Use of arrays of specific sequences of the human mitochondrial genome on solid support and procedure for the detection of mutations associated with the optic neuropathy of leber. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding*)

Abstract

Use of arrays of specific sequences of human mitochondrial genome on solid support and procedure for the detection of mutations associated with leber's optic neuropathy, using dna chips. The procedure is based on the amplification of the fragments that contain the mutations and polymorphisms of interest and the determination of the base involved in them by means of a minisequencing reaction using primers that carry a tail (tag) at its 5 end. Detection by hybridizing the products of the mini-sequencing reaction with a microarray consisting of sequences complementary to the tails (ctag).

Description

ES-2308868_A1

Uso de arrays de secuencias específicas de genoma mitocondrial humano sobre soporte sólido y procedimiento para la detección de mutaciones asociadas a la Neuropatía Óptica de Leber.

Uso de arrays de secuencias específicas de genoma mitocondrial humano sobre soporte sólido y procedimiento para la detección de mutaciones asociadas a la Neuropatía Óptica de Leber, mediante chips de ADN. Son de aplicación en genética, y en particular, diagnóstico molecular y genética de poblaciones.

Estado de la técnica

El ADN mitocondrial humano es una cadena circular de 16, 6 kb que contiene 37 genes, de los cuales solo 13 codifican polipéptidos componentes de la cadena respiratoria (sistema de fosforilación oxidativa, OXPHOS) , siendo los restantes genes responsables de la formación de los ARN de transferencia y ribosómicos. Las mitocondrias se caracterizan por su herencia materna, aparecer en un numero variable de entre cientos a miles en cada célula y el que la replicación del ADN mitocondrial y su herencia en los linajes somáticos es aleatoria. Dentro de cada mitocondria coexisten cientos o miles de cadenas circulares de ADN mitocondrial, de manera que la aparición de mutaciones puede llevar a la coexistencia de dos o más genotipos dentro de una célula, órgano o individuo, fenómeno denominado heteroplasmia. En general para una mutación patógena, la proporción de moléculas mutadas en la población heteroplásmica (carga mutacional) repercute en la severidad del defecto y en la clínica, aunque no de una manera lineal. Dado el carácter aleatorio de la replicación y herencia del ADN mitocondrial, la carga mutacional puede cambiar durante la vida del paciente y pueden darse diferentes cargas mutacionales en diferentes células y tejidos. Al tener estos diferentes requerimientos energéticos la heteroplasmia y la segregación al azar explica la variable presentación clínica y gravedad de las mutaciones en el genoma mitocondrial.

Las enfermedades asociadas a alteraciones del genoma mitocondrial tienen como base común un defecto en la biosíntesis de ATP, ya sea por mutaciones o deleciones que afectan a los genes codificantes o por mutaciones o deleciones que afectan ARNs ribosómicos o transferentes específicos que son requeridos para la síntesis de los polipéptidos codificados por los primeros (DIMAURO S., SCHON E.A. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Am J Med Genet. 2001, Vol 106, páginas 18-26; SMEITINK J. et al. The genetics and pathology of oxidative phosphor y lation. Nat Rev Genet. 2001, Vol 2, páginas 342-352) . Estas enfermedades presentan una clínica muy variada y pueden afectar a todos los órganos y tejidos (WONG L. J. C., BOLES R.G. Mitochondrial DNA analysis in clinical laborator y diagnostics. Clin Chim Acta. 2005, Vol 354, páginas 1-20) . En ciertos casos aparecen con unos aspectos clínicos, morfológicos y bioquímicos muy concretos que dan lugar a síndromes bien caracterizados. Sin embargo, en la mayoría de los casos los síntomas son poco informativos, siendo orientativo de una enfermedad de origen mitocondrial la presencia de anomalías neurológicas, a veces con aumento de ácido láctico y otros síntomas, así como una herencia materna. Por ello son enfermedades de estudio complejo, interviniendo estudios morfológicos, histoquímicos y bioquímicos, necesarios para asegurar su naturaleza. Estos estudios son a veces incluyentes y muchas veces traumáticos para el paciente, como el caso de biopsias, con lo que el estudio genético resulta la confirmación de la patología de una forma más segura y económica.

En Europa los defectos del ADN mitocondrial son causa de enfermedad en 6, 57 de cada 100.000 individuos adultos, estimándose que 1 de cada 8.000 individuos tienen o presentan un riesgo de padecer una enfermedad causada por daños en este ADN. Estos valores hacen que la prevalencia de estas enfermedades sea equivalente a la de otras enfermedades neurológicas, como la Corea de Huntington, o incluso superior como en el caso de la distrofia de Dúchenme, por citar dos entidades muy estudiadas molecularmente. Existen pocos datos sobre la prevalencia de la Neuropatía Óptica de Leber. Es la causa de la ceguera en 0, 42-2% de los casos registrados en Australia, y en el noroeste de Inglaterra 11, 8 de cada 100000 personas porta una mutación primaria o causal, presentando la enfermedad 3, 22 de cada 100000. Se calcula que uno en 140000 varones adultos tienen defectos visuales como consecuencia de esta patología. Por otro lado la frecuencia relativa de las mutaciones que causan la Neuropatía Óptica de Leber varía en el mundo. La mutación G11778A es la más prevalente, siendo responsable del 70% de los casos. Esta mutación, junto con T14484C y A3460G, es considerada del grupo de mutaciones inequívocamente causales o primarias, y en conjunto se encuentra en el 95% de los casos diagnosticados.

Desde que en 1988 se publicaron las primeras mutaciones han sido descritas una gran cantidad de mutaciones y polimorfismos en el genoma mitocondrial: unas 180 mutaciones, y un número cercano de deleciones, algunas de ellas extremadamente raras, asociadas a una gran variedad de patologías. Una base de datos pública (WALLACE D.C., LOTT M.T. MITOMAP: a human mitochondrial genome database: http://www.mitomap.org/) recoge información de todas las mutaciones descubiertas hasta el momento y se va actualizando con aportación de datos clínicos.

La existencia de polimorfismos y de mutaciones no patogénicas en el genoma mitocondrial, aunque de menor interés en el campo diagnóstico, sí tiene aplicaciones prácticas en el campo de la genética de poblaciones, para el estudio de filogenias de poblaciones humanas y del origen y prevalencia de alteraciones mitocondriales. Además, dichos polimorfismos y mutaciones no patógenas pueden tener un efecto modificador de la expresión de otras mutaciones presentes en el genoma mitocondrial, lo que puede tener un potencial interés en el diagnóstico, pronóstico y terapia de afectados por dichas patologías (TORRONI A. et al. Haplotype and phylogenetic analyses suggest that one European-specific mtDNA background plays a role in the expression of Leber hereditar y optic neuropathy by increasing the penetrance of the primar y mutations 11778 and 14484. Am J Hum Genet. 1997, Vol 60, N° 5, páginas 1107-11021) .

Las mutaciones puntuales en el ADN mitocondrial se diagnostican actualmente mediante secuenciación del genoma mitocondrial. Su excesivo tamaño (16, 6 kb) hace difícil el acceder a la secuenciación completa del mismo, de forma que normalmente se secuencian únicamente aquellos fragmentos para los cuales hay inicialmente una sospecha, lo que muchas veces es una estrategia inadecuada dada la variabilidad en expresión de las patologías mitocondriales ya comentada. Todavía se utilizan otras técnicas, como los RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) , cuando la alteración afecta a un punto de corte de una enzima de restricción, y la PCR alelo específica. El problema de ambos métodos es la dificultad de automatización del análisis, imprescindible cuando el número de mutaciones a analizar es elevado.

