Método para diagnosticar o determinar la predisposición genética a desarrollar miocardiopatía hipertrófica.
Campo de la invención
La invención se relaciona con un método para determinar in vitro la predisposición genética de un sujeto a desa- rrollar miocardiopatía hipertrófica o para diagnosticar un sujeto de dicha enfermedad, basado en un ensayo genético, extracorpóreo, de una muestra biológica procedente de dicho sujeto, que comprende detectar la presencia o ausencia de una mutación puntual de un nucleótido, asociada con dicha enfermedad, en el gen MYH7 que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana.
Antecedentes de la invención
La miocardiopatía hipertrófica (MCH) es una enfermedad autosómica dominante que representa un grupo heterogéneo de enfermedades del músculo cardíaco cuyos síntomas y manifestaciones clínicas incluyen grados variables de hipertrofia y alteración de la función sistólica y diastólica. La MCH puede ser familiar (MCHF) o esporádica (MCHE) . Los individuos afectados por dicha enfermedad pueden ser sintomáticos o asintomáticos. La prevalencia es de aproximadamente 1/500 en la población general y la consecuencia más seria es la muerte súbita de los individuos portadores y aparentemente sanos.
La MCHF es una enfermedad hereditaria del músculo cardíaco que se caracteriza por un incremento en la masa ventricular y una alteración de la función sistólica y diastólica. La patología de la MCHF es el resultado de las consecuencias fisiológicas de la alteración de la función sistólica y diastólica, y sus características patológicas están bien establecidas (Maron BJ & Epstein SE. 1980. Amer. J. Cardiol. 45:141-154; Braunwald E. 1997. Heart Disease: a textbook of cardiovascular medicine. WB Saunders; Philadelphia. p 1404) . Además del hallazgo clásico del engrosamiento asimétrico del septo interventricular también puede observarse la hipertrofia de la pared anterior del ventrículo izquierdo y del apex cardíaco. La distribución anatómica y la severidad de la hipertrofia pueden ser muy variables. Con frecuencia se observa fibrosis en el ventrículo hipertrofiado y en la región del septo.
La mayoría de las anormalidades histológicas características de la MCHF tienen que ver con la desorganización de las miofibrillas en los miocitos. Los miocitos pueden hipertrofiarse hasta diez o veinte veces el diámetro normal de una célula cardíaca (Becker AE. 1989. Pathology of Cardiomyopathies, en Cardiomyopathies: Clinical Presentation, Differential Diagnosis, and Management, Shaver JA ed., F. A. Davis Co., New York, pp. 9-31; Braunwald E. 1997. Heart Disease: a textbook of cardiovascular medicine. WB Saunders; Philadelphia. p 1404) .
Actualmente se admite que la MCH es el resultado de mutaciones en genes que codifican las proteínas del aparato contráctil. De hecho, entre las posibles causas de dicha enfermedad, se reconoce la existencia de mutaciones en los siguientes genes: cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana (MYH7) ; Proteína de unión a la miosina (MYBPC3) ; Troponina T (TNNT2) ; Troponina I (TNNI3) ; Troponina C (TNNC 1) ; Alfa tropomiosina (TPM1) , Cadena reguladora ligera de la miosina (MYL2) ; Cadena ligera esencial de la miosina (MYL3) , Actina cardíaca alfa (ACTC) (Richard P et al; 2003 Circulation. 107 (17) :2227-32) ; Titina (TTN) (Satoh et al. 1999. Biochem Biophys Res Commun 262, 411) ; Cadena pesada de la alfa miosina (MYH6) (Tanigawa et al. 1990.) Cell 62, 991) ; Sub-unidad no catalítica gamma 2, activada por AMP, de la proteína kinasa (PRKAG2) (Gollob et al. (2001) N Engl J Med 344, 1823; Blair et al. 2001 Hum Mol Genet 10, 1215) ; Quinasa 2 de la cadena ligera de la miosina (MYLK2) (Davis et al. 2001 Cell 107, 631) ; Genoma mitocondrial (Arbustini et al. Heart 1998; 80:548-58) .
