Utilización de la alfa-ciclodextrina en la preparación de medicamentos para el tratamiento de las enfermedades humanas o animales causadas por parásitos pertenecientes al género Cr y ptosporidium.
Sector de la técnica
El protozoo parásito Cr y ptosporidium es ubicuo y se desarrolla en el borde de las microvellosidades de los enterocitos y en el tracto respiratorio de una amplia variedad de hospedadores vertebrados, entre los que se incluye el hombre. Está implicado en numerosos brotes hídricos y alimentarios, representando el principal problema relacionado con el empleo de aguas en países industrializados (Fayer, R.; Morgan, U. and Upton, S.J. Int. J. Parasitol. (2000) 30: 1305-1322) . La infección se caracteriza por la producción de una diarrea acuosa, deshidratación y pérdida de peso, adquiriendo un carácter grave y un pronóstico fatal en mamíferos neonatos y en individuos inmunocomprometidos (Current, W.L. and García, L.S. Clin. Microbiol. (1991) 4: 325-358) .
En la actualidad, 14 especies de Cr y ptosporidium están consideradas como válidas, basándose en diferencias existentes en la morfología de los ooquistes (formas infectantes) , lugar de la infección, especificidad por la clase de hospedador y diferencias genéticas: C. muris que infecta a roedores; C. andersoni, infectando a bovinos; C. parvum, que infecta a bovinos, hombre y otros mamíferos; C. hominis, que infecta al hombre; C. meleagridis, C. baileyi y C. galli en aves; C. serpentis y C. saurophilum en serpientes y lagartos; C. molnari Y C. nasorum en peces; C. wrairi en cobayas; C. felis en gatos y C. canis en perros (cit. Ryan, U.; Xiao, L.; Read, C.; Zhou, L.; Lal, A.A.; Pavlaasek, I. App. Environ. Microbiol. (2003) 69 4302-4307) .
C. parvum es la especie más ampliamente estudiada, y en la actualidad existen evidencias fundamentadas de que en el grupo de C. parvum existen distintos genotipos (Morgan, U.M.; Monis, P.T.; Fayer, R.; Deplazes, P. and Thompson R.C.A. J. Parasitol. (1999) 85: 1126-1133; Xiao; L.; Morgan; U.; Limor, J.; Escalante, A.; Arrowood, M.; Schulaw, W.; Thompson, R.C.A.; Fayer, R. and Lal, A.A. App. Environ. Microbiol. (2000) 65: 3386-3391; Morgan-Ryan, U.M.; Fall, A.; Ward, L.A.; Hijjawi, N.; Sulaiman, I.; Fayer, R.; Thompson, R.C.A.; Olson, M.; Lal, A.A. and Xiao, L. J. Eukar y ot. Microbiol. (2002) 49: 433-440.
C. parvum genotipo bovino y C. hominis (sin. C. parvum genotipo I) son responsables de la mayoría de las infecciones en rumiantes y en el hombre, aunque recientemente se han diagnosticado otras especies como C. meleagridis, C. felis y C. canis (Tzipori, S. and Ward, H. Microbes Infec. (2002) 4. 1047-1058) .
En el hombre, y debido a que el curso clínico de la cr y ptosporidiosis depende fundamentalmente del estado inmunitario, las opciones terapéuticas varían considerablemente. En adultos inmunocompetentes y en niños, la infección suele ser autolimitada, por lo que no está indicado tratamiento. Sin embargo, al tratarse de una enfermedad diarreica se aconseja la hidratación. En enfermos de SIDA, en los que la infección puede cronificarse, el tratamiento ideal implica la restauración parcial de la función inmune con terapia antirretroviral. Palella, F.J. et al. New Eng. J. Med. (1998) 338:853-860, comprobaron que la morbilidad y mortalidad por infecciones oportunistas han decrecido enormemente con el empleo de esta terapia. Incluso varios estudios demostraron un descenso en la prevalencia de la cr y ptosporidiosis subsecuente a la aplicación de este tratamiento (Kim, L.S. et al. J.Clin. Infec. Dis. (1998) 27:655-656; Lemoing, V. et al. AIDS (1998) 12: 1395-1397) . Además, varios trabajos han demostrado la resolución de la diarrea por Cr y ptosporidium coincidiendo con un aumento en el número de linfocitos T CD4 paralelo a la administración de la terapia antirretroviral triple (Carr, A. et al. Lancet (1998) 351:256-261; Foudraine, N.A. et al. AIDS (1998) 12:35-41. Si este tratamiento antirretroviral no es posible, pueden ser considerados varios antibióticos que demostraron una cierta eficacia frente a Cr y ptosporidium, como la paromomicina, la nitazoxanida y la azitromicina. De ellos, la paromomicina es la más ampliamente empleada y presenta cierta actividad en modelos experimentales y en ensayos clínicos (Fichtenbaum, C.J. et al. Clin. Infec. Dis. (1993) 16:298-300; Flanigan, T.P. et al. Am. J. Med. (1996) 100:370-372) . Una combinación paromomicina-azitromicina ha sido propuesta por Smith, N.H. et al. Infec. Dis. (1998) 178:900-903) pudiendo ser consideradas terapias experimentales (Crabb, J.H. Adv. Parasitol. (1998) 40:121-149.