En la Tabla 1 se indican las mutaciones y polimorfismos más importantes del genoma mitocondrial humano teniendo en cuenta la prevalencia de las distintas mutaciones, la importancia diagnóstica de las patologías a las que se asocian y por el interés de ciertos polimorfismos y mutaciones no patógenas o de trascendencia dudosa. Todas estas mutaciones y polimorfismo, al igual que los responsables de la Neuropatía Óptica de Leber, pueden incluirse simultáneamente en un chip de mutaciones como el propuesto siguiendo el mismo procedimiento al descrito. Estas mutaciones se asocian generalmente a patologías de origen mitocondrial y de gran transcendencia clínica: Síndrome de Kearns-Sayre, Enfermedad de Leigh, Neuropatía óptica de Leber (LHON) , MELAS (Encefalopatía mitocondrial con acidosis láctica) , MERRF (Epilepsia mioclónica) , NARP (Neuropatía, ataxia y retinitis pigmentosa) , PEO (Oftalmoplegia externa progresiva) , entre otras. Sin embargo la experiencia clínica demuestra que la mayoría de los individuos con patologías mitocondriales no se ajustan con exactitud a uno de los síndromes específicos definidos y que la correlación genotipo - fenotipo en medicina mitocondrial es pobre (WONG L-J. C., BOLES R. G. op. cited) .

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

Para lograr la generalización del diagnóstico molecular de patologías mitocondriales es necesario tipar un alto número de mutaciones y polimorfismos, siendo imprescindible la utilización de tecnologías que nos permitan analizar muchas variantes del ADN mitocondrial simultáneamente y de la manera más rápida, económica y automatizada posible. En la actualidad, existe un gran número de tecnologías disponibles para el genotipado de mutaciones puntuales y polimorfismos de base única ó SNPs (SYVANEN A.C. Accessing genetic variation: genotyping single nucleotide polymorphisms. Nat Rev Genet. 2001, Vol 2, N° 12, páginas 930-942) .

La elección del método de genotipado adecuado para cada aplicación depende del número de SNPs y muestras que sea necesario analizar, la flexibilidad de la tecnología, el fácil manejo y el coste. Una tecnología prometedora es la de los chips o microarrays de ADN (SOUTHERN E.M. DNA chips: analysing sequence by hybridization to oligonucleotides on a large scale. Trends Genet. 1996, Vol 12, N° 3, páginas 110-115; HACIA J.G. Resequencing and mutational analysis using oligonucleotide microarrays. Nat Genet. 1999, Vol 21, N° 1, páginas 42-47) . Los chips de ADN consisten en la disposición ordenada de fragmentos de ADN sobre un soporte sólido mediante su inmovilización o síntesis in situ, para su posterior hibridación con el ADN marcado fluorescentemente de la muestra que queremos analizar.

En los últimos años se ha producido un avance importante en el desarrollo de esta tecnología. La mayoría de los métodos de genotipado descritos hasta el momento se basan en tres tipos de reacción: la hibridación con sondas alelo-específicas (ASO, Allelic Specific Oligonucleotide) (HACIA J.G. op. cited) ; minisecuenciación (también llamada Single Base Extensión, SBE) (PASTINEN T. et. al. Minisequencing: a specific tool for DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide arrays. Genome Res. 1997, Vol 7, N° 6, páginas 606-614) ; y ligamiento de oligonucleóotidos alelo-específicos (OLA, Oligonucleotide Ligation Assay) (GERRY N. P. et. al. Universal DNA microarray method for multiplex detection of low abundance point mutations. J Mol Biol. 1999, Vol 292, N° 2, páginas 251-262) . Todos estos métodos pueden ser utilizados con microarrays.

El genotipado simultáneo de múltiples SNPs mediante hibridación con sondas ASO resulta difícil y no siempre fiable (WANG D.G., et. al. Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome. Science. 1998 Vol 280, páginas 1077-1082; CHO R.J., et. al. Genome-wide mapping with biallelic markers in Arabidopsis thaliana. Nat Genet. 1999, Vol. 23, N° 2, páginas 203-207) . Sin embargo, los métodos basados en reacciones enzimáticas, como son los otros dos mencionados anteriormente, tienen mayor aceptación como alternativas más específicas que la hibridación con sondas ASO (RAITIO M., et. al. Y-chromosomal SNPs in Finno-Ugric-speaking populations analyzed by minisequencing on microarrays. Genome Res. 2001 Vol 11, N° 3, páginas 471-482; PASTINEN T., et. al. A system for specific, high-throughput genotyping by allele-specific primer exrtension on micorarrays. Genome Res. 2000, Vol 10, páginas 1031-1042; FORTINA P., et. al. Simple two-color array-based approach for mutation detection. Eur J Hum Genet. 2000, Vol 8, N° 11, páginas 884-894; SOUTHERN E., et. al. Molecular interactions on microarrays. Nat Genet. 1999, Vol 21, N° 1, páginas 5-9) .

En las reacciones de minisecuenciación una ADN polimerasa es usada para extender el primer o cebador, diseñado de tal forma que el extremo 3' es complementario a la base anterior al SNP que queremos analizar. Los cebadores son extendidos con distintos análogos de nucleótidos marcados que son complementarios a los nucleótidos de la base polimórfica. Este método fue descrito en un principio para ser llevado a cabo en placas de microtitulación, donde los productos de PCR eran inmovilizados (SYVANEN A.C., et. al. A primer-guided nucleotide incorporation assay in the genotyping of apolipoprotein E. Genomics 1990, Vol 8, N° 4, páginas 684-692; SYVANEN A.C., et. al. Identification of individuals by analysis of biallelic DNA markers, using PCR and solid-phase minisequencing. Am J Hum Genet. 1993, Vol 52, N° 1, páginas 46-59) . Más tarde, la minisecuenciación fue adaptada a los microarrays uniendo el cebador covalentemente a la superficie del microarray. Los dideoxinucleótidos (ddNTPs) usados en la extensión estaban marcados con radioactividad o fluorocromos (PASTINEN T., op. cited; RAITIO M., op. cited) .

Una alternativa a estas estrategias de minisecuenciación es el uso de oligonucleótidos genéricos denominados cTags que son inmovilizadas sobre la superficie del microarray en lugar de los primers o cebadores. En este caso, los cebadores utilizados en la reacción de minisecuenciación finalizan en su extremo 3' en la base anterior a la posición polimórfica, y en el extremo 5' tienen una cola o tag de unos 25-27 nucleótidos, que son complementarias a las cTags que constituyen el microarray. Estas colas son secuencias no homólogas con el genoma humano con temperaturas de melting similares, lo que facilita la hibridación. La reacción de minisecuenciación tiene lugar en un termociclador mediante la incorporación de dideoxinucleótidos marcados con distintos fluorocromos, de forma que podamos detectar que base se ha incorporado. A continuación, el producto de la minisecuenciación se hibrida con el microarray para genotipar todos los SNPs, identificando la base incorporada en cada una de las posiciones del microarray (Figura 1) .

El uso de tag-primers fue descrito por primera vez para el análisis de la expresión génica en levaduras mediante PCR (SHOEMAKER D.D., et. al. Quantitative phenotypic analysis of yeast deletion mutants using a highly parallel molecular bar-coding strategy. Nat Genet. 1996, Vol 14, N° 4, páginas 450-456) y ha sido aplicada más tarde para el genotipado de SNPs mediante minisecuenciación con micropartículas (CAI H., et. al. Flow cytometr y -based minisequencing: a new platform for high-throughput single-nucleotide polymorphism scoring. Genomics 2000, Vol. 66, N° 2, páginas 135-143) , en los chips de alta densidad de Affymetrix (GenFlex^TM array) (FAN J.B., et. al. Parallel genotyping of human SNPs using generic high-density oligonucleotide tag arrays. Genome Res. 2000, Vol 10, N° 6, páginas 853-860) y en los chips de media densidad (HIRSCHHORN J.N., et. al. SBE-TAGS: an array-based method for efficient single-nucleotide polymorphism genotyping. Proc Natl Acad Sci USA. 2000, Vol 97, N° 22, páginas 12164-12169) .