Diversos análisis genéticos han permitido identificar mutaciones en el gen MYH7, que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana, asociadas a la aparición de MCHF (Seidman CE & Seidman JG. 1991. Mol. Biol. Med. 8:159-166; Tanigawa et al. 1990. Cell 62:991-998; Geisterfer-Lowrance et al. 1990. Cell 61:999-1006) , habiéndose identificado más de 100 mutaciones causantes de MCHF (http://www.cardiogenomics.org) .
Actualmente el diagnóstico de la MCHF se basa en los datos clínicos, fundamentalmente el ecocardiograma. Sin embargo, este sistema no permite detectar los casos de muerte súbita que, en general, están provocados por la presencia de una mutación en alguno de los genes implicados. Como es conocido, la MCHF es la primera causa de muerte súbita en personas jóvenes y, dada su prevalencia (1/500) , puede estimarse que el número de portadores de alguna de las mutaciones responsables de dicha enfermedad en nuestro país se acerca a las 75.000 personas.
El gran tamaño de los genes relacionados hasta la fecha con la aparición de MCH, por ejemplo, el gen MYH7 (28.425 pares de bases) dificulta en gran medida la identificación de mutaciones asociadas con MCH. Esta invención proporciona un método sencillo y rápido para la identificación de algunas mutaciones en el gen MYH7 que pueden ser causa de MCH.
Compendio de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento de una nueva mutación puntual en el gen MYH7 asociada con una mayor predisposición de que el sujeto que la porta desarrolle MCH. La nueva mutación puntual en el gen MYH7 asociada con el desarrollo o la predisposición a desarrollar MCH identificada en esta invención es la mutación Met388Thr, la cual se definirá detalladamente más adelante.
La identificación de la presencia de dicha mutación en el gen MYH7 en un sujeto con MCH permite tomar medidas preventivas en el caso de los portadores, tales como ejercicio, medicación, consejo genético, etc. En los casos en los que se identifiquen mutaciones consideradas de alto riesgo podrán tomarse medidas adicionales tales como la implantación de un desfibrilador con el fin de evitar la muerte súbita del sujeto portador de tales mutaciones.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método para determinar in vitro la predisposición genética de un sujeto a desarrollar MCH que comprende analizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica procedente de dicho sujeto para detectar la presencia o ausencia de una mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH, en el que dicha mutación es Met388Thr.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de diagnóstico in vitro de MCH que comprende obtener una muestra biológica procedente de un sujeto en donde dicha muestra biológica contiene ácido nucleico y diagnosticar el sujeto de MCH mediante la detección de la presencia de una mutación puntual en el gen MYH7, en el que dicha mutación es Met388Thr, como indicador de la enfermedad.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método no invasivo para diagnosticar MCH en un sujeto que comprende aislar, a partir de una muestra de sangre procedente de dicho sujeto, un fragmento del ácido nucleico presente en dicha muestra de sangre que comprende, al menos, una de las regiones del gen MYH7 en donde se encuentra la mutación puntual responsable de dicha mutación Met388Thr, y diagnosticar el sujeto de MCH mediante la detección de la presencia o ausencia de, al menos, dicha mutación, como indicador de la enfermedad.
La invención proporciona, por tanto, un método para determinar in vitro la predisposición genética de un sujeto a desarrollar MCH, o para diagnosticar un sujeto de MCH, bien sea familiar (MCHF) o esporádica (MCHE) , basado en la detección de una nueva mutación puntual en el gen MYH7 relacionada con la aparición de dicha enfermedad. La detección de la mutación en una persona con riesgo o predisposición genética de desarrollar MCH puede realizarse de forma relativamente sencilla y rápida usando el método proporcionado por esta invención.
El método proporcionado por esta invención constituye una herramienta útil de diagnóstico y/o pronóstico que resulta particularmente importante cuando se aplica sobre sujetos asintomáticos de los cuales se sospecha que pueden tener la enfermedad. Los sujetos sintomáticos tienen muchas más probabilidades de ser diagnosticados adecuadamente por un médico. Los sujetos asintomáticos de familias que tengan una historia de MCHF podrían ser diagnosticados usando el método de esta invención lo que permitiría su diagnóstico antes de la aparición de los síntomas. A los sujetos en los que se detecte una mutación responsable de MCHF se les puede aconsejar unas pautas de comportamiento que probablemente prolonguen su vida; por ejemplo, evitar el ejercicio intenso, medicación, etc., y, en su caso, implantarles un desfibrilador.
