Procedimiento de obtención de la enzima endopoligalacturonasa mediante el cultivo de cepas microbianas recombinantes que sobreexpresan el gen EPG2 de Kluyveromyces marxianus.
Sector de la técnica
La presente invención describe la identificación y clonación en Escherichia coli del gen EPG2 de Kluyveromyces marxianus que codifica la enzima endopoligalacturonasa. Asimismo describe la sobreexpresión del gen EPG2 en levaduras con el fin de obtener una cepa que produzca la enzima endopoligalacturonasa en grandes cantidades.
Estado de la técnica
Las pectinas son polisacáridos de plantas formados por subunidades de ácido galacturónico unidas por enlaces glucosídicos α-1, 4 y pueden estar esterificadas en mayor o menor grado con grupos metilo. Las enzimas capaces de degradar las pectinas se llaman pectinasas y se pueden clasificar en dos grupos: pectin esterasas (en adelante PE) que liberan los grupos metilo de la pectina y depolimerasas que cortan los enlaces α-1, 4 e incluyen a las pectin liasas (en adelante PL) y a las poligalacturonasas (en adelante PG) . Las PG se dividen a su vez en endopoligalacturonasas (en adelante endoPG) , que cortan en el interior de la molécula de pectina y exopoligalacturonasas (en adelante exoPG) , que liberan unidades de ácido galacturónico en un extremo de la molécula (Forgarty y Kelly: 1983. Pectic enzymes. Applied Science Publishers, London pp 131-182; Rombouts y Pilnic. 1989. Pectic enzymes. Academic Press, London pp 227-282) .
Las enzimas pécticas han encontrado un gran campo de aplicación en la industria alimentaria, sobre todo en el procesado de vegetales. Las pectinas causan serios problemas en la elaboración de diferentes bebidas de frutas, especialmente durante la clarificación y filtración de los productos, debido a que saturan y colmatan los filtros que se utilizan para llevar a cabo estos procesos. Entre las aplicaciones industriales más importantes de las pectinasas están la extracción y clarificación de zumos de frutas, sobre todo zumo de manzana, mosto de uva y aceite de oliva. Por otra parte, las pectinasas también pueden utilizarse, formando mezclas con otras hidrolasas, en la formulación de piensos animales y para la degradación de residuos vegetales (Blanco y col. 1999. FEMS Microbiol. Lett. 175: 1-9) .
En la actualidad, la principal fuente de enzimas pécticas para la industria es el hongo Aspergillus niger. Los preparados comerciales obtenidos a partir de este hongo son una mezcla de las distintas enzimas pécticas (endo-, exo-PG, PL y PE) , así como de otras enzimas producidas por el microorganismo, que pueden tener efectos indeseables sobre los productos tratados. Entre los efectos no deseables es importante destacar los que se derivan de la acción de las amilasas, las arabinofuranosidasas y sobre todo de las pectin esterasas que liberan metanol al producto, compuesto altamente tóxico.
Por otra parte, se ha comprobado que las enzimas que tienen un mejor efecto sobre la depectinización, la reducción de viscosidad y la clarificación de zumos vegetales son las endoPG. Esta es la enzima que codifica el gen EPG2. En muchos casos estas enzimas por sí solas son suficientes para obtener el efecto deseado en el tratamiento del -producto. En otros casos, la depectinización completa de ciertos sustratos solo se consigue mediante la acción conjunta de varios tipos de enzimas en la proporción correcta (Ceci y Lozano. 1998. Food Chem. 61: 237-241) . Teniendo en cuenta lo expuesto, es de gran interés para la industria contar con las distintas enzimas pécticas por separado para poder utilizarlos solas (caso de las endoPG) o bien en mezclas con la proporción adecuada de cada tipo de enzima, según el sustrato sobre el que se vayan a utilizar.
La cepa obtenida mediante el procedimiento que se describe a continuación muestra la actividad endoPG más alta descrita hasta el momento en las cepas microbianas productoras de endoPG. La cepa puede crecer en medios de cultivo económicos y sintetiza la enzima de forma constitutiva, alcanzando el máximo de actividad a las 24 horas de crecimiento, antes que en cualquier otra cepa productora de esta enzima. Estos datos, unidos al hecho de que la cepa es muy estable, ya que el/los gen/es están integrados en el genoma de la misma, la convierten en una cepa apta para su explotación industrial.
