e) Es un sistema de obtención de partículas de forma continua que permite la realización de controles de calidad exhaustivos de cada proceso de producción. Descripción de las figuras
Figura 1: esquema general de los componentes básicos de un dispositivo de formación de partículas mediante la inyección de un único fluido según el procedimiento descrito: (1) Fluido enfocante, (2) fluido enfocado, (3) menisco.
Figura 2: esquema general de los componentes básicos de un dispositivo de formación de partículas mediante la inyección de dos fluidos de forma concéntrica: (1) Fluido enfocante, (2) fluidos enfocados, (3) menisco.
Figura 3a: Fotografía de microscopio de partículas de alginato con BSA-Flu.
Figura 3b: Fotografía del microscopio de fluorescencia de partículas de alginato con BSA sin marcar.
Figura 3c: Fotografía del microscopio de fluorescencia de partículas de alginato con BSA marcada con fluoresceína.
Figura 4a: Fotografía del microscopio de fluorescencia de las partículas de alginato.
Figura 4b: Fotografía de microscopio de partículas de alginato con GFP.
Figura 4c: Fotografía del microscopio de fluorescencia de partículas de alginato con GFP de la Fig. 4b.
Figura 5a: Fotografía del microscopio de fluorescencia de partículas de poliestireno.
Figura 5b: Fotografía del microscopio de fluorescencia de partículas de poliestireno con BSA marcada con fluoresceína.
Figura 6a-c: Fotografía del microscopio de fluorescencia de la micropartículas de alginato con distintas concentraciones de una cepa modificada de E. Coli productora de GFP: a) 2•108 cfu/gr, b) 8•108 cfu/gr, c) 1, 3•109 cfu/gr.
Figura 7a y 7c: Fotografía del microscopio confocal de las micropartículas de alginato con distintas concentraciones de una cepa modificad de la levadura saccharomyces cerevisiae productora de GFP: a) 2.108 levadura/gr, c) 4, 8.109 levadura/gr.
Figura 7b y 7d: Fotografía del microscopio óptico de las micropartículas de alginato con distintas concentraciones de una levadura modificada productora de GFP de la Fig.7a y de la Fig.7c respectivamente.
Descripción detallada de la invención
En general y salvo que se indique otra cosa, todos los términos científicos y técnicos que se emplean en este documento tienen el mismo significado que lo que se entiende habitualmente cuando se utilizan en entornos relacionados.
Definiciones Indicamos aquí que los términos en singular un, una, el, la, y, pueden también indicar plurales a menos que el contexto indique lo contrario. Así por ejemplo cuando se escribe "una particula" se incluye un conjunto de partículas y cuando se refiere a "un compuesto" se encuentra incluida una combinación de compuestos, etc.
En esta invención los términos esferas, partículas y cápsulas se utilizan de forma intercambiable para describir las micro- y nano-partículas descritas en la patente, independientemente de si son sólidas, huecas, porosas, con diferentes capas o multicapas, etc. Estas partículas pueden estar constituidas por cualquier material dependiendo de la aplicación final.
Con la denominación superficie reactiva nos referimos a la superficie de las partículas susceptible de entrar en contacto con el medio externo, incluyendo además de la superficie de la esfera externa la de los poros y canales que se crean, que, con cualquier composición, contienen una serie de grupos funcionales susceptibles de reaccionar con cualquier tipo de molécula que contenga una funcionalidad química adecuada que le permita formar uno o varios enlaces covalentes entre la partícula y dicha molécula.
En esta invención el término fluido se utiliza indistintamente para la denominación de gases o líquidos. En el caso de líquidos se encuentran incluidos líquidos simples, mezclas, disoluciones, suspensiones, emulsiones, sólidos licuados, etc.
Con el termino microchorro nos referimos al filamento capilar que se obtiene del enfocamiento del fluido interno en el interior de la cámara presurizada y que sale al exterior a través de un orificio realizado en ella. En este término se incluyen chorros con un diámetro nano- y micrométrico y de composición diversa.
