Método para identificación de los alelos M, S y Z de α-1-antitripsina con enzimas de restricción.
Método para identificación de los alelos M, S y Z de alfa-1 -antitripsina con enzimas de restricción. El método sirve para la identificación de genotipos de alfa-1-antitripsina y aporta como novedad la utilización de enzimas de restricción.
La alfa-1-antitripsina (A1 AT) es el inhibidor de las serin proteasas que se encuentra en mayor concentración en el plasma. Es una glucoproteína de 52 kDa con 394 residuos aminoacídicos, sintetizada en el hígado y considerada como una proteína protectora (Long GL, Chandra T, Woo SL, Davie EW, Kurachi K. (1984) . Complete sequence of the cDNA for human a1-antitr y psin and the gene for the S variant
. Biochemistr y ;23:4828-37) . Desempeña una función biológica de gran importancia ya que actúa a nivel sanguíneo y tisular protegiendo a los tejidos de ser dañados por la acción proteolítica de serin proteasas liberadas desde los glóbulos blancos (Gadek JE and Cristal RG, (1982) : α-1-Antitripsina deficiency
. Ed. McGraw-Hill, Inc. New York pp 1450-1467) .
El alelo más común en la población europea es el identificado como M
, con una frecuencia alélica de 0.95. El 90% de la población blanca europea posee el genotipo MM y muestran el fenotipo normal, no deficiente. Sin embargo, se conocen dos alelos mutantes, denominados S (accesion nºK02212) y Z (accesion nºJ021619) , con frecuencias alélicas que varian de unas áreas geográficas a otras. Así, mientras que el alelo Z presenta una prevalencia mayor en el noroeste de Europa (>15 por 1000) , la prevalencia del alelo S es más alta en la Península Ibérica (supera el 90 por 1000) (Miravitlles M, Vidal R, Barros-Tizon JC, Bustamante A, Espana PP, Casas F, Martinez MT, Escudero C, Jardi R. (1998) , Usefulness of a national registr y of alpha-1-antitr y psin deficiency. The Spanish experience.
Respir Med. 92 (10) :1181-7) . Las combinaciones de estos dos alelos, SZ y ZZ, dan lugar a los fenotipos deficientes en la actividad de la alfa-1 -antitripsina (Al AT) que suelen presentar hepatitis y cirrosis, o bien un enfisema pulmonar, porque la alfa-1-antitripsina no está presente en concentración suficiente para inhibir la actividad de las proteasas, o bien porque la alfa-1-antitripsina se sintetiza con una alteración molecular que limitan su actividad normal (Gelehrter & Collins, (1990) , Principles of Medical Genetics
Ed. Williams & Wilkins) .
Los alelos deficientes, S y Z, de la alfa-1-antitripsina son el resultado de sendas mutaciónes puntuales en la región codificante del gen. Así, el alelo S surge como resultado de una transversión en el exón III (SEQ. ID. NO: 1) , en la que el codón gaa
en el alelo normal -M- cambia al codón gta
en el alelo S, lo que se traduce en la aparición de un aminoácido valina en la posición 264, en la proteína S, mientras que para la proteína M presenta un resto glutámato (Long y col, 1984, op. cit.) . Por otra parte el alelo Z surge por una transición en el exón V (SEQ. ID. NO: 4) , en la que el codón gaa
cambia para dar lugar al codón aaa
, lo que supone la sustitución del ácido glutámico 342 de la proteína M por una lisina en la proteína Z (Long, y col., 1984 op. cit.) .
La propuesta clásica para la identificación fenotípica de los productos génicos S y Z es la combinación de isoelectroenfoque y estudios familiares. Sin embargo, presenta las desventajas de la dificultad de establecer los patrones hereditarios, así como lo engorroso y tedioso de la técnica analítica, por la elevada variabilidad de patrones electroforéticos.
Kidd VJ; Wallace RB; Itakura K, Woo SL (1983) : alpha 1-antitr y psin deficiency detection by direct analysis of the mutation in the gene. Nature 304:230-234; y posteriormente Nukiwa T, Brantly M, Garver R, Paul L, Courtney M, LeCocq JP, Cr y stal RG (1986) : Evaluation of at risk
alpha 1-antitr y psin genotype SZ with synthetic oligonucleotide gene probes The Journal of Clinical Investigations, 77:528-537, desarrollaron un primer procedimiento de genotipado de los pacientes deficientes en A1AT, utilizando sondas oligonucleotidicas, que bajo condiciones estrictas de hibridación, lograban una identificación de los alelos M, S y Z.
