Método de producción de giberelinas GA3 mediante fermentaciones con la estirpe silvestre IMI58289 del hongo Gibberella fujikuroi.
Objeto
Es objeto de esta invención un método de producción de giberelinas GA3, usando la estirpe silvestre IMI58289 de Gibberella fujikuroi, sin necesidad de manipulación genética previa del hongo.
Las giberelinas (GAs) son fitohormonas naturales que regulan el crecimiento y la floración de las plantas entre otras actividades fisiológicas. Estas fitohormonas se encuentran a nivel de trazas en las plantas pero su aplicación exógena produce resultados espectaculares por lo que tienen un gran interés en agricultura intensiva y la industria de la cerveza. Se han descrito más de 100 giberelinas entre las cuales GA3 (1) , también conocida como ácido giberélico, se ha considerado tradicionalmente la giberelina más activa en plantas (MacMillan, J, Natural Product Report, 1997, 221) . Sin embargo estudios recientes han mostrado que GA1 (2) tiene una importante actividad biológica, incluso superior a GA3 en plantas como el arroz (Kobayashi M, MacMillan J, Phinney B, Gaskin P, Spray CR, Hedden P, Phytochemistr y , 2000, 55, 317) , el tomate (Grünzwig JM, Rabinowitch HD, Katan J, Wodner M, Ben-Tal Y, Phytochemistr y 1997, 46, 811) , el cerezo (Huanpu M, Blake PS, Browning G; Taylor JM, Phytochemistr y , 2001, 56, 67) o el guisante (Yaxley JR, Ross JJ, Sherriff LJ, Reid JB, Plant Physiol, 2001, 125, 627) .
Antecedentes de la invención
El hongo filamentoso Gibberella fujikuroi es un organismo capaz de producir giberelinas en cantidades suficientes para su explotación industrial.
La producción de giberelinas por distintas estirpes silvestres o mutantes de Gibberella fujikuroi en diversos medios de cultivo ha sido descrita en varias ocasiones. Concretamente, la producción de GA3 (1) ha sido cubierta bajo diferentes patentes (GB844341, GB850018, GB886551, US2918413) así como la producción de la mezcla activa de giberelinas GA4 + GA7 (US6287800, CN1222575) . Sin embargo, la producción de GA3 (2) o mezclas de GA1 + GA3 a niveles que puedan ser útiles en la industria agroquimica no ha sido descrita previamente, y precisamente la invención que se presenta en esta solicitud de patente consiste en un método de producción de giberelinas GA3.
Descripción de la invención
En esta solicitud de patente se describe un método para la producción de giberelinas con la estirpe silvestre de Gibberella fujikuroi IMI58289 sin necesidad de manipulación genética previa del hongo.
En primer lugar, la estirpe IMI58289 se incuba durante 6 días en medio de rico en nitrógeno, condiciones en las que se inhibe la producción de giberelinas. A los seis días, los cultivos se filtran y el micelio se lava con agua destilada y se resuspende en una solución de glucosa con microelementos. La incubación posterior en estas condiciones da lugar a una mezcla de giberelinas aproximada de 0.1 g/l de medio cultivado, con una proporción inusualmente elevada de GA3 .
Los extractos de cada fermentación fueron analizados mediante espectroscopia 1H RMN y la técnica combinada Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (CG-EM) [Columna: HP-1 (Crosslinked Methyl Siloxane) 25 m x 0.2 mm x 0.33 μm; gas portador: helio con un flujo de 0.6 ml/min; temperatura del inyector: 260ºC; temperatura del detector: 280ºC; temperatura inicial: 120ºC, incrementada a 5ºC/min hasta 220ºC, incrementada posteriormente a 3ºC/min hasta 280ºC, donde se mantiene durante 10 minutos].
Descripción de una realización preferida
La fermentación se llevó a cabo en dos etapas. En una primera etapa se distribuyó el medio de cultivo rico en nitrógeno en matraces Erlenmeyer, que se inocularon con una suspensión de esporas de la estirpe silvestre IMI58289 de Gibberella fujikuroi. Los matraces, tapados con algodón graso para facilitar la aireación, se incubaron a 30ºC con una agitación orbital de 200 rpm aproximadamente. A los 6 días se detuvo la fermentación y se separó el micelio del medio de cultivo por filtración. A continuación se resuspendió en una solución de glucosa con microelementos y se incubó durante 6 días en las condiciones arriba mencionadas. Finalmente se filtró el caldo de cultivo, se acidificó a pH 1.5-3 con HCl, y se extrajo con acetato de etilo. La evaporación a vacío del disolvente y posterior desengrasado del extracto generó un residuo constituido mayoritariamente por giberelinas. La giberelina mayoritaria de esta mezcla fue GA3 (en una proporción superior al 50%) .