Descripción de la invención El objeto de la presente invención es un procedimiento para la obtención de partículas con moléculas lábiles, péptidos y proteínas, células, microorganismos, etc., en su interior. Este procedimiento este basado en un sistema de enfocamiento capilar, que combina la utilización de fuerzas hidrodinámicas y una geometría especifica del sistema, de forma que se produce la formación de un microchorro capilar en el seno de un flujo laminar que, por inestabilidad capilar, se rompe en gotas de tamaño controlado y con una distribución muy estrecha y reproducible. Tras la solidificación de la gota se obtienen las partículas que son de tamaño nano y micrométrico, tienen forma esférica y mantienen la distribución de las gotas iniciales generadas.
La tecnología básica de la invención consiste en un sistema de introducción de un primer fluido en el interior de una cámara presurizada mediante un segundo fluido de forma que se genere un chorro estable del primer fluido, que es el que rompe en gotas homogéneas. El primer fluido puede ser un líquido o un gas y el segundo fluido puede ser un gas o un líquido. Cuando ambos fluidos son líquidos, éstos deben ser suficientemente diferentes entre si de forma que permita la generación de un microchorro estable del primer fluido moviéndose desde el punto de alimentación en dirección al punto de salida de la cámara presurizada al exterior.
Es un objeto de la presente invención la utilización de un dispositivo Flow Focusing de forma que el fluido inyectado a través del capilar sea un líquido y el fluido que presuriza la cámara sea un líquido o un gas. Asimismo se encuentra incluida en esta invención la utilización de un dispositivo Flow Focusing para la generación de múltiples microchorros capilares, de forma que el fluido inyectado a través de las múltiples puntas de alimentación sea un liquido y el fluido que presuriza la cámara sea un liquido o un gas.
Constituye otro objeto de la presente invención la utilización de un dispositivo cuyo diseño incluya distintos puntos de alimentación dispuestos de forma concéntrica entre si, de tal manera que entre los fluidos inyectados a través de dichos puntos de alimentación al menos uno sea un líquido, y el fluido que presuriza la cámara sea un liquido o un gas, generando en ultima instancia un único microchorro capilar que dará lugar a las partículas. Se encuentra incluida en la presente invención la utilización de un dispositivo para la generación de múltiples microchorros capilares mediante la utilización de múltiples puntas de alimentación de fluidos, cada una de ellas constituida por dos o más capilares concéntricos, de tal manera que entre los fluidos inyectados a través de ellas al menos uno de cada punta de alimentación sea un liquido, y el fluido que presuriza la cámara sea un líquido o un gas, generando en última instancia un conjunto de microchorro capilar que dará lugar a las partículas.
La naturaleza y composición de los fluidos a los que se refiere la presente invención dependerán de la composición y estructura de las partículas y la aplicación final para la que se obtienen dichas partículas. En esta invención el término fluido se utiliza indistintamente para la denominación de gases o líquidos. En el caso de líquidos se encuentran incluidos líquidos simples, mezclas, disoluciones, suspensiones, emulsiones, sólidos licuados, etc.
Teniendo en cuenta la composición final y estructura de la partícula debe utilizarse una combinación de fluidos que: - posea las propiedades necesarias para la generación de un microchorro capilar estable mediante la utilización de alguno de los dispositivos de enfocamiento capilar incluidos en esta patente, y - que genere un microchorro capilar cuya ruptura de lugar a un sistema estable que permita, tras la solidificación de la gota, obtener las partículas del tamaño predicho y con una distribución homogénea del mismo.
Igualmente se encuentra incluida en esta invención la utilización de un procedimiento de obtención de partículas en el que el microchorro es generado en el seno de un fluido en movimiento de tal forma que en el momento en que se produce la ruptura del microchorro en gotas similares y del tamaño predicho se obtiene una emulsión. Tras la extracción/evaporación del disolvente por cualquiera de los métodos conocidos se obtienen las partículas de tamaño nano- y micrométrico con forma esférica y una distribución de tamaño muy estrecha y reproducible, según la predicción de la teoría Flow Focusing. Según la presente invención, la extracción/evaporación del disolvente tiene lugar de forma que únicamente se produce una disminución de volumen de la partícula debido a la eliminación del disolvente. Esta ocurre rápidamente sin que se produzcan fenómenos de coalescencia de gotas, agregación o similares por lo que se mantiene la distribución relativa de tamaños de las gotas y las partículas finales. En algunos casos se obtienen tamaños de partícula algo superiores a los predichos, ya que se produce una ralentización y ensanchamiento del michochorro del fluido enfocado antes de su ruptura como consecuencia de la deceleración que sufre el chorro externo del fluido enfocante.