Esta última estrategia denominada SBE-TAGs (Single Base Extensión con Tags) nos permite tipar al mismo tiempo un gran número de SNPs porque además de ser un método enzimático, y por lo tanto mucho más específico que las sondas ASO, el uso de Tags con temperaturas de melting similares, facilita en gran medida la hibridación de los productos de la reacción de minisecuenciación con el microarray. El hecho de que el microarray esté constituido por las cTags, en lugar de por cebadores específicos de cada locus, nos permite que el mismo microarray pueda ser utilizado para distintos grupos de marcadores, teniendo que cambiar únicamente los cebadores que se utilizan en la reacción de minisecuenciación que tiene lugar en el termociclador.

Para la minisecuenciación con microarrays pueden estar los cuatro ddNTPs marcados con el mismo fluorocromo y usarse en reacciones separadas, o bien cada uno de ellos marcado con un fluorocromo distinto, y llevarse a cabo una única reacción. Por un lado, resulta más ventajoso el uso de cuatro fluorocromos distintos porque únicamente es necesaria una reacción de minisecuenciación. Sin embargo puede ser necesario separar las reacciones cuando puede existir interferencia entre los cebadores específicos, como es el caso de SNPs muy próximos (1 a 20 pares de bases de separación) . Por otro lado, si usamos un solo fluorocromo estamos facilitando la posibilidad de usar esta tecnología en un mayor número de laboratorios, ya que se puede usar un escáner que lea únicamente para dos longitudes de onda, como pueden ser los que se dedican al análisis de expresión génica. Antes de la reacción de minisecuenciación ha de llevarse a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (MULLIS K.B., FALOONA F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987, Vol 155, páginas 335-350) para amplificar los fragmentos de ADN que contienen los SNPs de interés.

En el chip de ADN de la invención se puede aplicar el concepto de "array de arrays" (PASTINEN T. op. cited 2000) , que nos permitiria hibridar simultáneamente los productos de reacciones de minisecuenciación de varias muestras sobre el mismo soporte al utilizar un molde de silicona que forma pocillos de hibridación independientes (Figura 2) . Esto permite a su vez una gran capacidad a la hora de incluir mutaciones y polimorfismos nuevos para esta y otras patologías mitocondriales.

El objeto de la propuesta de invención consiste en un chip y un procedimiento que nos permita genotipar simultáneamente las mutaciones responsables de la Neuropatía Óptica de Leber, así como otras mutaciones y polimorfismos asociados. La novedad de la invención estriba en el hecho de proporcionar al usuario la secuencia de los primers o cebadores que permiten identificar el alelo de cada mutación y su posterior detección mediante microarrays. El procedimiento utilizado se caracteriza por la facilidad con que son detectados todos los marcadores seleccionados simultáneamente, lo que supone un gran ahorro de tiempo, reactivos y de muestra de partida para realizar el análisis. Este último punto es de gran importancia, tanto en diagnóstico molecular, donde la muestra de partida suele estar limitada, como en estudios de genética de poblaciones, en los que se trabaja muchas veces con muestras muy valiosas y difíciles de conseguir.

Modo de realización

La presente invención describe un chip y un procedimiento para el genotipado de las mutaciones responsables de la Neuropatía Óptica de Leber, mediante una reacción de minisecuenciación combinada con el uso de microarrays. El procedimiento se caracteriza por:

- la amplificación de los fragmentos de ADN mitocondrial que contienen las mutaciones de interés mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) .

- La determinación de la base implicada en la mutación mediante una reacción de minisecuenciación empleando primers o cebadores que en su extremo 5' portan una cola (Tag)

- y por la detección de los productos de la minisecuenciación mediante la hibridación de los mismos con un microarray previamente fabricado con las secuencias complementarias a las colas (cTags) situadas en el extremo 5' de los cebadores de la minisecuenciación.

El procedimiento consta de las etapas que se detallan a continuación y que se muestran en la Figura 3.

1. Fabricación de los microarrays.

2. Amplificación del ADN mitocondrial en 3 fragmentos mediante PCR larga.

3. Comprobación de la amplificación.

4. Mezcla de los productos de las PCRs larga.

5. Purificación de los productos de PCR.

6. Reacción de minisecuenciación o Single Base Extensión (SBE) .

7. Hibridación de los productos de la reacción de minisecuenciación con el microarray.

8. Escaneado del microarray.

9. Análisis de los resultados mediante un software de análisis de imagen.

10. Interpretación de los resultados.

A continuación se describe detalladamente cada una de las etapas anteriores:

1. Fabricación de los microarrays

Los microarrays son fabricados con un robot o "arrayer" que deposita de forma ordenada y precisa sobre un soporte sólido los oligonucleótidos (cTags) complementarios a las tags que van unidas a los extremos 5' de los primers o cebadores de minisecuenciación. Estos oligonucleótidos se unen al soporte sobre el que se fabrican los microarrays por el extremo 3'. Para esta unión, dependiendo del tipo de soporte sobre el que se depositen, será necesario que en dicho extremo porten una modificación.

El sistema, al ser de una gran flexibilidad, permite la fabricación de gran variedad de chips de mutaciones a partir de una librería de secuencias específicas. Para las mutaciones y polimorfismos incluidos en la Tabla 1 hemos comprobado el funcionamiento en la práctica de una serie de secuencias cTag. En la Tabla 2 se muestra que cTag es usada para detectar cada mutación y polimorfismo y su correspondencia con las secuencias recogidas en la Lista de secuencias.

TABLA 2

Para el chip de diagnóstico de la Neuripatía Óptica de Leber, que comprende las mutaciones G11778A, T14484C y A3460G (primarias) y las mutaciones y polimorfismos asociados 3316A, 3496T, 3497T, 4136G, 4160C, 4216C, 4917G, 5244A, 7444A, 9101C, 9438A, 9738T, 9804A, 10663C, 13528G, 13708A, 13730A, 14459A, 14482A, 14482G, 14495G, 14498C, 14568T, 14596A, 15257A, 3394C, 3635A, 4640A y 11696G, se han empleado las secuencias cTag siguientes: Sec. ID. N°: 5, Sec. ID. N°: 7, Sec. ID. N°: 8, Sec. ID. N°: 9, Sec. ID. N°: 10, Sec. ID. N°: 11, Sec. ID. N°: 12, Sec. ID. N°: 13, Sec. ID. N°: 14, Sec. ID. N°: 17, Sec. ID. N°: 26, Sec. ID. N°: 27, Sec. ID. N°: 28, Sec. ID. N°: 29, Sec. ID. N°: 31, Sec. ID. N°: 32, Sec. ID. N°: 35, Sec. ID. N°: 36, Sec. ID. N°: 40, Sec. ID. N°: 41, Sec. ID. N°: 42, Sec. ID. N°: 43, Sec. ID. N°: 44, Sec. ID. N°: 45, Sec. ID. N°: 46, Sec. ID. N°: 47, Sec. ID. N°: 48, Sec. ID. N°: 49, Sec. ID. N°: 50, Sec. ID. N°: 12, Sec. ID. N°: 58, Sec. ID. N°: 59, Sec. ID. N°: 60 y Sec. ID. N°: 58.