Para obtener una cepa microbiana hiperproductora de la enzima endoPG, en primer lugar, el gen EPG2 se aisló a partir de la cepa de CECT 1043 de K. marxianus y se clon en Escherichia coli con el fin de secuenciarlo y facilitar su manipulación. A continuación se postuló la posibilidad de sobreexpresar dicho gen en un sistema heterólogo basado en levaduras hospedadoras (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe) , que han dado buenos resultados para la expresión de diferentes hidrolasas ya que pueden producir y secretar de forma eficiente grandes cantidades de proteínas recombinantes (Buckholz y Gleeson. 1991. Biotechnology 9: 1067-1072; Domínguez et al. 1998. Int. Microbiol. 1:131-142) . Con esta finalidad el gen EPG2 se moviliza a un vector de expresión de levaduras que es utilizado para transformar a éstas y convertirlas en cepas que producen la enzima endoPG en gran cantidad.
En el siguiente ejemplo se detallan las investigaciones que conducen a la obtención de cepas hiperproductoras de endoPG.
Explicación de la invención
1. Clonación del gen EPG2 de Kluyveromyces marxianus en Escherichia coli
El gen EPG2 de K marxianus fue amplificado mediante PCR utilizando como molde el ADN de la cepa CECT 1043 y los oligonucleótidos KM1 (Secuencia 1) y KMIREV (Secuencia 2) .
La extracción del ADN genómico de la cepa CECT 1043 se realizó según un protocolo convencional (Johnston. 1994. Molecular Genetics of Yeast. Oxford University Press) . El programa utilizado para amplificación ha sido el siguiente:
El producto amplificado se visualizó mediante electroforesis, se recuperó a partir del gel de agarosa (Sambrook y col. 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laborator y Press) y se ligó al vector de clonación de E. coli pCR®-Blunt-II-TOPO (Invitrogen) utilizando el kit de clonación TOPO Cloning Kit (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La mezcla de ligación se utilizó para transformar la cepa de E. coli TOP10 (Sambrook y col. 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laborator y Press) y los transformantes recombinantes se seleccionaron en placas de LB (triptona 1%, extracto de levadura 0.5% y NaCl 0.5%) suplementado con canarnicina (50 μg/mL) . En una de estas colonias se comprobó la presencia del plásmido recombinante mediante PCR utilizando los dos oligonucleótidos y el programa descritos anteriormente. El ADN plasmídico de esta colonia se amplificó y se purificó utilizando el kit de extracción de plásmidos de Quiagen. A este plásmido se le dio el nombre de pSIVI30.
2. Secuenciación del fragmento de ADN clonado
El fragmento de ADN clonado en el apartado 1 en el vector pCR®-Blunt-II-TOPO fue secuenciado utilizando el método de Sanger y col., 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467. Se obtuvo una secuencia de 1086 pares de bases (Secuencia 3) que fue analizada usando las bases de datos del servidor de acceso público BLAST del Centro Nacional de Biotecnología (NCBI, USA) . La secuencia muestra una alta homología con el gen 2EPG1 de K. marxianus que tiene 1083 pares de bases y también codifica una endoPG. La secuencia constituye un marco de lectura abierta (ORF) de 362 aminoácidos, uno más que la proteína codificada por el gen EPG1. El polipéptido deducido de la secuencia de bases clonada se muestra en el código de aminoácidos de tres letras en la Secuencia 4.
Puesto que el gen clonado tiene un aminoácido más que el previamente descrito EPG1 (Scarcez, T. 1995. Sometido a las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ) , puede considerarse un nuevo alelo de EPG1, al que se le ha dado el nombre de EPG2. El aminoácido valina (posición 122) presente en Epg2p y ausente en Epg1p es el que diferencia los dos alelos. El análisis de la secuencia de aminoácidos muestra además que los primeros 25 aminoácidos de Epg2p constituyen una secuencia señal, el centro activo está localizado en la región conservada entre los aminoácidos 218-230 y presenta dos sitios de glicosilación en los aminoácidos 188 y 292. En la Figura 1 se muestra un alineamiento de las proteínas Epg1p y Epg2p y se señalan las diferencias entre ambas.