Descripción detallada de la invención
Definiciones Para facilitar la comprensión de la invención objeto de esta solicitud de patente, se expone, a continuación, el significado de algunos términos y expresiones tal como se utilizan en el contexto de la presente invención.
El término "MCH" se refiere a la miocardiopatía hipertrófica e incluye la miocardiopatía hipertrófica familiar (MCHF) y la miocardiopatía hipertrófica esporádica (MCHE) .
El término "predisposición genética" se refiere a la probabilidad de que un sujeto desarrolle una patología determinada (en este caso, MCH) ; a modo ilustrativo, un sujeto con una predisposición genética elevada tendrá más probabilidades que la media para desarrollar dicha patología, mientras que un sujeto con una predisposición genética reducida tendrá menos probabilidades que la media para desarrollar dicha patología.
El término "sujeto" se refiere a un ser humano, de sexo masculino o femenino, de cualquier raza o edad.
El término "proteína" se refiere a una cadena molecular de aminoácidos, unidos por enlaces covalentes o no covalentes. El término incluye todas las formas de modificaciones post-traduccionales, por ejemplo glicosilación, fosforilación o acetilación. Los términos "péptido" y "polipéptido" se refieren a cadenas moleculares de aminoácidos que representan un fragmento proteico. Los términos "proteína", "péptido" y "polipéptido", se usan indistintamente.
El término "MYH7" se refiere al gen que codifica la proteína denominada "cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana". La secuencia de nucleótidos del gen MYH7 es conocida [Jaenicke T et al. 1990. Genomics 8:194-206; NCBI, número de acceso M57965, versión M57965.2 (GI: 24429600) ].
El término "gen" se refiere a una cadena molecular de desoxirribonucleótidos, que codifica una proteína.
El término "DNA" se refiere al ácido desoxirribonucleico. Una secuencia de DNA es una secuencia de desoxirribonucleótidos.
El término "cDNA" se refiere a una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de mRNA.
El término "RNA" se refiere al ácido ribonucleico. Una secuencia de RNA es una secuencia de ribonucleótidos.
El término "mRNA" se refiere al ácido ribonucleico mensajero, que es la fracción del RNA total que se traduce a proteínas.
El término "secuencia de nucleótidos" o "secuencia nucleotídica" se refiere indistintamente a una secuencia de ribonucleótidos (RNA) o de desoxirribonucleótidos (DNA) .
El término "mutación puntual" se refiere a un SNP (single nucleotide polymorphism) , es decir, una variante en una única base de una secuencia de nucleótidos determinada.
Para la nomenclatura de las mutaciones puntuales se han seguido las recomendaciones contenidas en las siguientes referencias: (i) den Dunnen JT, Antonarakis SE. 2000. Mutation nomenclature extensions and suggestions to describe complex mutations: a discussion. Hum Mutat. 15 (1) :7-12; y (ii) Antonarakis SE. Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations. Nomenclature Working Group. Hum Mutat. 11 (1) :1-3.
Invención La invención proporciona, en general, un método para evaluar in vitro la predisposición genética de un sujeto a desarrollar MCH. Dicho método permite identificar aquellos sujetos que, dentro de un grupo o población de sujetos, presentan una mayor predisposición genética de desarrollar MCH. Dicho método puede utilizarse tanto con fines de diagnóstico (método de diagnóstico) como con fines de pronóstico (método de pronóstico) . Un método de diagnóstico se refiere a un ensayo realizado sobre un sujeto al que previamente se le ha determinado su pertenencia a un grupo de riesgo de padecer MCH debido a que presente síntomas o a los resultados de otro análisis diferente. Un método de pronóstico se refiere a un método que ayuda a predecir, al menos en parte, el posible desarrollo de la MCH en un sujeto. A modo ilustrativo, se puede analizar un sujeto al que previamente no se le ha diagnosticado MCH, o que carece de síntomas, con el fin de obtener información sobre la probabilidad de que dicho individuo desarrolle MCH.