Los microarrays son fabricados según el modelo de "array de arrays". Esto consiste en que sobre un mismo portaobjetos se depositan las cTags necesarias en distintas posiciones del portaobjetos, de forma que el mismo array (que pasaremos a llamarle subarray) está repetido varias veces. Cada muestra, para tipar las 32 mutaciones y polimorfismos, necesita emplear tres subarrays. Usando un molde de silicona y una cámara de hibridación adecuados, que nos permitan aislar cada uno de los subarrays, podremos hibridar, simultáneamente sobre el mismo portaobjetos, varias muestras, con el consiguiente ahorro de tiempo y dinero.

En la Figura 2 se muestra la disposición de cada subarray, así como un ejemplo de una posible distribución de las mutaciones (aunque sobre el microarray está unida la cTag correspondiente a cada mutación) .

2. Amplificación de los 3 fragmentos de ADN mitocondrial mediante PCR larga

El ADN mitocondrial se somete a la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con objeto de obtener la cantidad suficiente de cada fragmento de ADN de manera que sea posible la detección de todas mutaciones que presenta cada individuo. Una ventaja de esta estrategia es que permitiría detectar cualesquiera mutaciones en genoma mitocondrial, no solamente las de la Neuropatía Óptica de Leber, sin necesidad de nuevas PCRs. Los cebadores y la reacción de amplificación utilizados se describen en las Tablas 3 y 4.

TABLA 3
TABLA 4

Las PCR largas se llevaron a cabo en 25 μL de volumen final. Para su realización se preparan dos premixes que se mezclan en el momento de introducirlas en el termociclador:

3. Comprobación de la amplificación

La eficacia de la amplificación puede ser comprobada con cualquier técnica apropiadas aunque por el tamaño de los fragmentos amplificados se recomienda el uso de geles de agarosa al 1%. Para comprobar los tamaños de los fragmentos amplificados se utiliza un marcador de peso molecular.

En esta etapa ya se pueden detectar en ciertos casos mutaciones por duplicación o deleción del genoma mitocondrial, como la deleción común de 5 Kb en el Síndrome de Kearns-Sayre, al desaparecer fragmentos o aparecer fragmentos de distinto tamaño (mayores o menores respectivamente) al de los controles.

4. Mezcla de los productos de las PCRs largas y alternativamente concentración del ADN mediante evaporación

Se procede a la concentración de la mezcla de los productos de PCR evaporando la muestra mediante incubación a 37°C hasta obtener un volumen final suficiente para llevar a cabo la reacción de minisecuenciación.

Este paso solamente es necesario si la cantidad de material de partida es muy escaso y se requiere concentración de la muestra. Como sólo se emplean 5 fragmentos de ADN amplificado no es necesario mezclar y concentrar los productos de las PCRs para evitar que cada fragmento de ADN amplificado quede muy diluido como en otros arrays basados en multiplex.

5. Purificación de los productos de PCR

Los productos de PCR deben ser purificados para eliminar los posibles restos de cebadores y dNTPs de la PCR para evitar que interfieran en la reacción de minisecuenciación. Esto puede realizarse con cualquier método apropiado para esta aplicación.

6. Reacción de minisecuenciación o Single Base Extensión (SBE)

La minisecuenciación se lleva a cabo en tres reacciones para las 32 mutaciones y polimorfismos, siempre a partir de los tres productos de PCR previamente mezclados. Los cebadores de estas reacciones se han diseñado de manera que el extremo 3' del cebador sea complementario a la base anterior a la mutación o polimorfismo. Al existir mutaciones muy próximas es necesario separar ambas reacciones para impedir competencia entre los cebadores. En otros casos este problema se soluciona al disponer el cebador de la primera mutación en sentido sense y el de la segunda en antisense. La región de ADN mitocondrial comprendida entre los nucleótidos 14453 y 14498 es especialmente compleja pues acumula 7 mutaciones, lo que ha obligado a introducir una tercera reacción. De esta manera, en las tres reacciones de minisecuenciación, el cebador se extenderá con el dideoxinucleótido (ddNTP) complementario a la base mutada o polimórfica. Detectando el ddNTP que ha sido añadido podremos determinar el alelo de dicha mutación. Además, el cebador porta en el extremo 5' una cola (tag) o secuencia no homologa a secuencias humanas, cuya función es la de permitir la hibridación con el microarray (Figura 2) . Cada mutación o polimorfismo tiene su propia tag para una mezcla de reacción dada. Las tres mezclas de reacción hibridan en subarrays o cámaras específicas dentro del chip. Entre subarrays se pueden compartir cTags, con el correspondiente ahorro de material.

Para el diseño de los cebadores se utilizó un software propio (OligoTags) de forma que la temperatura de melting de todos los cebadores fuese similar para facilitar la minisecuenciación de todos los marcadores en la misma reacción. La posible formación de estructuras secundarias en los cebadores ha sido comprobada con el software OligoTags.

Para todas las mutaciones listadas en la Tabla 1 se han comprobado experimentalmente el funcionamiento de distintos cebadores de minisecuenciación, tanto en la amplificación como en la hibridación a sus correspondientes cTags listadas en la Tabla 2. En la Tabla 5 se muestra la correspondencia entre cada una de las partes de los cebadores de minisecuenciación de cada mutación y polimorfismo con las secuencias recogidas en la Lista de secuencias.

TABLA 5

Para el diagnóstico de la Neuropatía Óptica de Leber se emplean las siguientes secuencias: 3316A (SEC. ID. N°: 66 + SEC. ID. N°: 127) ; 3460A (SEC. ID. N°: 68 + SEC. ID. N°: 129) ; 3496T (SEC. ID. N°: 69 + SEC. ID. N°: 130) ; 3497T (SEC. ID. N°: 70 + SEC. ID. N°: 131) ; 4136G (SEC. ID. N°: 71 + SEC. ID. N°: 132) ; 4160C (SEC. ID. N°: 72 + SEC. ID. N°: 133) ; 4216C (SEC. ID. N°: 73 + SEC. ID. N°: 134) ; 4917G (SEC. ID. N°: 74 + SEC. ID. N°: 135) ; 5244A (SEC. ID. N°: 75 + SEC. ID. N°: 136) ; 7444A (SEC. ID. N°: 78 + SEC. ID. N°: 139) ; 9101C (SEC. ID. N°: 87 + SEC. ID. N°: 147) ; 9176C (SEC. ID. N°: 88 + SEC. ID. N°: 148) ; 9176G (SEC. ID. N°: 89 + SEC. ID. N°: 148) ; 9438A (SEC. ID. N°: 90 + SEC. ID. N°: 149) ; 9738T (SEC. ID. N°: 92 + SEC. ID. N°: 151) ; 9804A (SEC. ID. N°: 93 + SEC. ID. N°: 152) ; 10663C (SEC. ID. N°: 96 + SEC. ID. N°: 156) ; 11778A (SEC. ID. N°: 97 + SEC. ID. N°: 157) ; 13528G (SEC. ID. N°: 101 + SEC. ID. N°: 161) ; 13708A (SEC. ID. N°: 102 + SEC. ID. N°: 162) ; 13730A (SEC. ID. N°: 103 + SEC. ID. N°: 163) ; 14459A (SEC. ID. N°: 75 + SEC. ID. N°: 165) ; 14482A (SEC. ID. N°: 104 + SEC. ID. N°: 166) ; 14482G (SEC. ID. N°: 105 + SEC. ID. N°: 166) ; 14484C (SEC. ID. N°: 106 + SEC. ID. N°: 167) ; 14495G (SEC. ID. N°: 107 + SEC. ID. N°: 168) ; 14498C (SEC. ID. N°: 108 + SEC. ID. N°: 169) ; 14568T (SEC. ID. N°: 109 + SEC. ID. N°: 170) ; 14596T (SEC. ID. N°: 110 + SEC. ID. N°: 171) ; 15257A (SEC. ID. N°: 73 + SEC. ID. N°: 177) ; 3394C (SEC. ID. N°: 119 + SEC. ID. N°: 180) ; 3635A (SEC. ID. N°: 120 + SEC. ID. N°: 181) ; 4640A (SEC. ID. N°: 121 + SEC. ID. N°: 182) ; 11696G (SEC. ID. N°: 119 + SEC. ID. N°: 185) .

