Empleo de una mutación en el gen de la deshidrogenasa de fitoeno de Fusarium fujikuroi para producción de γ-caroteno y β-caroteno.
La presente invención se refiere al aislamiento de una mutación en el gen que codifica para la enzima fitoeno deshidrogenasa de Fusarium fujikuroi y a su utilización para obtener estirpes transformantes de hongos superproductores de carotenoides.
Estado de la técnica anterior
Los carotenoides son pigmentos liposolubles presentes en todas las especies fotosintéticas y en algunos microorganismos no fotosintéticos, como bacterias y hongos (Britton et al. 1998 Carotenoids, Vols 1, 2 y 3 Basel: Birkhäuser Verlag; Sandmann et al. 2002 The Mycota X. Industrial applications, Berlin Heidelberg: Springer Verlag, pp 247-262) . En los animales, algunos carotenoides juegan un papel esencial como precursores del retinol (vitamina A) y el ácido retinoico, una importante señal reguladora celular. El consumo de carotenoides tiene además efectos beneficiosos en el hombre, protegiendo frente al daño oxidativo, el cáncer o las enfermedades cardiovasculares (Mayne S.T.; FASEB J. 1996, 10: 690-701) .
Las especies de hongos del género Fusarium tienen gran importancia aplicada por diversas causas. Muchas de ellas son patógenas de plantas, y sus procesos infectivos producen pérdidas en la Agricultura. Algunas de ellas tienen usos industriales. Así, Fusarium fujikuroi (nombre asignado a las estirpes del grupo de cruzamiento C de Gibberella fujukuroi por O'Donnell et al, 1998) es usada para la producción industrial de giberelinas (Brückner et al; 1989 Biotechnology of Vitamins, Pigments and Growth Factors. Elsevier Applied Science) . Fusarium venenatum se utiliza como fuente de micoproteína, material alimentario consistente en micelio compactado del hongo (Yoder et al.; Fungal Genet. Biol. 1998, 23: 62-80) sometido a un tratamiento de reducción en su contenido de ARN. El uso de esta especie con fines alimentarios proviene del estudio comparativo del contenido en proteína de unas tres mil especies d e hongos (Wiebe M.G.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002, 58:421-427) .
Fusarium fujikuroi, como otras especies de Fusarium (Avalos y Cerdá-Olmedo; Current Genetics 1987, 11: 505-511) adquiere una pigmentación anaranjada cuando se incuba en la luz debido a la acumulación de neurosporaxantina, un carotenoide sin aparente interés comercial con un grupo carBoxilo en el extremo (Aasen et al.; Acta Chem. Scand. 1965, 19: 1843-1853) . Este carotenoide se sintetiza a partir de un precursor incoloro, el fitoeno, mediante cinco deshidrogenaciones, una ciclación y una rotura oxidativa. Estas reacciones se indican como D1 a D5, Cl y Ox respectivamente en la Figura 1 de los dibujos, que muestra la ruta biosintética de carotenoides en Fusarium fujikuroi (Avalos y Cerdá-Olmedo; Current Genetics 1987, 11: 505-511) . Los genes responsables de la síntesis de fitoeno, las deshidrogenaciones y la ciclación han sido clonados y caracterizados en la estirpe silvestre IMI58289 (Linnemanstons et al, ; Mol. Genet. Genomics 2002, 267: 593-602) . La secuencia del gen cara de esta estirpe está disponible en las bases de datos bajo el código de acceso AJ426418. Su expresión es reprimida por un gen regulador, cuya pérdida da lugar a un fenotipo de alta producción de carotenoides en cualquier condición de cultivo, incluyendo pequeñas cantidades de gamma-caroteno y beta-caroteno (Avalos y Cerdá-Olmedo; Current Genetics 1987, 11: 505-511) . El gamma-caroteno está presente como intermediario, ya que es el sustrato para la síntesis de toruleno (ver Figura 1) , y el segundo es un producto lateral menor, resultante de la ciclación del otro extremo de la molécula. En dicha Figura 1 se destacan los dos productos mayoritarios en la carotenogénesis de Fusarium en un recuadro de trazo discontínuo.