La endoPG codificada por el gen EPG2 muestra un 94.7% de identidad con la enzima codificada con el gen EPG1 considerando toda la secuencia, un 59% con la endoPG de Saccharomyces cerevisiae y un 52% con la de Aspergillus niger.
3. Clonación y expresión del gen EPG2 en la levadura Pichia pastoris
Para la clonación y expresión del gen EPG2 en P. pastoris se seleccionó el vector de expresión pGAPZαA (Invitrogen) . Este plásmido permite la clonación del gen que se desea expresar, en fase con el péptido señal del factor α de Saccharomyces cerevisiae, lo que asegura en muchos casos una excelente secreción al exterior de la proteína producida por la levadura. Los genes clonados en este plásmido se expresan bajo el control del promotor GAP lo que permite la síntesis constitutiva de la proteína. Por otra parte, el plásmido no se replica autónomamente y sólo puede transformar a las células de la levadura P. pastoris mediante integración en el genoma de la misma, por recombinación homóloga. Esta integración puede producirse en varias copias. Como consecuencia se pueden obtener cepas que sintetizan proteínas de manera muy estable (ya que el gen integrado en el genoma no se pierde) y en gran cantidad (puesto que el gen puede integrarse en varias copias por célula) .
El primer paso para la clonación del gen EPG2 en el vector pGAPZαA consistió en eliminar los primeros 25 aminoácidos de la proteína que constituyen el péptido señal nativo, con el fin de poder clonar la parte del gen que codifica la proteína madura en fase con la secuencia señal del factor α de S. cerevisiae que va incluida en el plásmido.
Para ello, el gen EPG2 fue amplificado de nuevo mediante PCR utilizando como molde el ADN del plásmido pSIVI30 que lleva clonado el gen EPG2 y los oligonucleótidos KM2 (Secuencia 2) y KM1REV (Secuencia 5) . El programa utilizado para la amplificación fue el mismo que se describió en el apartado 1. El fragmento de ADN amplificado mediante estos oligonucleótidos carece del trozo que corresponde al péptido señal nativo de la enzima y posee las dianas para las enzimas de restricción EcoRI (en el extremo 5') y XbaI (en el extremo 3') . Este fragmento se visualizó mediante electroforesis, se recuperó del gel de agarosa y se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y XbaI (Sambrook y col. 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laborator y Press) .
Por otra parte el vector pGAPZαA fue también amplificado y purificado utilizando el kit de purificación de plásmidos de Quiagen. El vector purificado fue a continuación digerido con las endonucleasas de restricción EcoRI y XbaI y ligado al gen EPG2 (Sambrook y col. 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laborator y Press) . Con la mezcla de ligación se transformó la cepa de E. coli TOP10 (Sambrook y col. 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laborator y Press) , y los transformantes recombinantes se seleccionaron en placas con medio LB (triptona 1%, extracto de levadura 0.5% y NaCl 0.25%) suplementado con zeocina (25 μg/mL) , X-GAL (0.8 mg) e IPTG (5 μL de solución 0.8M) . A partir de una de estas colonias recombinantes de E. coli se amplificó y purificó el ADN plasmídico, se denominó al nuevo plásmido pSIVI32, se digirió con la enzima de restricción AvrII y se utilizó para transformar las células de la levadura P. pastoris.
La transformación de la levadura silvestre P. pastoris X33 (Invitrogen) se llevó a cabo mediante electroporación siguiendo el protocolo descrito por Scorer y col. 1994, Bio/Technology 12: 181-184. Los transformantes se seleccionaron en medio YEPD (extracto de levadura 1%, peptona 2%, glucosa 2%) suplementado con zeocina (100 μg/mL) ya que el plásmido pGAPZαA confiere resistencia a este antibiótico.