La minisecuenciación se puede llevar a cabo bien utilizando los cuatro ddNTPs, marcados cada uno de ellos con un fluorocromo distinto, o bien, utilizando el mismo fluorocromo para los cuatro ddNTPs. En el primer caso se realizan tres reacciones de minisecuenciación por muestra, a la que se añaden los cuatro ddNTPs con marcajes distintos; mientras que en el segundo caso serian necesarias doce reacciones de minisecuenciación por muestra, teniendo cada una de ellas uno de los cuatro ddNTPs marcado y los otros tres sin marcar (en realidad, y dado que la tercera reacción de minisecuenciación comprende sólo dos mutaciones ambas las cuales incorporan únicamente ddTTP y ddCTP, sólo son necesarios diez reacciones, ver Figura 2) . Utilizando microarrays constituidos por varios subarrays (Figura 2) , en el caso de reacciones con cuatro fluorocromos distintos podremos analizar un número de muestras cuatro veces superior por microarray al que analizaríamos con un único fluorocromo. Por otro lado, la posibilidad de usar un único fluorocromo hace esta técnica más flexible, permitiendo que se pueda realizar en laboratorios que no disponen de escáner que lea a cuatro longitudes de onda distintas.

7. Hibridación de los productos de la reacción de minisecuenciación con el microarray

Los productos de la reacción de minisecuenciación son hibridados con el microarray. Las colas (tag) situadas en el extremo 5' de los cebadores de minisecuenciación hibridarán con las secuencias reversas y complementarias de dichas colas (cTag) que constituyen el microarray (Figura 1 y Figura 2) . Para hibridar de forma independiente cada subarray se utiliza un molde de silicona que nos permite aislar cada subarray de los demás, formando cámaras de hibridación independientes para cada uno de ellos. El producto de cada reacción de minisecuenciación es añadido a la cámara de hibridación que le corresponda por su situación sobre el microarray. La hibridación tiene lugar a 42°C durante 180 minutos. Transcurrido este tiempo se procede a lavar el microarray para retirar los restos de los productos de las reacciones de minisecuenciación que no se han unido.

8. Escaneado del microarray

El microarray se escanea para detectar en que posiciones del microarray hay fluorescencia. Esto se realiza siguiendo las instrucciones del escáner usado en cada caso. Cuando la minisecuenciación se ha hecho con los cuatro ddNTPs marcados con el mismo fluorocromo, solamente es necesario leer a la longitud de onda de dicho fluorocromo. Sin embargo, si hemos utilizado cuatro marcajes distintos deberemos escanear el microarray para cada una de las longitudes de onda de los fluorocromos.

9. Análisis de los resultados mediante un software de análisis de imagen

Las imágenes obtenidas con el escáner deben ser analizadas para cuantificar la fluorescencia en cada uno de los puntos del microarray. Esto se puede realizar con cualquier software apropiado para esta aplicación.

10. Interpretación de los resultados

En la Tabla 6 se muestran los alelos descritos para cada uno de las mutaciones y polimorfismos asociados a la Neuropatía Óptica de Leber, así como el ddNTP incorporado en reacción de minisecuenciación, que no siempre coincide con los alelos descritos, ya que depende de la dirección de diseño del primer.

TABLA 6

El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.

Ejemplo 1

Diagnóstico de una Neuropatía Optica de Leber (LHON)

El siguiente ejemplo ilustra como usar "Mito Chip" en un laboratorio de diagnóstico molecular o de genética clínica.

Se reciben en el laboratorio una muestra de sangre procedente de un paciente con sospecha clínica de una Neuropatía Óptica de Leber.

1. Fabricación del microarray

Se prepara una placa de 96 ó 384 pocillos con las cTags con las que se va a fabricar el microarray (Sec. ID. N°: 5, Sec. ID. N°: 7, Sec. ID. N°: 8, Sec. ID. N°: 9, Sec. ID. N°: 10, Sec. ID. N°: 11, Sec. ID. N°: 12, Sec. ID. N°: 13, Sec. ID. N°: 14, Sec. ID. N°: 17, Sec. ID. N°: 26, Sec. ID. N°: 27, Sec. ID. N°: 28, Sec. ID. N°: 29, Sec. ID. N°: 31, Sec. ID. N°: 32, Sec. ID. N°: 35, Sec. ID. N°: 36, Sec. ID. N°: 40, Sec. ID. N°: 41, Sec. ID. N°: 42, Sec. ID. N°: 43, Sec. ID. N°: 44, Sec. ID. N°: 45, Sec. ID. N°: 46, Sec. ID. N°: 47, Sec. ID. N°: 48, Sec. ID. N°: 49, Sec. ID. N°: 50, Sec. ID. N°: 12, Sec. ID. N°: 58, Sec. ID. N°: 59, Sec. ID. N°: 60 y Sec. ID. N°: 58 de la Lista de secuencias) para que el robot las pueda recoger y depositar sobre el soporte sólido, según se muestra en la Figura 2. Se utilizaron como soporte los "CodeLink Activated Slides" de Amersham Biosciences, y el Arrayer 417 de Affymetrix como robot. Las cTags se diluyeron en tampón de impresión (fosfato sódico pH 8.5, 50 mM) hasta una concentración de 20 μM. Las cTags tienen en el extremo 3' un grupo amino que se va a unir covalentemente a la superficie de los "CodeLink Activated Slides". Una vez que se han depositado las cTags sobre los portaobjetos se dejan secar de 4 a 72 horas.

A continuación es necesario bloquear los grupos amino-reactivos de la superficie del microarray a la que no se han unido las cTags. Esto se lleva a cabo mediante una serie de pasos que consisten en:

a) Colocar los microarrays en un tubo tipo Falcon de 50 mL y añadir la solución de bloqueo (0.1 M Tris, 50 mM etanolamina, pH 9.0) precalentada a 50°C durante 30 minutos.

b) Tirar la solución de bloqueo.

c) Enjuagar los microarrays dos veces con agua destilada.

d) Lavar los microarrays con 4x SSC (NaCl 0.6 M, citrato sódico 0.06 M) , 0.1% SDS (dodecil sulfato sódico) (precalentado a 50°C) durante 30 minutos con agitación.

e) Tirar la solución de lavado y enjuagar con agua destilada.

f) Centrifugar los microarrays a 800 r.p.m. durante 3 minutos. Para ello los microarrays se colocan en una caja para portaobjetos y esta caja se centrifuga en una centrífuga de placas, o bien, se meten los microarrays en tubos Falcon de 50 mL y se centrifugan en una centrífuga con un rotor para este tipo de tubos.

g) Se guardan a temperatura ambiente hasta que vayan a ser usados.

En este ejemplo se ha utilizado un microarray. El Arrayer 417 de Affymetrix permite fabricar hasta 42 microarrays, que pueden ser guardados hasta su uso (10 meses en el caso de los "CodeLink Activated Slides") .

