutos, se secó por centrifugación y se escaneó en un escáner comercial equipado con dos láser para excitar el fluorocromo utilizado en cada ensayo. La imagen se analizó y la intensidad de los puntos fluorescentes se cuantificó con software comercial.
En la figura 4 se muestra el resultado obtenido con la estirpe FV3676 (eae- ι) Se detectan señales específicas para cada estirpe en los diferentes genes testados. Si bien la señal no es tan intensa como cuando se emplea un fragmento de PCR marcado, este método permite el análisis de todo el genoma frente a un gran número de sondas.
Ejemplo 5
Amplificación y marcaje de muestras de ADN total e hibridación con un microarray de oligonucleótiodos
A veces la cantidad de ADN de las muestras a analizar es muy baja y limita la realización de los ensayos. En estos casos se procede a la amplificación de todo el ADN mediante la técnica de "Desplazamiento Múltiple" con enzimas que replican en forma de círculo rodante, como la ADN polimerasa del bacteriófago Phi29. Existen kits comerciales como el denominado "Genomiphi" de la casa Amersham Biosciences, que permite la obtención de microgramos de ADN total a partir de picogramos.
A partir de muestras de 100 pg de la estirpe FV3676 (correspondiente a la variedad eae- ι) , se amplificó el ADN usando el kit Genomiphi. Hasta 2 ug de ADN total se fragmentaron por sonicación (fragmentos de 500-2500 pb) , se marcaron fluorescentemente con Cy-5 y se hibridaron con un biochip en las mismas condiciones mencionadas anteriormente. Tras el lavado y escaneado, el resultado se muestra en la figura 5.
Ejemplo 6
Detección de las variantes genéticas de la isla LEE mediante amplificación por PCR con oligonucleótidos específicos
Diferentes variantes del gen eae fueron determinadas mediante amplificación por PCR con oligonucleótidos específicos de entre los que aparecen en la tabla 1. En la tabla 3 se muestra el resultado del tipado de variantes de intiminas mediante PCR.
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