A continuación se seleccionaron al azar 4 colonias resistentes a zeocina y mediante PCR, usando los oligonucleótidos KM2 (Secuencia 2) y KMIREV (Secuencia 5) y el programa de amplificación ya descrito en el apartado 1, se comprobó que. portaban en su genoma el gen EPG2. Estas cuatro cepas de P. pastoris denominadas SIVI30, SIVI31, SIVI32 y SIVI33 fueron utilizadas para probar su capacidad para producir la enzima endoPG. En la Figura 2 se muestra el proceso de obtención de cepas hiperproductoras de la enzima endopoligalacturonasa.
4. Producción de la enzima endoPG por parte de las cepas SIVI30, SIVI31, SIVI32 y SIVI33 de Pichia pastoris
Las cuatro cepas de P. pastoris seleccionadas que expresan el gen EPG2, se sembraron en matraces de 1 L que contenían 100 mL de medio YEPD (extracto de levadura 1%, peptona 2%, glucosa 2%) y se incubaron a 30ºC y 200 rpm durante 72 horas. A lo largo de este tiempo se fueron tomando muestras cada 6 horas en las que se determinó la actividad enzimática. La actividad endoPG se valoró en los sobrenadantes de los medios de cultivo utilizando el método de Somogyi (Somogyi. 1952. J. Biol. Chem. 159: 19-23) modificado por Nelson (Nelson. 1957. Methods in Enzymology 3: 8586) . Los sobrenadantes se centrifugaron, se filtraron a través de membranas de 0.22 μm y se dializaron en tampón acético-acetato 50 mM pH 5 y se utilizaron para determinar la actividad enzimática. Las reacciones enzimáticas contenían 0.5 mL de enzima (sobrenadante centrifugado y dializado) y 0.5 mL de sustrato (ácido poligalacturónico al 0.5% en tampón acético-acetato 50 mM, pH 5) . Se definió la unidad enzimática como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 μmol de ácido galacturónico, o su equivalente en poder reductor, en 1 min a 37ºC.
La máxima actividad enzimática se alcanzó en todas las cepas al cabo de 24 h, sin embargo, la cantidad de enzima producida variaba dependiendo de la cepa probada. Este dato es consecuente con el hecho de que el número de copias del gen integradas en el genoma de cada clon puede variar. En la Tabla 1 se muestran los datos de la actividad enzimática máxima encontrados para cada una de las cepas probadas: 3.6 U/mL para la cepa SIVI30, 3.7 U/mL para la cepa SIVI31, 5.3 U/mL para la cepa SIVI32 y 8 U/mL para la cepa SIVI33 (CECT 11779) .
TABLA 1 Actividad enzimática de cuatro clones de la cepa X33 transformada con el plásmido pSIVI32 | Cepas | Actividad enzimática (U/mL) * |
| Cepa X33 no transformada | 0 |
| SIVI30 | 3.6 |
| SIVI31 | 3.7 |
| SIVI32 | 5.3 |
| SIVI33 | 8 |
De las cuatro cepas se seleccionó, para su explotación industrial, la cepa SIVI33 por ser la que produce la mayor cantidad de enzima endoPG y se depositó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjasot, 46100 Burjasot (Valencia) con la referencia CECT 11779. La producción de la enzima en esta cepa es una característica muy estable ya que el/los gen/es que la sintetizan están integrados en el genoma de la levadura y se expresan sin necesidad de utilizar medios definidos o añadir antibióticos para mantener la presión selectiva. En consecuencia, la cepa puede crecer sin ningún problema en los medios económicos que se utilizan para la producción industrial.
Descripción de las figuras
Figura 1: Alineamiento de las proteínas codificadas por los genes EPG1 y EPG2 de Kluyveromyces marxianus. Se señalan en negrita los aminoácidos que difieren entre las dos proteínas. El aminoácido que diferencia los dos alelos está situado en la posición 122.
Figura 2: Esquema del proceso de obtención de la cepa CECT 11779 de Pichia pastoris que produce la enzima endoPG, mediante la expresión del plásmido pSIVI32 consistente en el gen EPG2 de Kluyveromyces marxianus clonado en el vector pGAPZαA de Pichia pastoris.