2. Extracción del ADN de la muestra de sangre

La extracción del ADN de la muestra se puede realizar por cualquier método de extracción o utilizando cualquier kit de extracción apropiado para este tipo de muestras. Al amplificarse únicamente 3 fragmentos de ADN mitocondrial la cantidad de muestra necesaria es muy pequeña (unos 10 microlitros de ADN a una concentración de entre 100 y 200 nanogramos/microlitro es más que suficiente) , con el consiguiente ahorro de muestra. De hecho todo el análisis se puede realizar con unas pocas gotas de sangre (< 300 microlitros de sangre total) .

3. Amplificación de los fragmentos

Una vez extraído el ADN de la sangre, se procede a amplificar los 3 fragmentos del ADN mitocondrial. Esto se hace según el protocolo descrito anteriormente empleando el sistema "Expand Long Template PCR" de Roche. En la Tabla 3 se muestran los cebadores de para cada fragmento.

Las PCR largas se llevaron a cabo en 25 μL de volumen final. Las condiciones de las PCRs para los tres fragmentos se muestran en la Tabla 4. Para su realización se preparan dos premixes que se mezclan en el momento de introducirlas en el termociclador, tal y como se ha indicado anteriormente.

4. Comprobación de la amplificación

Se comprobó la amplificación mediante electroforesis en geles de agarosa standar al 1%. Los geles se prepararon manualmente en el laboratorio añadiéndose al mismo bromuro de etidio para la visualización del ADN. Su composición es:

- 0.3 g de Agarosa DNA Typing Grade

- 30 mL de TAE lx (Tris Acético EDTA 0.5 M, pH 8.5)

- 1.5 μL de Bromuro de Etidio (10 mg/mL) (concentración final de BrEt de 0.5 mg/mL) .

Se carga en el gel 2 μL del producto de PCR con 10 μL de Solución de Carga (Tris-Acetato-EDTA pH 8.3, azul de bromofenol, sacarosa y glicerol) .

La determinación del tamaño de los fragmentos obtenidos se hizo comparando con un marcador de peso molecular (1 Kb DNA Ladder, New England BioLabs) .

En esta etapa se puede detectar la presencia de deleciones o duplicaciones.

5. Mezcla de los productos de las 3 PCRs largas

Los productos de las tres reacciones de PCR de cada muestra se mezclan en un único tubo y se dejan evaporando a 37°C hasta llegar a un volumen final de 30 μL.

6. Purificación de los productos de PCR

Los productos de PCR deben ser purificados para eliminar los posibles restos de cebadores y dNTPs de la PCR para evitar que interfieran en la reacción de minisecuenciación. Para ello, se añaden 4 μL de Exo-SapIT (Amersham Bioscience) a 10 μL de los productos de PCR mezclados y concentrados, y se incuban a 37°C durante 15 minutos, seguido de otros 15 minutos a 85°C.

7. Reacción de minisecuenciación o Single Base Extensión (SBE)

En este caso se ha utilizado el mismo fluorocromo para los cuatro ddNTPs y por lo tanto son necesarias diez reacciones por muestra. Cada una de las reacciones se llevó a cabo en un volumen final de 15 μL. Las concentraciones de cada uno de los reactivos se muestran en la Tabla 7. Los 32 cebadores utilizados en la minisecuenciación se recogen en la Tabla 5 y son los siguientes: 3316A (SEC. ID. N°: 66 + SEC. ID. N°: 127) ; 3460A (SEC. ID. N°: 68 + SEC. ID. N°: 129) ; 3496T (SEC. ID. N°: 69 + SEC. ID. N°: 130) ; 3497T (SEC. ID. N°: 70 + SEC. ID. N°: 131) ; 4136G (SEC. ID. N°: 71 + SEC. ID. N°: 132) ; 4160C (SEC. ID. N°: 72 + SEC. ID. N°: 133) ; 4216C (SEC. ID. N°: 73 + SEC. ID. N°: 134) ; 4917G (SEC. ID. N°: 74 + SEC. ID. N°: 135) ; 5244A (SEC. ID. N°: 75 + SEC. ID. N°: 136) ; 7444A (SEC. ID. N°: 78 + SEC. ID. N°: 139) ; 9101C (SEC. ID. N°: 87 + SEC. ID. N°: 147) ; 9176C (SEC. ID. N°: 88 + SEC. ID. N°: 148) ; 9176G (SEC. ID. N°: 89 + SEC. ID. N°: 148) ; 9438A (SEC. ID. N°: 90 + SEC. ID. N°: 149) ; 9738T (SEC. ID. N°: 92 + SEC. ID. N°: 151) ; 9804A (SEC. ID. N°: 93 + SEC. ID. N°: 152) ; 10663C (SEC. ID. N°: 96 + SEC. ID. N°: 156) ; 11778A (SEC. ID. N°: 97 + SEC. ID. N°: 157) ; 13528G (SEC. ID. N°: 101 + SEC. ID. N°: 161) ; 13708A (SEC. ID. N°: 102 + SEC. ID. N°: 162) ; 13730A (SEC. ID. N°: 103 + SEC. ID. N°: 163) ; 14459A (SEC. ID. N°: 75 + SEC. ID. N°: 165) ; 14482A (SEC. ID. N°: 104 + SEC. ID. N°: 166) ; 14482G (SEC. ID. N°: 105 + SEC. ID. N°: 166) ; 14484C (SEC. ID. N°: 106 + SEC. ID. N°: 167) ; 14495G (SEC. ID. N°: 107 + SEC. ID. N°: 168) ; 14498C (SEC. ID. N°: 108 + SEC. ID. N°: 169) ; 14568T (SEC. ID. N°: 109 + SEC. ID. N°: 170) ; 14596T (SEC. ID. N°: 110 + SEC. ID. N°: 171) ; 15257A (SEC. ID. N°: 73 + SEC. ID. N°: 177) ; 3394C (SEC. ID. N°: 119 + SEC. ID. N°: 180) ; 3635A (SEC. ID. N°: 120 + SEC. ID. N°: 181) ; 4640A (SEC. ID. N°: 121 + SEC. ID. N°: 182) ; 11696G (SEC. ID. N°: 119 + SEC. ID. N°: 185) .

TABLA 7

Por cada muestra se realizaron tres reacciones de minisecuenciación, cambiando únicamente las mezclas de cebadores:

- Mezcla 1: con los cebadores de las mutaciones y polimorfismos 3316A, 3460A, 3496T, 4136G, 4160C, 4216C, 4917G, 5244A, 7444A, 9101C, 9438A, 9738T, 9804A, 10663C, 11778A, 13708A, 13730A, 14482A, 14484C, 14568T, 15257A, 3394C, 3635A, 4640A, 11696G.

- Mezcla 2: con los cebadores de las mutaciones 3497T, 13528G, 14482G, 14498C y 14596T.

- Mezcla 3: con los cebadores de las mutaciones 14459A y 14495G.