Por tanto, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para determinar in vitro la predisposición genética de un sujeto a desarrollar MCH que comprende analizar el ácido nucleico contenido en una muestra biológica procedente de dicho sujeto para detectar la presencia o ausencia de una mutación puntual en el gen MYH7 asociada con la MCH, en el que dicha mutación puntual asociada con la MCH, en adelante mutación puntual de la invención, es la mutación Met388Thr.
En una realización particular, la secuencia de nucleótidos del gen MYH7 comprende la SEQ. ID. NO: 1. En este caso, el cambio de nucleótidos relacionado con la mutación puntual de la invención es el siguiente:
| Mutación | Cambio del nucleótido |
| Met388Thr | 10127T>C |
La presencia de dicha mutación puntual de la invención en el ácido nucleico presente en la muestra biológica procedente del sujeto ensayado es indicativa de la existencia de una mayor predisposición genética de dicho sujeto a desarrollar MCH que la media, o de que dicho sujeto puede ser diagnosticado de MCH o de que dicho sujeto ha desarrollado MCH.
La puesta en práctica de dicho método comprende la obtención previa de una muestra biológica del sujeto a ensayar y analizar el ácido nucleico contenido en dicha muestra biológica para detectar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención mediante cualquier método apropiado para detectar tales mutaciones.
La muestra biológica procedente del sujeto a ensayar puede ser cualquier muestra biológica de dicho sujeto que contenga ácido nucleico. El ácido nucleico presente en dicha muestra biológica puede ser DNA, por ejemplo, DNA genómico (gDNA) o cDNA, o RNA, por ejemplo, mRNA. Para analizar gDNA se puede utilizar prácticamente cualquier muestra biológica que contenga gDNA, por lo que muestras puras de eritrocitos de mamíferos no pueden ser utilizadas. Asimismo, para analizar cDNA o mRNA la muestra biológica debe ser obtenida de células o tejidos que expresen MYH7. A modo ilustrativo, la muestra biológica que contiene ácido nucleico procedente del sujeto a ensayar puede ser una muestra de tejido o de sangre de dicho sujeto. En una realización particular, dicha muestra biológica se obtiene a partir de células nucleadas de sangre periférica del sujeto a ensayar.
El ácido nucleico contenido en la muestra biológica procedente del sujeto a ensayar puede ser aislado por métodos convencionales mediante el empleo de kits comerciales que permiten el aislamiento de ácidos nucleicos. Algunos de los sistemas comerciales para la extracción de ácidos nucleicos están comercializados por diversas compañías, tales como Qiagen y Amersham Biosciences, por citar dos ejemplos. Los protocolos de extracción están bien establecidos en los manuales de instrucciones que se ofrecen junto con los kits de extracción de ácidos nucleicos suministrados por las empresas mencionadas.
Muchos de los métodos aquí descritos para detectar la presencia o ausencia de una mutación puntual de la invención requieren la amplificación de la secuencia diana del ácido nucleico presente en la muestra biológica procedente del sujeto a ensayar, por ejemplo, la amplificación previa de un fragmento del gen MYH7 que comprende la región en donde se desea estudiar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención.
Dicha amplificación puede realizarse por cualquier técnica conocida, preferentemente, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o cualquiera de sus variantes, por ejemplo, PCR anidada o nested-PCR. Información sobre la realización de PCR y sus variantes puede encontrarse en las patentes norteamericanas US 4.965.188, US 4.800.159, US 4.683.202 y US 4.683.195, así como en las publicaciones de Ausubel et al. eds. Shorts Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, Wiley, 1995; e Innis et al., eds., PCR Protocols, Academic Press, 1990.
Otros métodos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Wu & Wallace. 1989. Genomics 4:560-569; Landegren et al. 1988. Science 241:1077-1080) , la amplificación por desplazamiento de banda (G. Walker et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396; G. Walker et al. 1992. Nucleic Acid Res. 20:1691-1696) , la amplificación basada en la transcripción (D. Kwoh et al. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177) , la replicación de secuencia auto-sostenida (3SR) (J. Guatelli et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878) , el sistema de la replicasa Qβ (P. Lizardi et al. 1988. BioTechnology 6:1197-1202) , la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) (R. Lewis. 1992. Genetic Engineering News 12 (9) :1) y la amplificación por la polimerasa del fago phi29 (L. Blanco et al. 1989. J Biol Chem. 264:8935-8940) .
La presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención en el ácido nucleico presente en la muestra biológica procedente del sujeto a ensayar se puede detectar por métodos convencionales, por ejemplo, mediante el empleo de sondas de oligonucleótidos marcadas con un grupo marcador detectable o mediante reacciones enzimáticas específicas.
En una realización particular, la determinación de la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención en el ácido nucleico presente en la muestra biológica procedente del sujeto a ensayar se realiza mediante el empleo de una sonda de oligonucleótidos específica marcada con un grupo marcador detectable. Se han descrito numerosos ensayos que utilizan sondas marcadas, los cuales pueden ser utilizados en la puesta en práctica de la presente invención (véanse, por ejemplo, las patentes norteamericanas US 4.302.204, US 4.358.535, US 4.563.419 o US 4.994.373) . A modo ilustrativo, en una realización concreta, dicha mutación puntual de la invención se detecta mediante el empleo de una sonda de nucleótidos fijada sobre un soporte sólido, en donde dicha sonda de nucleótidos se selecciona entre una sonda de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia normal de nucleótidos que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana o a un fragmento de la misma que contiene la región donde se desea estudiar la presencia o ausencia de mutación puntual, y una sonda de nucleótidos que es completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana mutada (portadora de la mutación a detectar) o a un fragmento de la misma que contiene la región donde se desea estudiar la presencia o ausencia de mutación puntual, y detectar la presencia o ausencia de hibridación.
En otra realización particular, la determinación de la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención en el ácido nucleico presente en la muestra biológica procedente del sujeto a ensayar se realiza mediante una reacción enzimática específica para detectar polimorfismos, por ejemplo, mediante digestión con enzimas de restricción y análisis de los fragmentos de restricción (RFLP) (véanse, por ejemplo, las patentes norteamericanas US 5.324.631 y US 5.645.995) . A modo ilustrativo, la mutación puntual de la invención puede ser detectada mediante el uso de una enzima de restricción que reconoce específicamente el nucleótido donde reside la mutación puntual asociada a la MCH, verificándose posteriormente la presencia o ausencia de corte de dicha enzima de restricción mediante la separación de los fragmentos de restricción por electroforesis en un gel de agarosa o poliacrilamida (véanse los Ejemplos que acompañan a esta descripción) .
Otras técnicas apropiadas para detectar la mutación puntual de la invención incluyen la secuenciación directa de nucleótidos (Ausubel et al. eds. Shorts Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, Wiley, 1995; Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning 2nd ed. Chap. 13, Cold Spring Harbor Laborator y Press) , que puede realizarse por cualquier método apropiado, por ejemplo, mediante el método de secuenciación de didesoxinucleótidos (Sanger) , secuenciación química (Maxam & Gilbert) o variantes de los mismos; minisecuenciación directa (US 5.846.710, US 5.888.819, Syvanen et al. 1993, Am. J. Hum. Genet. 52:46-59, Shumaker et al. 1996. Human Mut. 7:346-354, Pastinen et al. 1997. Genome Res. 7:606-614) ; ensayos de hibridación en array, por ejemplo, el ensayo múltiple de diagnóstico específico de alelo (MASDA) (US 5.834.181; Shuber et al. 1997. Hum. Molec. Genet. 6:337-347) ; ensayos dependientes de discriminación de alelos basada en hibridación utilizando, por ejemplo, sondas TaqMan (US 5.962.233; Livak et al. 1995. Nature Genet. 9:341-342) o Molecular Beacons (US 5.925.517, Tyagi et al., Nature Biotech, 16:49-53) ; electroforesis en gel diagonal de fragmentos de restricción dispuestos en placas de microtitulación (MADGE) (Day & Humpohries. 1994. Anal. Biochem. 222:389-395) , transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET) (US 5.945.283, Chen et al. 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10756-10761) .
La relación de métodos para detectar mutaciones puntuales previamente mencionada es únicamente ilustrativa y no pretende ser exhaustiva. Los expertos en la materia entenderán que cualquier otro método que permita detectar una mutación puntual o un SNP puede ser utilizado para la puesta en práctica de la presente invención y cae dentro del espíritu de la misma.