En rumiantes recién nacidos y de hasta tres meses de edad, en la actualidad, tan sólo el lactato de halofuginona, la paromomicina y el decoquinato han demostrado ser parcialmente efectivos en la prevención y en el tratamiento de la cr y ptosporidiosis, al disminuir el periodo de excreción ooquística y la gravedad de la diarrea, cuando se administran durante periodos que oscilan entre 3 y 21 días e incluso hasta 8 semanas. Sin embargo, en algunos casos, ciertos autores comprobaron la aparición de reinfecciones asintomáticas una vez suspendido el tratamiento (Villacorta, I.; Peeters, J.E.; Vanopdenbosch, E.; Ares-Mazás, E. and Heys, H.. Antimicrob. Agents Chemother. (1991) 35: 283-287; Fayer; R. and Ellis, W. J. Parasitol. (1993) 79:771-774; Naciri, M.; Mancassola, R.; Yvoré, P. and Peeters, J.E. Vet. Parasitol. (1993) 45: 199-207; Mancassola, R.; Richard, A. and Naciri, M. Vet. Parasitol. (1997) 69:31-37; Causapé, A.C.; Sánchez-Acedo, C.; Quílez, J.; del Cacho, E. and Viu, M. Res. Rev. Parasitol. (1999) 59: 41-46; Viu, M.; Quílez, J.; Sánchez-Acedo, C.; del Cacho, E. and López-Bernad, F. Vet. Parasitol. (2000) 90:283-287) . De ellos y para uso exclusivamente veterinario, el lactato de halofuginona ha sido comercializado bajo el nombre de Halocur®, formulado como solución oral (0, 5 μg/mL) e indicado para la prevención y reducción de diarreas ocasionadas por C. parvum en terneros recién nacidos, debiendo ser administrado una vez al día y a la misma hora durante 7 días consecutivos.
En conclusión y a pesar de que durante décadas se han evaluado tanto in vitro como in vivo en modelos animales y en ensayos clínicos, centenares de agentes quimio e inmunoterapéuticos, en la actualidad todavía no se dispone de un tratamiento curativo o preventivo específico frente a la cr y ptosporidiosis (Coombs, G.H. and Müller, S. Int. J. parasitol. (2002) 32: 497-508) . Sin embargo, recientemente se han obtenido resultados esperanzadores con el empleo de la beta-ciclodextrina (Castro-Hermida, J.A.;González-Losada, Y.A.; Freire-Santos, F.; Mezo-Menéndez, M. and Ares-Mazás, E. Vet. Parasitol. (2001) 101: 85-89; Castro-Hermida, J.A.; Quílez-Cinca, J.; López-Bernad, F.; Sánchez-Acedo, C.; Freire-Santos, F. and Ares-Mazás, E. Int. J. Parasitol. (2001) 31: 1134-1137 ) y de la nitazoxanida (Gilles, H.M. and Hoffman; P.S. Trends Parasitol. (2002) 18: 95-97) .
Estado de la técnica
En el caso de algunos fármacos ensayados en el tratamiento de la cr y ptosporidiosis humana y animal, se han podido detectar ciertas características físico-químicas que inducen a plantear que una mejora en sus propiedades biofarmacéuticas repercutiría favorablemente en su eficacia. Algunos de los problemas que frecuentemente presentan los fármacos son su baja solubilidad y estabilidad. El descubrimiento de las ciclodextrinas supuso un avance notable en la solución de estos problemas.
