Procedimiento para la obtención de ácido trans- comúnico y derivados a partir de Cupressus sempervirens L.
Objeto de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento de aislamiento y purificación de ácido labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oico, también conocido como ácido trans- comúnico (1) , en su forma de sal sódica (4) , a partir de las partes aéreas de Cupressus sempervirens L. A partir de (4) se obtienen con elevada pureza el ácido 1 y el éster metílico 5.
Estado de la técnica
Los ácidos comúnicos (1-3) son diterpenos labdánicos naturales que se encuentran ampliamente distribuidos en diversas especies vegetales y particularmente en los géneros Juniperus y Cupressaceae. Fue descrito por vez primera su aislamiento en 1961 de la corteza de Juniperus communis L. [V.P. Ar y a, C. Enzell, H. Erdtman y T. Kubota, 1961, Acta Chem. Scand, 15, 225]. Años después se describió su presencia en los frutos de esta misma especie y en los de Juniperus oxycedrus L. [J. de Pascual Teresa, A. San Feliciano y J.M. Miguel del Corral, 1974, An. Quim., 70, 1015]. Más recientemente se ha descrito su aislamiento de la madera de esta última especie y de la de Juniperus sabina L. [A.F. Barrero, J.F. Sánchez y J. Altarejos, 1987, Ars Pharm., 28, 449].
También se ha descrito el aislamiento de ácidos comúnicos (1-3) de la oleorresina [L. Mangoni y M. Belardini, 1964, Tetrahedron Lett., 2643] y de los frutos [A. Ahoud, P. Camero y B. Gastambide, 1964, Bull. Soc. Chim. Fr., 348] de Cupressus sempervirens L.
Estudios realizados durante los últimos años han revelado que los ácidos comúnicos (1-3) y algunos compuestos relacionados poseen significativa actividad biológica. Así, se ha comprobado cierto efecto inhibitorio en la activación del antígeno del virus Epstein-Barr (EBV-EA) [R. Tanaka, H. Ohtsu, M. Iwamoto, T. Minami, H. Tokuda, H. Nishino, S. Matsunaga y A. Yoshitaka, 2000, Cancer Lett., 161, 165]. También se ha descrito cierta actividad antibacteriana [B. Trusheva, M. Popova, V. Baukova, 1. Tsvetkova, C. Nay denski y A.G. Sabatini, 2003, Rivista Ital., 36, 3]. Recientemente se ha patentado el uso del aceite esencial de Cupressus sempervirens L, en el que, entre otros muchos terpenoides, se encuentran estos ácidos, como insecticida y repelente de insectos [G. Campresse y S. Campresse, 2004, Patente FR 2003-3149, 20030314].
Además de la actividad biológica que presentan los ácidos comúnicos (1-3) y compuestos relacionados, estos diterpenos presentan interés debido a sus características estructurales, que los convierten en productos de partida adecuados para la síntesis de productos de interés. Así, se han empleado en la preparación de productos olorosos tipo ambar-gris [A.F. Barrero, J. Altarejos, E.J. Alvarez-Manzaneda, J.M. Ramos y S. Salido, 1993, Tetrahedron, 49, 6251, 9525; A.F. Barrero, J. Altarejos, S. salido, 1995, Patente ES 93-9300946, 19930504], en la síntesis de lactonas antifúngicas [A.F. Barrero, J.F. Sánchez y J. Elmerabet, 1995, Tetrahedron Lett., 36, 5251; A.F. Barrero, S. Arseniyadis, J.F. Quílez del Moral, M. Mar Herrador, M. Valdivia y D. Jiménez, 2002, J Org. Chem., 67, 2501] y en la preparación de compuestos con actividad antitumoral [T. Katoh, R. Tanaka, M. Takeo, K. Nishida y M. Noda, 2002, Chem. Pharm. Bull., 50, 1625; E.J. Alvarez-Manzaneda, J.L. Romera, A.F. Barrero, R. Alvarez-Manzaneda, R. Chahboun, R. Meneses y M. Aparicio, 2005, Tetrahedron, 61, 837; A.F. Barrero, E.J. Alvarez-Manzaneda, R. Chahboun, R. Meneses, J.M. Cuerva, M. Aparicio y J.L. Romera, 2001, Org. Lett., 3, 647].