Adicionalmente, si se desea, se puede detectar si el sujeto es heterozigótico u homozigótico para una mutación puntual determinada, es decir, detectar la presencia o ausencia de dichas mutaciones puntuales en ambos cromosomas del sujeto. En general, la presencia de 2 copias de la misma mutación puntual asociada a MCH (es decir, individuos homozigóticos para dicha mutación puntual) puede indicar un mayor riesgo de desarrollar MCH que en un individuo heterozigótico para dicha mutación puntual.
La mutación puntual de la invención se ha identificado mediante un ensayo (Ejemplo 1) consistente en la amplificación previa, mediante PCR, de una secuencia diana del gen MYH7 contenido en una muestra de ácido nucleico presente en una muestra de sangre periférica de un sujeto diagnosticado de MCH, seguido de un análisis de polimorfismo conformacional de una hebra (SSCP) y secuenciación directa de los productos de amplificación que mostraron un patrón de movilidad anormal en el gel de SSCP bajo cualquiera de las condiciones ensayadas. La confirmación de la mutación puntual se realizó mediante un análisis RFLP o mediante el diseño de iniciadores degenerados específicos para la mutación puntual en cuestión.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método de diagnóstico in vitro de MCH que comprende obtener una muestra biológica procedente de un sujeto en donde dicha muestra biológica contiene ácido nucleico y diagnosticar el sujeto de MCH mediante la detección de la presencia de la mutación puntual de la invención en dicho ácido nucleico, es decir, de la mutación Met388Thr.
Este método comprende, por tanto, la obtención de una muestra biológica que contiene ácido nucleico del sujeto a ensayar y analizar el ácido nucleico presente en dicha muestra biológica para detectar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención mediante cualquier método apropiado para detectar tal mutación. La muestra biológica procedente del sujeto debe presentar las mismas características que las mencionadas previamente en relación con el método in vitro para determinar la predisposición genética de un sujeto a desarrollar MCH previamente descrito. Generalmente, antes de proceder a detectar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención se procede a amplificar la secuencia diana del ácido nucleico presente en la muestra biológica procedente del sujeto a ensayar, es decir, a amplificar un fragmento del gen MYH7 que comprende la región en donde se desea estudiar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención. Dicha amplificación puede realizarse por cualquiera de las técnicas conocidas mencionadas previamente, por ejemplo, mediante PCR o cualquiera de sus variantes. El análisis del ácido nucleico para detectar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención asociada con la MCH se puede realizar por cualquiera de las técnicas previamente mencionadas. La existencia de la mutación puntual de la invención en el ácido nucleico presente en la muestra biológica procedente del sujeto ensayado permite diagnosticar al sujeto de MCH.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método no invasivo para diagnosticar MCH en un sujeto que comprende aislar, a partir de una muestra de sangre procedente de dicho sujeto, un fragmento del ácido nucleico presente en dicha muestra de sangre que comprende, al menos, la región del gen MYH7 en donde se encuentra la mutación puntual de la invención asociada a MCH, es decir, la mutación Met388Thr, y diagnosticar el sujeto de MCH mediante la detección de la presencia o ausencia de dicha mutación puntual de la invención en dicho fragmento de ácido nucleico.
En una realización particular, dicho método comprende la obtención de una muestra de sangre, por ejemplo, de sangre periférica, del sujeto a ensayar, la amplificación de un fragmento del ácido nucleico presente en dicha muestra de sangre que comprende, al menos, la región del gen MYH7 en donde puede encontrarse la mutación puntual de la invención, analizar la presencia o ausencia de dicha mutación puntual de la invención, y, en su caso, diagnosticar al sujeto de MCH. Tanto la amplificación del ácido nucleico como su análisis para detectar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención se pueden realizar mediante cualquiera de los métodos previamente descritos. Adicionalmente, si se desea, dicho método comprende la evaluación de los síntomas clínicos de la MCH en el sujeto que está siendo estudiado.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, en particular, un kit útil para determinar la predisposición de un sujeto a desarrollar MCH o para diagnosticar un sujeto de MCH, que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia o ausencia de, al menos, la mutación puntual de la invención, es decir, la mutación Met388Thr.