No se han descrito mutantes de la carotenogénesis de Fusarium que tengan una deshidrogenasa capaz de hacer las cuatro primeras deshidrogenaciones (DI a D4 en el esquema) , pero que sean incapaces de hacer la quinta (D5) . De existir, este mutante acumularía los carotenoides que se destacan en el recuadro de trazo continuo, es decir, gamma-caroteno y beta-caroteno.
Explicación de la invención
La presente invención describe un método genético que permite la obtención de estirpes de Fusarium que acumulen gamma-caroteno y beta-caroteno como productos finales de la carotenogénesis, puesto que han perdido la capacidad de llevar a cabo la quinta desdehidrogenación de la ruta biosintética al presentar una mutación en la deshidrogenasa que altera su capacidad para reconocer el gamma-caroteno como sustrato.
El método se ha desarrollado en una estirpe desrregulada para la carotenogénesis llamada SF4, obtenida a partir de la estirpe SF1, la cual deriva a su vez de la estirpe silvestre FKMC1995.
SF1 es un mutante carente de actividad nitrato reductasa (genotipo niaD4) , y su síntesis de carotenoides es normal. El fenotipo de SF4 (genotipo niaD4 car-35) es similar al de los mutantes superproductores de carotenoides (llamados carS) descritos anteriomente en este hongo, tales como el mutante SG22 (Avalos y Cerdá-Olmedo; Current Genetics 1987, 11: 505-511) . El mutante SF4 se obtuvo a partir de esporas de SF1 siguiendo el protocolo de mutagénesis descrito por Avalos et al. (Appl. Envirom. Microbiol. 1985, 49: 187-191) basado en la incubación de conidios uninucleados en una solución del agente mutagénico N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina. La diferencia entre SF4 y SF1 radica en la cantidad de carotenos, no en su composición, ya que acumulan el mismo producto mayoritario, la neurosporaxantina. En consecuencia, no se espera que el gen carB de estas estirpes posea ninguna mutación respecto al gen de la estirpe silvestre identificada como SEQ ID NO 1.
A partir de SF4, de pigmentación anaranjada, usando el protocolo de mutagénesis ya mencionado (Avalos et al.; Appl. Envirom. Microbiol. 1985, 49: 187-191) , se identificó un mutante de pigmentación amarilla, al que se llamó SF21 (genotipo niaD4 car-35 carB36) . El análisis por cromatografía en capa fina y HPLC de los carotenoides acumulados por SF4 y SF21 muestra la pérdida en SF21 de la neurosporaxantina y el toruleno y la presencia en su lugar de una mezcla de gamma-caroteno y beta-caroteno. El fenotipo del mutante indica que posee una mutación en la deshidrogenasa que altera su capacidad para reconocer el gamma- caroteno como sustrato y que, en consecuencia, ha perdido la capacidad de llevar a cabo la quinta deshidrogenación de la ruta biosintética.
Se han determinado las secuencias del gen carB silvestre de FKMC1995 (SEQ ID NO 1) , responsable de la deshidrogenasa, y del alelo carB36 de SF21, identificado como SEQ ID NO 3. La comparación de ambas secuencias muestra que carB36 difiere del alelo silvestre en una sola mutación a nivel de ADN y de un aminoácido a nivel de proteína. En el caso de ADN se trata d e una sustitución d e una Citosina (C) que ha mutado a Timina (T) en el alelo carB36.
La SEQ ID NO 2 se corresponde con la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen carB de la estirpe silvestre FKMC1995, mientras que la SEQ ID NO 4 se corresponde con la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el alelo carB36 del mutante SF21.
Esta mutación, responsable del fenotipo descrito, se localiza en la posición 170 de la proteína, y consiste en la sustitución de la prolina presente en dicha posición en el gen silvestre por una serina.
La disponibilidad de un método de reemplazamiento génico para este hongo (Fernández-Martín et al.; Mol. Gen. Genet. 2000, 263: 838-845) , permite la introducción de esta nueva versión de la deshidrogenasa en otras estirpes de Fusarium, y por lo tanto permitirá la obtención de estirpes transformantes de Fusarium y/o Giberella superproductoras de gamma-caroteno y beta-caroteno.
