Procedimiento de obtención de la vacuna oral anti-Lactococcus garvieae para la prevención de la enfermedad lactococosis de la trucha.
La lactococosis, producida por Lactococcus garvieae, fue diagnosticada por primera vez en 1991 en trucha cultivada en España; convirtiéndose en el principal problema patológico en un gran número de piscifactorías de trucha, produciendo importantes pérdidas económicas (Doménech y col., 1993: Microbiología (SEM) , 9: 63-68; Ravelo y col., 2001: Bulletin of the European Association of Fish Pathologists, 21: 136-144) . Las cepas de Lactococcus garvieae aisladas en España son muy homogéneas, tanto fenotípica como serológicamente, no pudiendo establecerse biotipos ni serotipos. La quimioterapia no es efectiva en el control de esta enfermedad, por lo que no era posible el tratamiento de la misma. Es de especial importancia, por tanto, el contar con vacunas efectivas para prevenir, las mortalidades producidas por este patógeno (Romalde y Toranzo, 2002. En: Molecular Diagnosis of Salmonid Diseases. pp. 211-233. C. Cunningham (ed) . Kluwer Academic Publishers) .
La cepa de Lactococcus garvieae empleada en esta vacuna es TW-446.1, aislada en España a partir de trucha. La cepa está depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo, referencia CECT 5800. Presenta las características típicas de la especie Lactococcus garvieae siendo cocos Gram positivos, inmóviles, anaerobios facultativos, negativos para oxidasa y catalasa, α-hemolíticos, con un rango de temperatura de crecimiento entre 10 y 42ºC, capaces de crecer con un 6, 5% de NaCl, y pH 9, 6.
Preparación
A partir de preinóculos en fase logarítmica de crecimiento se inoculan matraces de dos litros conteniendo 1 L de medio de cultivo caldo triptona de soja (TSB: Tr y ptone Soy Broth) : triptona 17 g/L; peptona de soja 3 g/L; glucosa 2, 5 g/L; fosfato bipotásico 2, 5 g/L; cloruro sódico 10 g/L; pH 7, 3 ± 0, 2.
La incubación se realiza a 25ºC durante 48 horas. Cuando el cultivo alcanza una densidad óptica de 1 (Absorbancia580) (aproximadamente 1010 células/mL) , se le añade formol a una concentración final de 0, 35% para matar las bacterias, y se mantiene durante 3 horas más en agitación, al cabo de las cuales se transfieren a 4ºC. La suspensión celular bacteriana así obtenida se denomina bacterina.
El control de esterilidad se lleva a cabo sembrando la mezcla vacunal en placas de agar triptona de soja (TSA: Tr y ptone Soy Agar) y en tubos de tioglicolato, incubando durante 72 horas a 25 y 37ºC, respectivamente.
El control de especificidad se realiza mediante aglutinación en portaobjetos, utilizando como antígeno las células enteras empleadas en la fabricación de la vacuna y un antisuero específico para la cepa obtenido en conejo.
Una vez efectuados los controles de esterilidad y especificidad, a la bacterina se le añade alginato sódico a una concentración final de 0, 5% (p/vol) . Las micropartículas de alginato conteniendo las células bacterianas se obtienen por un procedimiento de atomización utilizando aire comprimido a temperatura ambiente con un flujo de aire de 15 L/min., siendo el caudal de la solución a atomizar de 7 mL/min.
Las micropartículas así obtenidas se gelifican en 250 mL de solución agua:acetona (75:25) con un 1, 5% (p/vol) de cloruro cálcico, en agitación para evitar la aglomeración de las micropartículas, durante 30 minutos. Una vez terminado este proceso, las micropartículas se colectan por filtración empleando un filtro de acetato de celulosa.
Las micropartículas se mezclan con el pienso molido previamente, en una proporción del 10% peso/peso, hasta obtener una pasta homogénea, y de una plasticidad adecuada para someterla a un proceso de extrusión. Como líquido de humectación se usa agua destilada. El cálculo de la cantidad de micropartículas se lleva a cabo teniendo en cuenta la cantidad de comida administrada (1% del peso del pez/día) , se ajusta la cantidad de micropartículas de alginato para que cada pez reciba una dosis de vacuna de 1, 0 x 109 células/día. Esta mezcla se extrusiona, se deja secar y se corta en pellets del tamaño apropiado. El producto (pienso vacunal) debe ser conservado a 4ºC hasta su utilización.
Modo de administración
La vacuna debe administrarse por vía oral. Durante 7 días se suministra a los peces el pienso vacunal con una dosis de alimento del 1% del peso corporal del pez, en la primera comida del día. La cepa de Lactococcus garvieae empleada en esta vacuna es TW-446.1. La eficacia de la vacuna fue evaluada en trucha a escala de laboratorio. La potencia, expresada como Porcentaje de Supervivencia Relativa (RSP) ha sido superior al 48%, cuando se utilizó como inmunización primaria, manteniéndose dicha protección durante al menos 2 meses, con los mismos valores de RSP. La potencia fue del 87, 5% cuando se utilizó como vía de revacunación en peces que habían sido previamente vacunados por vía intraperitoneal (3 meses antes) , manteniéndose esta protección durante 3 meses.
El protocolo de vacunación recomendado para la trucha quedaría de la siguiente forma: a) Vacunación por vía intraperitoneal por inoculación de los peces con 0, 1-0, 2 mL/pez (dependiendo del peso del pez) de bacterina sin diluir. b) Revacunación 3 meses después por vía oral con la vacuna, siguiendo el procedimiento de administración arriba indicado.