En una realización particular, dicho reactivo específico para detectar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención en el gen MYH7 que codifica para la proteína cadena pesada de la beta miosina cardiaca humana, es una sonda de nucleótidos que permite distinguir el alelo que contiene una T en la posición 10127 de la SEQ. ID. NO: 1 del alelo que contiene una C en dicha posición. En otra realización particular, dicho kit comprende, al menos, una enzima de restricción que permite distinguir el alelo que contiene una T en la posición 10127 de la SEQ. ID. NO: 1 del alelo que contiene una C en dicha posición, tal como, por ejemplo, la enzima de restricción NlaIII.
En otra realización particular, el kit proporcionado por esta invención comprende, al menos, un oligonucleótido iniciador útil para la amplificación de un fragmento de ácido nucleico, tal como un fragmento del gen MYH7 que comprende la región en donde se desea estudiar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención. En una realización particular, dicho oligonucleótido iniciador se selecciona del grupo formado por los oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ. ID. NO: 20, SEQ. ID. NO: 21, y sus mezclas. Dichos oligonucleótidos iniciadores constituyen un aspecto adicional de la presente invención.
Los oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ. ID. NO: 20 (directo) y SEQ. ID. NO: 21 (inverso) permiten amplificar un fragmento correspondiente al exón 13 del gen MYH7 útil para identificar la mutación Met388Thr (10127T>C) .
En otro aspecto, la invención se relaciona con un biochip, en particular, un biochip útil para determinar la predisposición de un sujeto a desarrollar MCH o para diagnosticar un sujeto de MCH, que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia o ausencia de, al menos, la mutación puntual de la invención, es decir, la mutación Met388Thr en el gen MYH7, soportado sobre un soporte sólido.
En una realización particular, el reactivo específico para detectar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención, en particular, en la secuencia de nucleótidos del gen MYH7 que codifica la cadena pesada de la beta miosina cardiaca humana, es dicha sonda previamente mencionada en relación con el kit.
En otra realización particular, dicho biochip comprende, al menos, un oligonucleótido iniciador útil para la amplificación de un fragmento de ácido nucleico, tal como un fragmento del gen MYH7 que comprende la región en donde se desea estudiar la presencia o ausencia de la mutación puntual de la invención. En una realización particular, dicho oligonucleótido iniciador se selecciona del grupo formado por los oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ. ID. NO: 20, SEQ. ID. NO: 21, y sus mezclas.
Dicho biochip puede contener, además de, al menos uno de dichos oligonucleótidos iniciadores identificados como SEQ. ID. NO: 20, SEQ. ID. NO: 21, uno o más oligonucleótidos iniciadores seleccionados entre los identificados como SEQ. ID. NO: 1-SEQ. ID. NO: 19, SEQ. ID. NO: 22-SEQ. ID. NO: 35, SEQ. ID. NO: 36, SEQ. ID. NO: 37, SEQ. ID. NO: 38-SEQ. ID. NO: 63, SEQ. ID. NO: 64, SEQ. ID. NO: 65 y SEQ. ID. NO: 66-SEQ. ID. NO: 85. Estos oligonucleótidos iniciadores amplifican fragmentos incluidos en distintos exones del gen MYH7 (Tabla 1) .
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Oligonucleótidos iniciadores para la amplificación de fragmentos del gen MYH7 
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
Ejemplo 1
Estrategia para la detección de mutaciones puntuales en el gen MYH7
1.1 Estudio de familias
Los miembros de las familias fueron evaluados mediante exploración física, electrocardiograma de 12 derivaciones y ecocardiografía de dos dimensiones. El diagnóstico de MCH se basó en la demostración de la existencia de engrosamiento ventricular y del septo superior al 112% del valor normal en ausencia de hipertensión arterial. Se confeccionó un árbol genealógico de cada paciente y a los familiares de primer grado se les ofreció la posibilidad de acudir a consulta. Se revisaron las historias clínicas de los familiares fallecidos en los casos en los que fue posible. En los casos índice y familiares vivos, previo consentimiento informado se recogieron muestras de sangre periférica para extracción y conservación de ADN.