La presencia del gen carB36 identificado como SEQ ID NO 3 en transformantes de Fusarium y/o Gibberella, permite que el contenido en γ-caroteno y β-caroteno aumente desde un 5% a un 75% de los carotenoides acumulados por el hongo.
La secuenciación del alelo carB del mutante SF21 se hizo obteniendo por PCR dos veces de forma independiente dos subsegmentos del gen:
- el primero, obtenido con los oligonucleótidos identificados por SEQ ID NO 5 y SEQ ID NO 6, es un segmento de 968 pb que abarca desde 11 bases antes del codón ATG de inicio hasta la mitad de la región codificante. Al hacer la amplificación por duplicado, se obtuvieron dos plásmidos pG4460C95a (3987 pb) y pG4460C95b (3987 pb) ; - el segundo, obtenido con los oligonucleótidos identificados por SEQ ID NO 7 y SEQ ID NO 8, es un segmento de 1136 pb que incluye el resto de la región codificante de carB más 88 pb de la región no codificante, los plásmidos obtenidos fueron pG6769C95a (4155 pb) y pG6769C95b (4155 pb) . Debido a su baja tasa de mutación se usó para la amplificaión por PCR el kit Expand TM High fidelity PCR System
de Roche. Los productos se clonaron en el vector pGEM-T Easy de Promega (3018 pb) y se secuenciaron usando los oligos T7 y SP6.
Son por tanto objeto de la presente invención, vectores que portan el compuesto de ADN descrito como SEQ ID NO 3 o fragmentos del mismo que codifica para la enzima fitoeno deshidrogenasa.
De acuerdo con un modo particular de la presente invención, los vectores que portan dicho compuesto de ADN son plásmidos.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Esquema que muestra la ruta biosintética de carotenoides en Fusarium fujukuroi. A partir de Fitoeno y mediante tres deshidrogenaciones consecutivas (D1, D2 y D3) se obtiene Neurosporeno, del cual mediante una ciclación (Cl) se obtiene \boxempty- zeacaroteno, de éste mediante una cuarta deshidrogenación (D4) se obtiene γ-caroteno, el cual tras una segunda ciclación (C2) da como producto β-caroteno, siendo este el sustrato para una quinta deshidrogenación (D5) se obteniéndose Toruleno, el cual es objeto de una rotura oxidativa (Ox) para la obtención de Neurosporaxantina.
Depósito de microorganismos de acuerdo con el Tratado de Budapest.
Una cepa del mutante SF21 de Fusarium fujikuroi ha sido depositada, según lo previsto en el Tratado de Budapest, en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , Universidad de Valencia Edificio de Investigación, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot, Valencia (España) , con el número CECT 20527.
Exposición detallada de un modo de realización
Ejemplo 1
Obtención de la estirpe SF21 de Fusarium fujikuroi
Se sembraron mediante trasplantes las estirpes SF4 y SF21 sobre agar DG (Avalos et al.; Appl. Envirom. Microbiol. 1985, 49: 187-191) con 3 g/l de asparragina como fuente de nitrógeno y se incubaron durante 9 días en oscuridad. Los micelios se separaron del agar, se liofilizaron y se les extrajo los carotenoides. Su análisis por cromatografía en columna de alúmina muestra que SF4 contiene 802 μg / g de peso seco (ppm) de carotenoides coloreados, de los cuales la mayoría son neurosporaxantina y toruleno. La estirpe SF21 contiene 2282 ppm de carotenoides coloreados, de los cuales la mayoría son gamma-caroteno y beta-caroteno. Los resultados en ppm se muestran en la tabla 1:
TABLA 1 | Estirpe | Carotenoides | Fitoeno | Carotenoides (total) | γ-caroteno | β-caroteno | γ- + β-caroteno |
| (coloreados) | | | | | |
| SF4 | 802 | 98 | 900 | 36 | 14 | 5, 6% |
| SF21 | 2282 | 212 | 2494 | 909 | 951 | 74, 6% |
