• Los cultivos de este microorganismo no desarrollan una viscosidad elevada, con lo cual la energía que se necesita para agitarlos y airearlos no es tan alta como la que requieren otras bacterias productoras de exopolímeros. Estudiando las bacterias de diversos hábitats hipersalinos del Norte de Marruecos, se encontraron cuatro cepas de Halomonas (S-31T, S-30, S-36, S-7) que producían colonias mucosas. Para poder clasificarlas se realizó un estudio fenotípico, comprobándose que eran diferentes a las especies descritas hasta entonces (Bouchotroch y col., 1999. Syst. Appl. Microbiol. 22: 412-419) . El análisis genotípico de estos organismos confirmó lo anterior y se describió una nueva especie, Halomonas maura, depositándose en la CECT la bacteria S-31T como cepa tipo (CECT 5298) (Bouchotroch y col. 2001 Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 1625-1632) . Las 4 cepas producían polisacáridos que daban lugar a preparaciones acuosas de viscosidad considerable (Bouchotroch y col., 2000. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 24: 374-378) .
La cepa S-30 de Halomonas maura era la que producía el polisacárido más interesante. Con el fin de mejorar la producción del polisacárido y las propiedades del mismo, se manipuló genéticamente dicho microorganismo. Para ello se realizaron numerosas experiencias de mutagénesis insercional con el transposón mini-Tn5. Entre las más de 1500 transconjugantes obtenidas, se seleccionó la mutante super-productora objeto de la solicitud de la patente. El procedimiento seguido fue el siguiente:
Se realizó una conjugación biparenteral utilizando como organismo receptor un mutante espontáneo a la rifampicina de la cepa S30 y como organismo donador Escherichia coli S17-λpir portador del transposón mini-Tn5 (que codifica resistencia a la kanamicina) . Ambos microorganismos se mezclaron en una proporción 2:1 y se depositaron en placas con medio conteniendo rifampicina y kanamicina (las colonias que crecen en este medio son las cepas de H. maura S-30 que tienen el transposón insertado en su genoma, o transconjugantes) . La frecuencia de aparición de los transconjugantes fue de 8 x 10- 7. Entre los aproximadamente 1500 transconjugantes obtenidos en numerosas experiencias, se seleccionó el TK26 por producir colonias de mucosidad superior a la de la cepa salvaje.
La mutante TK26 se ha caracterizado genéticamente. Lleva insertado el transposón mini Tn5:Km2 en el gen de la subunidad E1β del complejo α-ceto ácido deshidrogenasa de cadena ramificada (BCDH) . La secuencia génica mutada por la inserción del transposón es la que figura en la Lista de secuencias adjunta.
En el laboratorio la cepa TK26 se mantiene fácilmente en el medio de cultivo siguiente:
Proteosa-peptona (Difco) \dotl 5 g
Extracto de levadura (Difco) \dotl 3 g
Extracto de Malta (Panreac) \dotl 3 g
Glucosa (Panreac) \dotl 10 g
NaCl \dotl 17'1 g
MgCl2.6H2O \dotl 3 g
SO4.7H2O \dotl 4'3 g
CaCl2.2H2O \dotl 0'1 g
KCl \dotl 0'4 g
NaHCO3 \dotl 0.02 g
NaBr \dotl 0'05 g
Agua destilada \dotl c.s.p. 1000 ml
Para preparar un medio sólido hay que añadir un 2% (p/v) de Agar (Difco) .
Las características taxonómicas de la cepa salvaje a partir de la cual se obtuvo la cepa TK26 son las que se encuentran detalladas en el trabajo de Bouchotroch y col. 2001. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 1625-1632.
Halomonas maura TK26 como productora de maurano 26
A partir del medio de cultivo en el que creció Halomonas maura TK26 durante 3 días a 32°C, se obtuvo el polisacárido por el siguiente procedimiento:
Se centrifuga el cultivo a 15.000 rpm durante 60 minutos, separándose el sobrenadante del sedimento celular. Se mezcla el sobrenadante con dos volúmenes de alcohol frío (a -20°C) , produciéndose la precipitación del exopolisacárido. Tras mantener una noche a -4°C se recoge el polisacárido por centrifugación a 3000 rpm durante 10 minutos. El sedimento obtenido se liofiliza o se deseca hasta peso constante. En las condiciones anteriormente señaladas la cepa TK26 produce aproximadamente 5 g de exopolisacárido por litro de medio.
Características del maurano 26
El polímero origina preparaciones acuosas de una viscosidad semejante a la del xantano a concentración del 0.5% (p/v) . Dichas preparaciones son pseudoplásticas (la viscosidad disminuye con el esfuerzo de cizalla) y tixotrópicas (se recupera totalmente la viscosidad inicial cuando cesa el esfuerzo de cizalla) . Las soluciones y su viscosidad permanecen estables a diferentes pH. Además resisten la congelación y descongelación y son compatibles con una elevada concentración de sales y sacarosa. La viscosidad de las soluciones del maurano decrece por encima de los 60ºC; posteriormente se recupera en un porcentaje elevado respecto a su valor inicial. Este fenómeno favorece enormemente la manipulación de los productos que requieren procesos industriales de mezclado, bombeo, etc.
Para determinar las propiedades reológicas del polisacárido se someten a distintos esfuerzos de cizalla en un reómetro CSR10 Bohlin con temperatura controlada. Para una mejor comprensión de ello se presenta la figura 1, en la cual puede verse el comportamiento del polisacárido, frente a distintos parámetros: temperatura, pH y concentración de sales.
Explicación de la figura 1. La figura 1 representa la viscosidad a un shear stress de 2 Pa de soluciones del polímero maurano 26 al 0, 5% (p/v) en presencia de distintas sales (KCl, MgCl2, CaCl2 (5% p/v) y NaCl (7, 5% p/v) ) , pH (3 y 9) y temperaturas (25 y 55ºC) .
El maurano 26 es un excelente estabilizador de emulsiones oleoacuosas (O/A) . Este fenómeno está relacionado con su poder viscosizante ya que no tiene actividad tensioactiva. Las fases oleosas emulsionadas pueden ser sustratos de la industria alimentaria (aceite de oliva, aceite de girasol, etc) o de otras áreas (petróleo o derivados, etc) . Para ello basta disolver el EPS en la fase acuosa a una concentración del 0.5%. Estas emulsiones son estables en el tiempo y están formadas por gotículas de la fase interna de pequeño y uniforme tamaño. En la tabla que se incluye a continuación se puede comparar la actividad emulgente del maurano (expresada como porcentaje de la mezcla emulsionada) con la de otros agentes tensioactivos de síntesis, como el polisorbato 60 de amplio uso en la industria alimentaria.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Actividad emulgente del maurano y otros agentes tensioactivos frente a diversas fases oleosas 
Por otra parte, el polímero de Halomonas maura es capaz de absorber elevadas cantidades de metales pesados, destacando el Pb (46.4 mg/g EPS) .