A pesar del gran interés de este tipo de ácidos diterpénicos y de su abundancia en las fuentes vegetales que los contienen, hasta el momento no se ha descrito un procedimiento eficiente para el aislamiento y purificación del ácido trans- comúnico (1) contenido en Cupressus sempervirens L. Además, hasta la fecha sólo se ha descrito su presencia en los frutos, en la corteza y en la resina de esta especie. Nuestras investigaciones han revelado su presencia en gran cantidad en las hojas de C. sempervirens L, lo que permite un mayor aprovechamiento de la fuente vegetal.
Descripción de la invención
La presente invención expone diversos procedimientos para el aislamiento y purificación del ácido trans- comúnico (1) , en forma de sal sódica (4) , a partir de los frutos de Cupressus sempervirens L., de las hojas de esta especie vegetal, y de la combinación de frutos y hojas, partes aéreas, de esta planta. Se describe asimismo un procedimiento eficaz para la transformación de la sal (4) en el ácido (1) y en el éster metílico (5) .
El estudio de la composición de los frutos de distintas especies de Juniperus y Cupressus ha revelado que J. oxycedrus y C. sempervirens contienen un único isómero. Así, del extracto hexánico de las arcéstidas de J. oxycedrus se obtuvo únicamente ácido mirceo-comúnico (3) (4.2% del peso de planta) ; mientras que en el correspondiente a las arcéstidas de C. sempervirens sólo se encontró ácido trans- comúnico (1) , aislado en forma de sal sódica (2.3% del peso de planta) . El procedimiento consistió en la extracción en sistema Soxhlet del material vegetal seco y triturado durante 12 horas, separación de las ceras mediante precipitación de las soluciones concentradas enfriadas a 0°C, y posterior precipitación de la sal del ácido mediante adición de solución acuosa alcalina sobre la solución hexánica concentrada.
Tanto la elevada proporción de ácido trans- comúnico (1) encontrado en los frutos de C. sempervirens L., como la gran abundancia de esta especie vegetal, nos animaron a investigar la composición de los correspondientes extractos de las hojas. Inicialmente se estudió el extracto hexánico, que mediante un procedimiento similar al utilizado en las arcéstidas permitió también el aislamiento de una importante cantidad de sal sódica (4) del ácido trans- comúnico (1.9% del peso de planta) .
Con objeto de desarrollar procesos menos laboriosos y por tanto, más rentables, se investigó también el aislamiento de ácido trans- comúnico (1) del extracto hexánico de toda la parte aérea de C. sempervirens L., constituída por frutos, hojas y pequeñas ramas. Tras extraer en sistema Soxhlet todo el material vegetal, seco y triturado, se obtuvo, siguiendo el procedimiento ya comentado para frutos y hojas, la correspondiente sal sódica (4) del ácido trans- comúnico (2.0% del peso en planta) .
Se han investigado también otros disolventes y condiciones que permitan obtener el ácido trans- comúnico (1) y sus derivados mediante procesos más sencillos y rentables. Los mejores resultados se han alcanzado utilizando cloruro de metileno. Inicialmente se ensayó la extracción en sistema Soxhlet del material vegetal, triturado y seco, durante 6 horas. Tras evaporar el disolvente, se procedió al descerado mediante precipitaciones sucesivas de las soluciones hexánicas concentradas a 0°C. La sal sódica (4) se obtuvo siguiendo el mismo procedimiento indicado en el caso de la extracción con hexano. Así se obtuvo en el caso de los frutos una cantidad de sal sódica de ácido trans- comúnico, correspondiente a un 1.9% del peso de planta, mientras que las hojas proporcionaron el equivalente a un 1.5% del peso de planta y el conjunto de partes aéreas un 1.6% del peso de planta.