8. Hibridación de los productos de la reacción de minisecuenciación con el microarray

Se coloca el microarray en la cámara de hibridación con la silicona formando las cámaras de hibridación independientes. Se preparan las muestras a hibridar mezclando 7 μL de los productos de la reacción de minisecuenciación con el tampón de hibridación (4x SSC, 0.1% SDS) en un volumen final de 15 μL. Se introducen los 15 μL de cada muestra en cada una de las cámaras de hibridación formadas por el molde de silicona. La disposición de las muestras sobre el microarray se realiza según la Figura 2, de forma que cada fila representa una muestra y las columnas las reacciones de minisecuenciación con uno de los cuatro ddNTP marcados. En este caso, la primera columna son las muestras con ddATP-Tarara, la segunda columna con ddTTP-Tamra, la tercera con ddCTP-Tamra y la cuarta con ddGTP-Tamra. Se deja incubar el microarray en un horno de hibridación a 42°C durante 180 minutos, aproximadamente. Pasado este tiempo se retira el microarray de la cámara de hibridación y se lava siguiendo los siguientes pasos:

a) Colocar el microarray en un tubo tipo Falcon de 50 mL y enjuagar brevemente con 4x SSC.

b) Pasar el microarray a otro tubo de 50 mL y lavar con 2x SSC y 0.1% SDS a 42°C durante 5 minutos.

c) Tirar la solución de lavado y repetir el paso b.

d) Tirar la solución.

e) Lavar con 0.2x SSC a temperatura ambiente durante 1 minuto. Tirar la solución.

f) Lavar con 0.1x SSC a temperatura ambiente durante 1 minuto. Tirar la solución.

g) Centrifugar los microarrays a 1000 r.p.m. durante 5 minutos. Para ello los microarrays se colocan en una caja para portaobjetos y esta caja se centrifuga en una centrifuga de placas, o bien, se meten los microarrays en tubos Falcon de 50 mL y se centrifugan en una centrífuga con un rotor para este tipo de tubos.

h) Se guardan en la oscuridad hasta ser escaneados.

9. Escaneado del microarray

Se escanea el microarray a la longitud de onda del fluorocromo utilizado en la reacción de minisecuenciación. En este caso hemos usado el "Scanner 418 de Affymetrix".

10. Análisis de los resultados mediante un software de análisis de imagen

Se cuantificó la fluorescencia con el Imagene 4.1 (BioDiscover y Inc.) .

11. Interpretación de los resultados

En la Tabla 8 se representan los resultados obtenidos. Dado que los resultados obtenidos a partir de la muestra de sangre del paciente se corresponden para las mutaciones asociadas a la Neuropatía óptica de Leber con la mutación 11778A, considerada patológica, podemos confirmar esta patología. La presencia de dos alelos raros no tiene significación clínica clara y en ausencia de otros datos clínicos de interés no se deben informar.

TABLA 8

Descripción de las figuras

Figura 1. Esquema del procedimiento de SBE-Tags para genotipado de variantes de copia única. La reacción de minisecuenciación unirá un nucleótido al cebador de minisecuenciación específico para cada mutación (A) , el cual a su vez se unirá por su cola o Tag a una secuencia complementaria (cTag) fijada al soporte en la fase de hibridación (B) . Cada mutación queda fijada a un punto específico del soporte.

Figura 2. Diseño del microarray. El rectángulo de la izquierda representa el portaobjetos sobre el que se fabrica el microarray. En el interior de este rectángulo hay una matriz de círculos. Cada uno de estos círculos representa un subarray. Cada subarray está formado por las cTags correspondientes a cada SNP (cada uno de los puntos del subarray) . La situación de cada una de las cTags en el subarray tiene que ser conocida, aunque puede variar de un microarray a otro. En esta figura se muestra una de las disposiciones posibles incluyendo otras mutaciones además de las asociadas a la Neuropatía Óptica de Leber.

Figura 3. Esquema del protocolo a seguir para el genotipado mutaciones y polimorfismos del ADN mitocondrial mediante el procedimiento descrito.

Claims

ES-2308868_A1

1. Procedimiento para la detección en una muestra biológica de la Neuropatía Óptica de Leber, patología de origen mitocondrial, mediante el uso de secuencias específicas del genoma mitocondrial humano mediante chips de ADN para la detección de la alteración causante de la patología que puede ser alguna de las mutaciones primarias G 11778A, T 14484C y A3460G y de las mutaciones y polimorfismos asociados a la misma: 3316A, 3496T, 3497T, 4136G, 4160C, 4216C, 4917G, 5244A, 7444A, 9101C, 9438A, 9738T, 9804A, 10663C, 13528G, 13708A, 13730A, 14459A, 14482A, 14482G, 14495G, 14498C, 14568T, 14596A, 15257A, 3394C, 3635A, 4640A y 11696G, caracterizado por la amplificación del ADN mitocondrial, y la determinación de dichas mutaciones mediante una reacción de minisecuenciación o Single Base Extension (SBE) utilizando los cebadores de minisecuenciación que finalizan en su extremo 3' en la base anterior a la posición alterada y en el extremo 5' portan una cola o tag y cuyas secuencias se corresponden con los si- guientes identificadores: 3316A (SEQ. ID. N°: 66 + SEQ. ID. N°: 127) ; \hskip0, 2cm 3460A (SEQ. ID. N°: 68 + SEQ. ID. N°: 129) ; 3496T (SEQ. ID. N°: 69 + SEQ. ID. N°: 130) ; 3497T (SEQ. ID. N°: 70 + SEQ. ID. N°: 131) ; 4136G (SEQ. ID. N°: 71 + SEQ. ID. N°: 132) ; 4160C (SEQ. ID. N°: 72 + SEQ. ID. N°: 133) ; 4216C (SEQ. ID. N°: 73 + SEQ. ID. N°: 134) ; 4917G (SEQ. ID. N°: 74 + SEQ. ID. N°: 135) ; 5244A (SEQ. ID. N°: 75 + SEQ. ID. N°: 136) ; 7444A (SEQ. ID. N°: 78 + SEQ. ID. N°: 139) ; 9101C (SEQ. ID. N°: 87 + SEQ. ID. N°: 147) ; 9176C (SEQ. ID. N°: 88 + SEQ. ID. N°: 148) ; 9176G (SEQ. ID. N°: 89 + SEQ. ID. N°: 148) ; 9438A (SEQ. ID. N°: 90 + SEQ. ID. N°: 149) ; 9738T (SEQ. ID. N°: 92 + SEQ. ID. N°: 151) ; 9804A (SEQ. ID. N°: 93 + SEQ. ID. N°: 152) ; 10663C (SEQ. ID. N°: 96 + SEQ. ID. N°: 156) ; 11778A (SEQ. ID. N°: 97 + SEQ. ID. N°: 157) ; 13528G (SEQ. ID. N°: 101 + SEQ. ID. N°: 161) ; 13708A (SEQ. ID. N°: 102 + SEQ. ID. N°: 162) ; 13730A (SEQ. ID. N°: 103 + SEQ. ID. N°: 163) ; 14459A (SEQ. ID. N°: 75 + SEQ. ID. N°: 165) ; 14482A (SEQ. ID. N°: 104 + SEQ. ID. N°: 166) ; 14482G (SEQ. ID. N°: 105 + SEQ. ID. N°: 166) ; 14484C (SEQ. ID. N°: 106 + SEQ. ID. N°: 167) ; 14495G (SEQ. ID. N°: 107 + SEQ. ID. N°: 168) ; 14498C (SEQ. ID. N°: 108 + SEQ. ID. N°: 169) ; 14568T (SEQ. ID. N°: 109 + SEQ. ID. N°: 170) ; 14596T (SEQ. ID. N°: 110 + SEQ. ID. N°: 171) ; 15257A (SEQ. ID. N°: 73 + SEQ. ID. N°: 177) ; 3394C (SEQ. ID. N°: 119 + SEQ. ID. N°: 180) ; 3635A (SEQ. ID. N°: 120 + SEQ. ID. N°: 181) ; 4640A (SEQ. ID. N°: 121 + SEQ. ID. N°: 182) ; 11696G (SEQ. ID. N°: 119 + SEQ. ID. N°: 185) , para su posterior detección mediante la hibridación de los productos de la reacción de minisecuenciación con un microarray constituido por las secuencias complementarias a las colas (cTag) siguientes: SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, SEQ. ID. N°: 9, SEQ. ID. N°: 10, SEQ. ID. N°: 11, SEQ. ID. N°: 12, SEQ. ID. N°: 13, SEQ. ID. N°: 14, SEQ. ID. N°: 17, SEQ. ID. N°: 26, SEQ. ID. N°: 27, SEQ. ID. N°: 28, SEQ. ID. N°: 29, SEQ. ID. N°: 31, SEQ. ID. N°: 32, SEQ. ID. N°: 35, SEQ. ID. N°: 36, SEQ. ID. N°: 40, SEQ. ID. N°: 41, SEQ. ID. N°: 42, SEQ. ID. N°: 43, SEQ. ID. N°: 44, SEQ. ID. N°: 45, SEQ. ID. N°: 46, SEQ. ID. N°: 47, SEQ. ID. N°: 48, SEQ. ID. N°: 49, SEQ. ID. N°: 50, SEQ. ID. N°: 12, SEQ. ID. N°: 58, SEQ. ID. N°: 59, SEQ. ID. N°: 60 y SEQ. ID. N°: 58, oligonucleótidos complementarios a las colas que portan los cebadores de minisecuenciación en su extremo 5'. Las cTags se encuentran unidas al soporte sobre el que se fabrica el microarray por el extremo 3'. Dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:

a) Fabricación de los microarrays.

b) Amplificación mediante PCR larga de los fragmentos de ADN que incluyen las mutaciones y polimorfismos seleccionados.

c) Comprobación de la amplificación.

d) Mezcla de los productos de PCR y concentración del ADN mediante evaporación.

e) Purificación de los productos de PCR.

f) Reacción de minisecuenciación o Single Base Extensión (SBE) .

g) Hibridación de los productos de la reacción de minisecuenciación con el microarray.

h) Escaneado del microarray a la longitud de onda correspondiente, según los fluorocromos utilizados en la reacción de minisecuenciación.

i) Análisis de los resultados mediante un software de análisis de imagen.

j) Interpretación de los resultados.

2. El chip de mutaciones, según reivindicación 1, caracterizado por estar constituido por los microarrays fabricados con las secuencias identificadas en la lista de secuencias como SEQ. ID. N°: 5, SEQ. ID. N°: 7, SEQ. ID. N°: 8, SEQ. ID. N°: 9, SEQ. ID. N°: 10, SEQ. ID. N°: 11, SEQ. ID. N°: 12, SEQ. ID. N°: 13, SEQ. ID. N°: 14, SEQ. ID. N°: 17, SEQ. ID. N°: 26, SEQ. ID. N°: 27, SEQ. ID. N°: 28, SEQ. ID. N°: 29, SEQ. ID. N°: 31, SEQ. ID. N°: 32, SEQ. ID. N°: 35, SEQ. ID. N°: 36, SEQ. ID. N°: 40, SEQ. ID. N°: 41, SEQ. ID. N°: 42, SEQ. ID. N°: 43, SEQ. ID. N°: 44, SEQ. ID. N°: 45, SEQ. ID. N°: 46, SEQ. ID. N°: 47, SEQ. ID. N°: 48, SEQ. ID. N°: 49, SEQ. ID. N°: 50, SEQ. ID. N°: 12, SEQ. ID. N°: 58, SEQ. ID. N°: 59, SEQ. ID. N°: 60 y SEQ. ID. N°: 58, y por los cebadores de minisecuenciación, SEQ. ID. N°: 66, SEQ. ID. N°: 127, SEQ. ID. N°: 68, SEQ. ID. N°: 129, SEQ. ID. N°: 69, SEQ. ID. N°: 130, SEQ. ID. N°: 70, SEQ. ID. N°: 131, SEQ. ID. N°: 71, SEQ. ID. N°: 132, SEQ. ID. N°: 72, SEQ. ID. N°: 133, SEQ. ID. N°: 73, SEQ. ID. N°: 134, SEQ. ID. N°: 74, SEQ. ID. N°: 135, SEQ. ID. N°: 75, SEQ. ID. N°: 136, SEQ. ID. N°: 78, SEQ. ID. N°: 139, SEQ. ID. N°: 87, SEQ. ID. N°: 147, SEQ. ID. N°: 88, SEQ. ID. N°: 148, SEQ. ID. N°: 89, SEQ. ID. N°: 148, SEQ. ID. N°: 90, SEQ. ID. N°: 149, SEQ. ID. N°: 92, SEQ. ID. N°: 151, SEQ. ID. N°: 93, SEQ. ID. N°: 152, SEQ. ID. N°: 96, SEQ. ID. N°: 156, SEQ. ID. N°: 97, SEQ. ID. N°: 157, SEQ. ID. N°: 101, SEQ. ID. N°: 161, SEQ. ID. N°: 102, SEQ. ID. N°: 162, SEQ. ID. N°: 103, SEQ. ID. N°: 163, SEQ. ID. N°: 75, SEQ. ID. N°: 165, SEQ. ID. N°: 104, SEQ. ID. N°: 166, SEQ. ID. N°: 105, SEQ. ID. N°: 166, SEQ. ID. N°: 106, SEQ. ID. N°: 167, SEQ. ID. N°: 107, SEQ. ID. N°: 168, SEQ. ID. N°: 108, SEQ. ID. N°: 169, SEQ. ID. N°: 109, SEQ. ID. N°: 170, SEQ. ID. N°: 110, SEQ. ID. N°: 171, SEQ. ID. N°: 73, SEQ. ID. N°: 177, SEQ. ID. N°: 119, SEQ. ID. N°: 180, SEQ. ID. N°: 120, SEQ. ID. N°: 181, SEQ. ID. N°: 121, SEQ. ID. N°: 182, SEQ. ID. N°: 119, SEQ. ID. N°: 185.

3. Procedimiento de amplificación del ADN mitocondrial según reivindicación 1 caracterizado por el empleo de los cebadores de amplificación SEQ. ID N°: 188 a 193.

4. Aplicaciones del array de mutaciones, fabricado según las reivindicaciones anteriores, para análisis genético en casos de pacientes de neuropatía óptica de Leber, con patología probada o con sospecha clínica de patología, dentro del campo del diagnóstico molecular, así como para todos los estudios genético-poblacionales en los que estos marcadores sean de interés.

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ES-2308868_A1

Clasificación avanzada:
C12Q 1/68 (2006.01)
G01N 33/53 (2006.01)

El presente informe ha sido realizado para las siguientes reivindicaciones: TODAS
Fecha de realización del informe: 03.11.2008
Examinador: B. Pérez Esteban

Categoría	Documentos citados	Reivindicaciones afectadas
X	HIRSCHHORN, J N, et al. SBE-TAGS: an array-based method for	1-4
	efficient single-nucleotide polymorphism genotyping. Proc. Nat.
	Acad. Sci. 24-10-2000, vol. 97, número 22, páginas 12164-12169.
	Ver todo el documento.
X	FAN, J-B, et al. Paralell genotyping of human SNPs using generic	1-4
	high-density oligonucleotide tag arrays. Genome Res. 2000,
	vol. 10, páginas 853-860. Ver todo el documento, especialmente
	páginas 853,854,858 y figura 1.
A	US 5670320 A (WALLACE, D C, et al.) 23.09.1997,	1-4
	todo el documento.
A	US 5185244 A (WALLACE, D C) 09.02.1993, todo el documento.	1-4

Categoría de los documentos citados
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