Opcionalmente, se encuentra incluida en esta invención la posibilidad de aplicar a alguno o varios de los fluidos perturbaciones externas periódicas y controladas (p.e. mecánicas, acústicas, etc.) de forma que favorezcan aun más la obtención de partículas con una distribución de tamaño homogénea. Las perturbaciones deben ser uniformes y controladas y su frecuencia vendrá determinada por las características del microchorro generado y el tamaño final de partícula requerido.
Se encuentra incluido en la presente invención la utilización de cualquiera de los sistemas habituales que permiten la solidificación de las gotas generadas sin que tenga lugar la perdida de las características iniciales de las gotas, y sin que haya procesos de coalescencia, aglomeración, etc. que modifiquen la morfología y distribución de tamaños de las partículas. Entre estos sistemas de solidificación de las gotas se incluyen la eliminación de disolvente, gelificación iónica, gelificación térmica, etc.
Es objeto de la presente invención que en el caso en el que tiene lugar la generación de una emulsión, el dispositivo de formación de las gotas se encuentre sumergido en el interior de un fluido que constituirá la fase externa de la emulsión de forma que las gotas no sufren ningún proceso de deformación durante la formación de la emulsión. Este fluido es un liquido que puede ser de naturaleza acuosa u orgánica, con propiedades suficientemente diferentes al fluido o fluidos constituyentes de las gotas como para que tenga lugar la formación de una emulsión de tamaño de gota igual al generado por la ruptura del chorro capilar. Además, el fluido en el que se encuentra sumergido el dispositivo puede contener en disolución sustancias que favorezcan la formación y mantenimiento de la uniformidad y homogeneidad de la emulsión durante el proceso de solidificación de la gota para la obtención de la partícula (surfactantes, emulsificantes, tensioactivos, etc) . Adicionalmente, el fluido en el que se genera la emulsión está en movimiento.
Se encuentra incluido en esta invención un procedimiento mediante el cual se obtienen emulsiones de características muy diferentes según la naturaleza de los fluidos que se utilicen (p.e. w/o, o/w, o/o, w/o/w, w/o/o, etc.) .
Preferentemente las partículas finales que se obtengan deben tener diámetros entre 0, 01 y 1000 μm, más preferiblemente entre 0, 01-200 μm y más preferiblemente entre 0, 01-80 μm. Las partículas finales obtenidas deben ser iguales en tamaño con una desviación estándar relativa del 10 al 30%, más preferiblemente del 3 al 10% y más preferiblemente del 3% o menor.
Las partículas pueden fabricarse de distintos materiales, incluyendo pero no limitado a polímeros, sílica, metal, cerámica, etc. Preferentemente se encuentran incluidos en esta invención los materiales poliméricos. Los polímeros pueden ser sintéticos o naturales, solubles en agua o en disolventes orgánicos. Son objeto de la presente invención fluidos que contienen materiales poliméricos entre los que se pueden incluir sin limitar la presente invención: polialcoholes, poliacetales, poliéteres, poliésteres (como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico, poli (caprolactona) y similares y sus copolímeros) , poliortoésteres, polianhídridos (como el ácido polisebácico, ácido polifumárico, poli (carboxifenoxi propano) , poli (carboxifenoxi hexano) y similares y sus copolímeros) , polialdehidos, policetonas, policarbonatos, poli (iminocarbonatos) , poliamidas, poliimidas, poliacrilatos y sus derivados y copolímeros, poli (cianoacrilatos) , poliuretanos, poliestirenos, policloruros, polifluoruros, derivados polivinílicos, poliolefinas, polifosfatos, poli (organofosfazenos) , poli (anhídridos-co-imidas) , polisacáridos y derivados de carbohidratos, poli (aminoácidos) , polímeros derivados de macromoléculas, y todos los derivados de los anteriores y sus copolímeros.