Con objeto de simplificar el proceso de extracción, se ensayó la maceración con cloruro de metileno. Tras someter el material vegetal triturado y seco a maceración en este disolvente durante 4 horas, y operando con la solución resultante de modo similar al ya indicado para la extracción con cloruro de metileno en Soxhlet, se obtuvo la correspondiente sal (4) . El estado de pureza de la sal obtenida mediante maceración resultó superior al de la obtenida mediante maceración en sistema Soxhlet. Los frutos rindieron un 2.1% en peso de planta, las hojas un 1.8%, y el conjunto de partes aéreas aproximadamente un 1.9% en peso de planta.
Modo de realización
Obtención de labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oato sódico (4) a partir de las arcéstidas de C. sempervirens L. mediante extracción con hexano en sistema Soxhlet
500 g de material vegetal, seco y finamente triturado, se extrae en sistema Soxhlet con hexano (3 L) durante 12 horas. Transcurrido este tiempo se evapora el disolvente hasta aproximadamente un 20% del volumen inicial. La solución resultante se mantiene durante 12 horas a 0°C, filtrando el precipitado resultante, constituido por ceras. El filtrado obtenido se somete dos veces más a esta operación. A continuación, sobre la solución hexánica descerada se añade, bajo agitación, NaOH 2N (500 mL) , separándose un sólido incoloro, constituido por la sal (4) . Se filtra a vacío, lavando con pequeñas porciones de hexano frío, primero, y agua fría después, obteniéndose 11.5 g de producto (2.3% del peso de planta) . Mediante dos recristalizaciones en MeOH-H2O se obtiene un sólido cristalino de punto de fusión constante.
Sólido cristalino incoloro. P.F. 227-228°. [α]D 24° (MeOH) .
IR (KBr) : 3085, 2936, 2843, 1642, 1547, 1467, 1404, 1350, 1298, 1256, 1188, 989, 888 cm- 1.
RMN-1H (CD3COCD3, 300 MHz) : δ 0.71 (3H, s, Me-10) , 1.09 (3H, s, Me-4) , 1.73 (3H, s, Me-13) , 4.41 (1H, sa, H-17) , 4.75 (1H, sa, H-17') , 4.82 (1H, da, J = 10.9 Hz, H-15) , 5.01 (1H, da, J = 17.5 Hz, H-15') , 5.42 (1H, ta, J = 6.5 Hz) , 6.30 (1H, dd, J = 17.5 y 10.9 Hz) .
RMN-13C (CD3COCD3, 75 MHz) : δ 41.0 (C-1) , 21.6 (C-2) , 39.8 (C-3) , 45.7 (C-4) , 57.7 (C-5) , 27.4 (C-6) , 40.5 (C-7) , 150.1 (C-8) , 57.7 (C-9) , 41.2 (C-10) , 24.0 (C-11) , 135.4 (C-12) , 133.7 (C-13) , 142.6 (C-14) , 109.9 (C-15) , 11.9 (C-16) , 107.0 (C-17) , 31.0 (C-18) , 184.5 (C-19) , 13.9 (C-20) .
Obtención de labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oato sódico (4) a partir de las hojas de C. sempervirens L. mediante extracción con hexano en sistema Soxhlet
Se sigue un procedimiento similar al descrito para las arcéstidas, pero realizando ahora cinco veces el proceso de descerado. A partir de 500 g de hojas secas se obtienen 9.5 g de (4) (1.9% del peso de planta) , que se purifica adecuadamente después de dos recristalizaciones.
Obtención de labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oato sódico (4) a partir de las partes aéreas, frutos y hojas, de C. sempervirens L. mediante extracción con hexano en sistema Soxhlet
Se utiliza como material vegetal el conjunto de las hojas, frutos y pequeñas ramas que resultan de la poda de C. sempervirens L. Utilizando un procedimiento análogo al descrito en los dos casos anteriores y, tras descerar cinco veces, se obtienen 10.0 g de (4) (2.0% del peso de planta) . Tras efectuar tres recristalizaciones en MeOH-H2O se obtuvo el producto en un elevado grado de pureza.