La formación de complejos de inclusión con ciclodextrinas permite mejorar la solubilidad de los principios activos y por consiguiente su paso a través de membranas cuando la solubilidad es un factor limitante de la misma. Por otra parte, al mejorar la solubilidad del principio activo, aumenta la fracción que difunde, con lo cual se puede disminuir la dosis de administración y lograr un mismo efecto terapéutico, lo que supone una ventaja adicional en la disminución de los efectos secundarios como consecuencia de las altas dosis administradas.
Algunos principios activos con relativa eficacia en el tratamiento de la cr y ptosporidiosis humana y/o animal presentan escasa solubilidad (espiramicina, furoato de diloxanida, furazolidona, halofuginona, entre otros) o problemas de estabilidad (como por ejemplo la paromomicina) y su eficacia puede ser mejorada formulándose como complejos de inclusión con ciclodextrinas. Ante los resultados obtenidos con la beta-ciclodextrina tanto in vitro como in vivo, nos planteamos evaluar, siguiendo la metodología anteriormente aplicada, si una nueva ciclodextrina, la alfa-ciclodextrina (con mayor solubilidad) muestra una similar actividad anticr y ptosporidial (Castro-Hermida, J.A.; Freire-Santos, F.; Oteíza-López, A.M. and Ares-Mazás, M.E. J. Parasitol. (2000) 86: 1118-1120; Castro-Hermida, J.A.; Ares-Mazás, M.E.; Nieto-Reyes, L.; Otero-Espinar, F. and Blanco-Méndez. Parasitol. Resch. (2001) 87: 449-452; Castro-Hermida, J.A.;González-Losada, Y.A.; Freire-Santos, F.; Mezo-Menéndez, M. and Ares-Mazás, E. Vet. Parasitol. (2001) 101: 85-89; Castro-Hermida, J.A.; Quílez-Cinca, J.; López-Bernad, F.; Sánchez-Acedo, C.; Freire-Santos, F. and Ares-Mazás, E. Int. J. Parasitol. (2001) : 1134-1137; Castro-Hermida, J.A.; Gómez-Couso, H.; Ares, Mazás, M.E.; González-Bedia, M.M.; Castañeda-Cancio, N.; Otero-espinar, F. and Blanco-Méndez, J.J. Pharm. Sciences (2003) en prensa) .
El objeto de la invención es la utilización de la alfa-ciclodextrina (CAS RN: 10016-20-3) en la preparación de medicamentos y cualquier clase de forma farmacéutica para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de la cr y ptosporidiosis humana y animal.
Explicación de la invención
Suspensiones acuosas de ooquistes purificados de C. parvum de origen bovino se expusieron durante 30, 60, 90 y 120 minutos a la acción in vitro de diferentes concentraciones de alfa-ciclodextrina (2, 5; 5; 7, 5; 10; 12, 5 y 15%) y posteriormente la viabilidad ooquística se evaluó mediante dos técnicas: inclusión-exclusión de colorantes vitales fluorogénicos (Ioduro de propidio IP y diamidino-fenilindol DAPI) y desesquistamiento. Paralelamente, las eficacias preventiva y curativa de diferentes dosis de alfa-ciclodextrina (2, 5 y 5%) se ensayaron en un modelo murino experimentalmente infectado.
Los resultados de los ensayos de viabilidad demostraron un descenso en la viabilidad ooquística asociado con un aumento en el tiempo de exposición para cada una de las concentraciones evaluadas. Así, se comprobó un descenso en el porcentaje de desenquistamiento y un aumento en el número de ooquistes inviables (IP+) , en ambos casos relacionado con el incremento en el tiempo de exposición. Además, este efecto fue más durante los primeros 30 minutos de exposición para las concentraciones de 5; 7, 5; 10 y 12, 5% de alfa-ciclodextrina. También, se observó una alta proporción de ooquistes inviables (81%) después de la exposición de los ooquistes de C. parvum a la concentración de 2, 5% durante 24 horas (Tabla 1) .