Constituye un objeto de esta invención que los materiales poliméricos que se utilizan en la formación de partículas presenten grupos funcionales reactivos susceptibles de reaccionar con cualquier tipo de molécula que contenga una funcionalidad química adecuada que le permita formar uno o varios enlaces covalentes entre la partícula y dicha molécula. Preferentemente constituye un objeto de esta invención que dichos grupos reactivos se encuentren en la superficie de la partícula dirigidos hacia el exterior de la misma. Este contenido en esta invención que entre las moléculas que se unen a la superficie están incluidas, sin que se consideren limitantes, moléculas de interés biológico, preferentemente péptidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, PNAs, LNAs, proteínas, glicoproteínas, lípidos, fosfolípidos, carbohidratos, oligosacáridos y mezclas de los mismos.
Asimismo esta incluido en esta invención un método de obtención de partículas en el que el fluido que confomará la matriz de la partícula puede llevar unido covalentemente moléculas de interés biológico que quedaran expuestas hacia la superficie de las partículas.
Además de los componentes principales que constituirán la matriz o matrices (en el caso de las cápsulas multicapa) de la partícula, los fluidos van a estar compuestos de otras compuestos y sustancias lábiles que necesiten ser protegidos durante todos o alguno de los siguientes pasos: formulación, distribución, almacenamiento y/o liberación de los mismos. Entre estas sustancias se incluyen sin pretensión de limitarlas: fármacos y compuestos con actividad terapéutica y/o profiláctica, moléculas y compuestos inestables, péptidos y proteínas, microorganismos, células, biomoléculas, etc., de forma individual o como mezcla de varios.
Además constituye un objeto de la presente invención que las partículas que contienen material lábil en su interior posean en su superficie grupos funcionales reactivos capaces de formar enlaces covalentes entre la partícula y otras moléculas. Adicionalmente, la presente invención tiene como un procedimiento preferente aquel mediante el cual se lleva a cabo la generación de la partícula con la superficie reactiva y la encapsulación del material frágil en un único paso, utilizando alguno de los dispositivos descritos e incluidos en la presente invención.
Modo de realización de la invención
Ejemplo 1
Encapsulación de BSA marcada con fluoresceína en micropartículas de alginato (Fig 3)
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento de encapsulación de BSA marcada con fluoresceína. (BSA-Flu) en micropartículas de alginato de 11 micras utilizando la tecnología Flow Focusing en configuración liquido-gas. La formación de las partículas se lleva a cabo mediante la utilización de un dispositivo de enfocamiento capilar (D = 350 μm) con un punto de alimentación simple (D0 = 200 μm; H = 125 μm) . El dispositivo de enfocamiento capilar se encuentra integrado en un spray-dr y er LabPlant SD-Basic. A través de la punta de alimentación se inyecta una disolución acuosa de BSA-Flu (0.17% w/v) en alginato sódico (Sigma) al 1, 7% w/v con un caudal de 10 mL/h. La cámara este presurizada a 300 mbar mediante la entrada de una corriente continua de gas. Las gotas se secan en el spray dr y er a una temperatura de 87ºC, recogiéndose secas al final del proceso.
El análisis de las micropartículas se llevó a cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa de tratamiento de imágenes (dmedio) 10, 75 μm, DS 0, 71) y un microscopio de fluorescencia (Leica DMR) , (Fig. 3a, 3c) .
Ejemplo 2
Encapsulación de GFP en micropartículas de alginato (Fig 4)
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento de encapsulación de proteína verde fluorescente (GFP) en micropartículas de alginato de 11 micras utilizando la tecnología Flow Focusing en configuración líquido-gas. Se utiliza el mismo dispositivo de enfocamiento capilar que en el ejemplo 1. Se prepara una disolución acuosa de GFP (0, 04% w/v) ) en alginato sódico al 1, 7% w/v y se lleva a cabo el mismo procedimiento de obtención de las micropartículas que el descrito en el ejemplo 1.
El análisis de las micropartículas se llevó a cabo utilizando el microscopio óptico y un programa de tratamiento de imágenes (dmedio 11.16 μm, DS 1, 36) y el microscopio de fluorescencia (Fig. 4b, Fig. 4c) .