Obtención de labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oato sódico (4) a partir de las arcéstidas de C. sempervirens L. mediante extracción con cloruro de metileno en sistema Soxhlet
500 g de material vegetal, seco y finamente triturado, se extrae en sistema Soxhlet con cloruro de metileno (3 L) durante 6 horas. Se elimina el disolvente mediante evaporación a vacío, y el residuo resultante se disuelve en 600 mL de hexano y se mantiene a 0°C durante 12 horas, filtrando el precipitado resultante, constituido por ceras. El filtrado obtenido se somete a esta operación tres veces más. A continuación, sobre la solución hexánica descerada se añade, bajo agitación, NaOH 2N (500 mL) , separándose un sólido incoloro, constituido por la sal (4) . Se filtra a vacío, lavando con pequeñas porciones de hexano frío, primero, y agua fría a continuación, obteniéndose 9.5 g de producto (1.9% del peso de planta) . Mediante tres recristalizaciones en MeOH-H2O se obtuvo la sal en un elevado grado de pureza.
Obtención de labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oato sódico (4) a partir de las hojas de C. sempervirens L. mediante extracción con cloruro de metileno en sistema Soxhlet
Se sigue idéntico procedimiento al descrito para las arcéstidas, pero realizando cinco descerados sucesivos. A partir de 500 g de hojas secas se obtiene 7.5 g de (4) (1.5% del peso de planta) . Tres recristalizaciones en MeOH-H2O proporcionan el producto con elevada pureza.
Obtención de labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oato sódico (4) a partir de las partes aéreas, frutos y hojas, de C. sempervirens L. mediante extracción con cloruro de metileno en sistema Soxhlet
Se sigue un procedimiento similar al empleado con las hojas, efectuando cinco descerados. A partir de 500 g de material vegetal se obtienen 8.0 g de (4) ( (1.6% del peso de planta) . Tres recristalizaciones en MeOH-H2O son suficientes para lograr elevada pureza.
Obtención de labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oato sódico (4) a partir de las arcéstidas de C. sempervirens L. mediante maceración con cloruro de metileno
500 g de planta seca y triturada se somete a maceración en cloruro de metileno (2.5 L) a temperatura ambiente durante 4 horas. Se separa el material vegetal mediante filtración y se elimina el disolvente evaporando a vacío. El residuo resultante se disuelve en hexano (500 mL) y se mantiene a 0°C durante 12 horas. El precipitado, constituido por ceras, se filtra y la solución hexánica se somete al mismo proceso dos veces más. A la solución final se adiciona, bajo agitación, NaOH 2N (450 mL) , separándose un sólido incoloro, constituido por la sal (4) . Se filtra a vacío, lavando con pequeñas porciones de hexano frío, primero, y agua fría luego, obteniéndose 10.5 g de producto (2.1% del peso de planta) . Mediante dos recristalizaciones en MeOH-H2O se obtuvo la sal en un elevado grado de pureza.
Obtención de labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oato sódico (4) a partir de las hojas de C. sempervirens L. mediante maceración con cloruro de metileno
Operando del mismo modo al descrito para las arcéstidas, pero realizando cuatro desceraciones, se obtienen 9, 0 g de (4) (1.8% del peso de planta) a partir de 500 g de planta. Dos recristalizaciones en MeOH-H2O permitieron obtener la sal con elevada pureza.
Obtención de labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oato sódico (4) a partir de las partes aéreas, arcéstidas y hojas, de C. sempervirens L. mediante maceración con cloruro de metileno
Se sigue un procedimiento análogo al descrito en los dos apartados anteriores, efectuando tres desceraciones. 500 g de material vegetal rindieron 9.5 g de (4) (1.9% del peso de planta) . Tras recristalizar dos veces en MeOH-H2O se obtuvo la sal pura.