En los ensayos realizados en ratones lactantes experimentalmente infectados, se comprobó que la prevalencia de la infección en las camadas control (no tratadas) detectada a los 7 días post-infección fue del 100%, con una intensidad media del número de ooquistes en la totalidad del contenido intestinal de 6, 8±2, 4x106. El valor medio del número de ooquistes en la totalidad del contenido intestinal, en todos los ensayos con alfa-ciclodextrina, fue significativamente menor (P<0, 05) que en las camadas control y sólo un 38, 8% de los animales se infectaron cuando la solución de alfa-ciclodextrina al 5% fue administrada 2 horas antes de inocular los animales y cada 24 horas los días 1 y 2 post-inoculación (Tabla 2) .
La alfa-ciclodextrina administrada por vía oral no es tóxica ya que no se absorbe a través del tracto gastrointestinal, impidiéndose así su acumulación en órganos (Irie, T. and Uekama, K. J. Pharm. Sci. (1997) 86: 147-162) . Estudios de toxicidad demostraron que, por vía oral, los valores de DL50 superan a 12, 5; 18, 5 y 5 g/kg peso vivo para ratones, ratas y perros, respectivamente (Szejtli, J. Cyclodextrins in Technology. (1988) . J. Szejli (Ed) . Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Holanda) . Tampoco se observaron efectos tóxicos en ratas cuya dieta fue suplementada en un 10% con alfa-ciclodextrina durante 90 días (Irie, T. and Uekama, K. J. Pharm. Sci. (1997) 86: 147-162) .
Los resultados obtenidos demuestran que la alfa-ciclodextrina presenta una eficacia similar a la demostrada en estudios previos para la beta-ciclodextrina e incluso superior a la comprobada para otros fármacos habitualmente utilizados en el tratamiento de la cr y ptosporidiosis animal.
Exposición detallada de un modo de realización
Se evaluó profilácticamente la alfa-ciclodextrina, formulada como comprimidos, frente a la infección experimental por C. parvum en cabritos recién nacidos. Para ello, se dispuso de 20 animales, machos y hembras, seleccionados al azar y procedentes de una granja en la que no se detectaron problemas de cr y ptosporidiosis en estos últimos años. Los animales se dividieron en 2 grupos (A, B) que se mantuvieron bajo condiciones de estricta higiene. Ambos grupos fueron inoculados oralmente con una jeringuilla conteniendo 10 mL de agua destilada contaminada con 106 ooquistes de C. parvum (d0 = día inoculación) . El grupo A no fue tratado por lo que permaneció como lote control y el grupo B recibió 4 comprimidos de alfa-ciclodextrina (500 mg/kg peso corporal) durante 6 días consecutivos (d0-d5) . Los primeros comprimidos se administraron 4 horas antes de inocular los ooquistes. Los criterios de evaluación aplicados fueron: presencialausencia de diarrea; eliminación ooquística y ganancia de peso corporal los días 15 y 25 post-inoculación.
En el grupo control (A) todos los animales se infectaron y presentaron diarrea durante 2-6 días (media 3, 7 ± 1, 2 días) . La intensidad de eliminación ooquística fue máxima a los 8 días post-inoculación con un valor medio de 3, 5 ± 0, 7. El periodo de patencia osciló entre 10-11 días (media 10, 5 ± 0, 5 días) . Además, en un cabrito se detecto una reinfección aunque la duración de la excreción fue de tan solo 2 días. Un animal murió el segundo día del ensayo y la autopsia reveló hemorragia en la pared del estómago, riñones y las venas mesentéricas ofrecían un aspecto congestionado e incluso se detectó sangre en el contenido intestinal. Los análisis bacteriológicos realizados confirmaron la presencia de Escherichia coli en pulmón, hígado e intestino.
En el grupo tratado profilácticamente (B) , 4 cabritos murieron entre los días 5-8 del ensayo; sin embargo, la autopsia no reveló anomalías y todos los órganos presentaban un aspecto normal. Los análisis bacteriológicos fueron negativos. En los 6 animales restantes, el inicio de la eliminación ooquística se detectó entre los días 4-6 post-inoculación (media 4, 5 ± 0, 8 días) y fue significativamente menor (P<0, 05) que en el grupo control (media 3, 0 ± 0, 0) . o Además, excepto un animal, los demás fueron asintomáticos. La eliminación ooquística osciló entre 7-9 días (media 8, 5 ± 0, 8 días) y fue significativamente menor (P<0, 05) que en el grupo control (media 10, 5 ± 0, 5 días) . No se detectaron reinfecciones. Los animales incrementaron su peso corporal pero no se observaron diferencias significativas (Tabla 3) .
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