1.2 Oligonucleótidos para amplificar el gen MYH7
Los oligonucleótidos iniciadores utilizados para amplificar distintos fragmentos del gen MYH7 son los indicados en la Tabla 1 (mostrada antes) .
1.3 Amplificación de las secuencias de DNA
Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias del gen MYH7 a partir del DNA obtenido de una muestra de sangre periférica procedente de sujetos enfermos (pacientes) de MCH. Los iniciadores usados se relacionan listan en la Tabla 1.
Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un volumen final de 50 μL con 500 ng de DNA en una mezcla de Tris-HCl 20 mM, pH 8, 4, KCl 50 mM, MgCl2 1, 5 mM, 200 μM de cada dNTP, 0, 2 μM de cada desoxinucleótido y 1, 5 unidades de Taq DNA polimerasa (QIAGEN) . Las condiciones de la PCR fueron de un ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 10 minutos, seguido de 35 ciclos: desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, hibridación entre 58ºC y 65ºC durante 1 minuto y elongación a 74ºC durante 1 minuto; al final de dichos ciclos se realizó una extensión a 72ºC durante 5 minutos.
1.4 SSCP
Se realizó un análisis SSCP de los productos de PCR en un sistema GenePhor (Pharmacia) siguiendo las indicaciones del fabricante. Todas las muestras se corrieron bajo 2 condiciones de temperatura (12ºC y 20ºC) y 2 condiciones de pH (8, 3 y 9) . Se usaron los iniciadores de la Tabla 1.
1.5 Secuenciación directa de los productos de PCR
Se realizó secuenciación directa del producto de PCR de todas las muestras que mostraron un patrón de movilidad anormal en el gel de SSCP bajo cualquiera de las condiciones estudiadas. En todos los casos se realizó la secuencia con el iniciador directo e inverso mediante secuenciación automática en un equipo Beckman CQ 2000XL y se siguieron las instrucciones del fabricante. Se usaron los iniciadores que figuran en la Tabla 1.
La reacción de secuenciación se llevó a cabo en un termociclador PE Gene Amp System 9700 utilizando los reactivos del kit CEQ2000 Dye terminator Cycle Sequencing con Quick Start de Beckman (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, EEUU) y los iniciadores de la Tabla 1. Los fragmentos generados por la reacción de secuenciación se analizaron en un secuenciador automático CEQ 2000XL DNA Analysis System de Beckman. Los cambios observados en la secuencia se confirmaron mediante secuenciación automática de un segundo producto de PCR de la misma muestra. La confirmación posterior en dicho segundo producto de PCR de la misma muestra se llevó a cabo mediante el corte del producto de PCR con una enzima de restricción específica (RFLP) o mediante el diseño de un iniciador degenerado específico para la mutación.
Ejemplo 2
Identificación de una mutación en el exón 13 del gen MYH7 asociada con MCH
En dos miembros de la familia CS se encontró la mutación 10127T>C, es decir, un cambio de T (timina) por C (citosina) en el nucleótido 10127 (según la secuencia del gen MYH7 depositada en la NCBI con el número de acceso M57965, versión M57965.2 (GI: 24429600) ] lo que provoca un cambio de metionina (Met) a treonina (Thr) en el aminoácido 388 de la cadena pesada de la beta miosina cardíaca humana (Met388Thr) .
Esta mutación "missense" abole una diana de corte para la enzima de restricción NlaIII que está normalmente presente en el exón 13 del gen MYH7 lo que proporciona un método independiente para realizar el diagnóstico genético. Se amplificó la secuencia correspondiente al exón 13 del gen MYH7 a partir de DNA genómico obtenido de sangre periférica. Se usaron como iniciadores los oligonucleótidos identificados mediante la SEQ. ID. NO: 20 (directo) y la SEQ. ID. NO: 21 (inverso) . El producto de PCR se digirió con NlaIII y posteriormente se sometió a electroforesis en gel de agarosa. La secuencia normal producía 2 fragmentos de 128 y 61 pares de bases (pb) respectivamente. La secuencia mutada carecía del sitio de corte para NlaIII, y, por tanto, la mitad del producto de PCR de los individuos portadores tenía el tamaño de 189 pb.