Ácido labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oico (1)
g (21.58 mmoles) de labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oato sódico (4) se suspenden en H2O (250 mL) y se añade, con agitación, HCl 2N hasta pH 3. La mezcla resultante se extrae con t- butil metil éter (3 x 60 mL) . Las fases orgánicas reunidas se secan sobre sulfato sódico anhidro, se filtran y evaporan a vacío, rindiendo el ácido (1) , como un aceite incoloro (6.2 g, 95%) .
[α]D 37° (CHCl3) .
IR (film) : 3600-2800, 3087, 2938, 2845, 1702, 1642, 1543, 1469, 1400, 1354, 1300, 1250, 1185, 991, 884 cm- 1.
RMN-1H (CDCl3, 300 MHz) : δ 0.65 (311, s, Me-10) , 1.22 (311, s, Me-4) , 1.74 (3H, s, Me-13) , 4.46 (111, sa, H-17) , 4.83 (111, sa, H-17') , 4.86 (111, da, J = 10.7 Hz, H-15) , 5.04 (111, da, J = 17.3 Hz, 11-15') , 5.40 (1H, ta, J = 6.4 Hz) , 6.30 (1H, dd, J = 17.3 y 10.7 Hz) .
RMN-13C (CDCl3, 75 MHz) : δ 41.2 (C-1) , 21.4 (C-2) , 40.1 (C-3) , 45.9 (C-4) , 59.1 (C-5) , 27.0 (C-6) , 40.6 (C-7) , 149.8 (C-8) , 57.9 (C-9) , 41.0 (C-10) , 24.3 (C-11) , 135.4 (C-12) , 133.9 (C-13) , 142.7 (C-14) , 110.2 (C-15) , 12.1 (C-16) , 107.2 (C-17) , 29.9 (C-18) , 181.3 (C-19) , 14.1 (C-20) .
Labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oato de metilo (5)
g (15.41 mmoles) de labda-8 (17) , 12E, 14-trien-19-oato sódico (4) se suspenden en acetona (200 mL) y se añade yodometano (3.28 g, 23.11 mmoles) . La mezcla resultante se calienta a reflujo durante 24 horas. Se elimina el disolvente a vacío y el residuo se fracciona en t-butil metil eter (100 mL) y H2O (100 mL) , y la fase acuosa se extrae con más t- butil metil éter (2 x 50 mL) . Las fases orgánicas reunidas se secan sobre sulfato sódico anhidro, se filtran y evaporan, proporcionando (5) (4.8 g, 98%) , como un sólido cristalino.
Sólido cristalino incoloro. P.F. 105-106°C (MeOH. [α]D) 45° (CHCl3) .
IR (KBr) : 3092, 3038, 2934, 2840, 1720, 1642, 1605, 1543, 1468, 1402, 1348, 1300, 1259, 1195, 985, 885 cm- 1.
RMN-1H (CDCl3, 300 MHz) : δ 0.56 (3H, s, Me-10) , 1.19 (311, s, Me-4) , 1.77 (3H, s, Me-13) , 3.62 (3H, s, MeO-19) , 4.44 (1H, sa, H-17) , 4.80 (1H, sa, H-17') , 4.87 (1H, da, J = 10.5 Hz, H-15) , 5.01 (1H, da, J = 17.8 Hz, H-15') , 5.40 (1H, ta, J = 6.8 Hz) , 6.33 (1H, dd, J = 17.8 y 10.5 Hz) .
RMN-13C (CDCl3, 75 MHz) : δ 39.2 (C-1) , 19.9 (C-2) , 38.3 (C-3) , 44.2 (C-4) , 56.5 (C-5) , 26.1 (C-6) , 38.4 (C-7) , 147.8 (C-8) , 56.4 (C-9) , 40.1 (C-10) , 23.1 (C-11) , 133.5 (C-12) , 133.2 (C-13) , 141.5 (C-14) , 109.7 (C-15) , 11.8 (C-16) , 107.6 (C-17) , 28.7 (C-18) , 177.4 (C-19) , 12.5 (C-20) , 50.8 (C-21) .