Ejemplo 3
Encapsulación de BSA marcada con fluoresceína en micropartículas de poliestireno
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento de encapsulación de BSA marcada con fluoresceína. en micropartículas de poliestireno de 13 micras utilizando la tecnología Flow Focusing en configuración líquido-líquido. La formación de la emulsión se lleva a cabo mediante la utilización de un dispositivo de enfocamiento capilar (D = 100 μm) con un punto de alimentación simple (D0 = H = 150 μm) . El dispositivo de enfocamiento capilar se encuentra sumergido en una disolución acuosa de PVA al 1% w/v en agitación. Sobre una 2 mL de una disolución de poliestireno (Aldrich, Mw =4.000-200.000) al 4% w/v en diclorometano (Aldrich) se añade gota a gota y en constante agitación 0.140 mL de una disolución al 0.5% w/v de BSA marcada con Fluoresceína en EtOH (Panreac Quimica) . Esta disolución se inyecta a través de la punta de alimentación con un caudal de 1 mL/h. La cámara esta presurizada mediante la introducción de un caudal continuo de agua de 3 mL/min. La emulsión o/w generada se mantiene en agitación durante 16 h a temperatura ambiente para que tenga lugar la extracción/evaporación del disolvente. Las partículas sólidas se centrifugan (Orto Alresa mod. Digicen 20, 4.000 rpm, 10 min) , se lavan con agua tres veces, se liofilizan y se guardan a 4ºC.
El análisis de las micropartículas se llevó a cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa de tratamiento de imágenes (dmedio 13.27 μm, DS 4.57) y un microscopio electrónico de barrido (Eclipsar XL30) (Fig. 5b) .
Ejemplo 4
Encapsulación de bacterias E. Coli en micropartículas de alginato
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento de encapsulación de una cepa modificada E. Coli que expresa GFP en micropartículas de alginato de 11 micras utilizando la tecnología Flow Focusing en configuración líquido-gas. Se utiliza el mismo dispositivo de enfocamiento capilar que en el ejemplo 1. A 15 mL de una disolución acuosa de alginato sódico al 2% w/v se le añaden distintas cantidades de una suspensión de E. Coli (4E8 c.f.u/mL) en NaCl (Sigma, 1% w/v) para obtener suspensiones con distintas concentraciones de bacteria (Tabla 1) . La suspensión se homogeneiza durante 5 minutos) y se lleva a cabo el mismo procedimiento de obtención de las micropartículas que el descrito en el ejemplo 1 pero secando las gotas a 99ºC.
El análisis de las micropartículas se llevo a cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa de tratamiento de imágenes (Tabla 1) y un microscopio electrónico de barrido (Eclipsar XL30) (Figuras 6a-c) .
TABLA 1 Distribución de tamaños de las micropartículas con E. Coli en función de la concentración inicial de bacteria | Concentración de | dmedio (μm) | DS (μm) |
| E. Coli | | |
| 2•108 cfu/gr | 10, 3 | 1, 16 |
| 8•108 cfu/gr | 11, 15 | 1, 48 |
| 1, 3•109 cfu/gr | 11, 51 | 1, 60 |
Ejemplo 5
Encapsulación de levaduras en micropartículas de alginato (fig 7)
El ejemplo siguiente presenta el procedimiento de encapsulación de una levadura modificada que expresa GFP en micropartículas de alginato de 12 micras utilizando la tecnología Flow Focusing en configuración líquido-gas. Se utiliza el mismo dispositivo de enfocamiento capilar que en el ejemplo 1. A 10 mL de una disolución acuosa de alginato sódico al 2% w/v se le añaden 2 ml de una suspensión acuosa de levadura con distintas concentraciones de la misma (Tabla 2) . La suspensión se homogeneiza durante 5 minutos y se lleva a cabo el mismo procedimiento de obtención de las micropartículas que el descrito en el ejemplo 1 pero secando las gotas a 87ºC.
El análisis de las micropartículas se llevó a cabo utilizando un microscopio óptico (Leica DM LS) y un programa de tratamiento de imágenes (Tabla 2) y un microscopio confocal (Leica TCS SP2) (Figuras 7a-d) .
TABLA 2 Distribución de tamaños de las micropartículas con levadura en función de la concentración inicial de la misma | Concentración de | dmedio (μm) | DS (μm) |
| levadura | | |
| 2•108lev/gr | 11, 32 | 1, 34 |
| 4, 8•109 lev/gr | 12, 36 | 1, 66 |