Más recientemente, se han desarrollado diversos procedimientos de asignación genotípica basados en la reacción en cadena de la polimerasa, PCR, que frente al procedimiento anterior ofrece la ventaja de la mayor rapidez en la obtención del resultado, mejor practicabilidad en el laboratorio y la posibilidad del análisis con una pequeña fracción de muestra biológica. De entre todos ellos, los de mayor interés son los que utilizan la detección e identificación del producto amplificado en tiempo real utilizando sondas fluorescentes y determinando sus curvas de fusión (Von Ahsen N.; Oellerich M, ; Schütz E (2000) : Use of Two Reporter Dyes without Interference in a Single-Tube Rapid-Cycle PCR: a1-Antitr y psin Genotyping by Multiplex Real-Time Fluorescence PCR with the LightCycler, Clinical Chemistr y 46 (2) :156-161) . Sin embargo, y pese a las ventajas del procedimiento (rapidez, detección en tubo cerrado, reducción del riesgo de contaminación cruzada, etc) presenta el inconveniente de su elevado coste, tanto en reactivos como en instrumento analítico, lo que limita su introducción y expansión en los laboratorios clínicos.
En esta invención proponemos un novedoso procedimiento para la asignación genotípica de los estados deficientes de alfa-1-antitripsina, basado en la detección de las mutaciones que dan lugar a los alelos S y Z mediante una digestión enzimática con enzimas de restricción de los fragmentos amplificados por PCR de los exones III y V del gen de la A1AT.
La identificación del alelo S se realiza en una incubación post-PCR con la enzima de restricción Sex AI (Figura 1) (SEQ. ID. NO: 7) y el correspondiente corte del producto de PCR en dos fragmentos de menor tamaño de 99 y 263 pares de bases. Para la diferenciación del alelo deficiente Z se utiliza la enzima Ava I, cuya secuencia de restricción (SEQ. ID. NO: 8) es parcialmente soportada por uno de los cebadores de amplificación (SEQ. ID. NO: 5) y se completa cuando se amplifica el alelo no deficiente M. De tal modo que en presencia del alelo Z no se completa la secuencia de restricción y el producto de PCR no resulta digerido (Figura 2) .
La visualización de los diferentes fragmentos se realiza por un fraccionamiento electroforético sobre geles submarinos de agarosa al 2% y se tiñe con bromuro de etidium 0.5 μg/mL.
Con este procedimiento de identificación de los alelos de alfa-1-antitripsina se reducen los errores de asignación que tienen lugar por el procedimiento de isoelectroenfoque, a la vez que mejora su practicabilidad. Frente a los procedimientos de amplificación en tiempo real requiere una menor inversión económica para su puesta en marcha y el coste por determinación también se reduce sensiblemente.
La identificación de los alelos M, S, o Z, con este procedimiento es susceptible de adaptación a termocicladores en tiempo real y determinado la temperatura de fusión (Tm) de los productos resultantes tras la digestión.
Descripción de las figuras
La Figura 1: esquema que representa el lugar de hibridación de dos cebadores AT3for (SEQ. ID. NO: 2) y AT3rev (SEQ. ID. NO: 3) en el exón III del gen de la alfa-1-antitripsina (SEQ. ID. NO: 1) , así como el tamaño relativo del producto de la amplificación y de los fragmentos que resultan de la digestión con la enzima Sex AI (SEQ. ID. NO: 7) .
La Figura 2: esquema que representa el lugar de hibridación de otros dos cebadores AT5for (SEQ. ID. NO: 5) y AT5rev (SEQ. ID. NO: 6) en el exón V del gen de la alfa-1-antitripsina (SEQ. ID. NO: 4) , así como el tamaño relativo del producto de la amplificación y de los fragmentos que resultan de la digestión con la enzima Ava I (SEQ. ID. NO: 8) .
La Figura 3: Distribución de bandas de las mezclas de reacción -S y -Z tratadas con las enzimas de restricción Sex AI (SEQ. ID. NO: 7) y Ava I (SEQ. ID. NO: 8) , respectivamente, y que permite la asignación genotípica del paciente, tras la separación de los productos de digestión en un gel de agarosa al 2%.
Modo de realización
El procedimiento de diagnóstico supone cuatro etapas: A. obtención del DNA genómico a partir de células nucleadas del paciente; B. amplificación por reacción en cadena de la polimerasa; C. digestión con enzimas de restricción; D. visualización e identificación del alelo presente.
Ejemplo I
A. Obtención del DNA genómico de sangre total fresca
1. 1 mL de sangre venosa anticoagulada con EDTA. 2. Adicionar 1 mL de Ficoll Hypaque (Ammershan-Pharmacia) . 3. Centrifugar a 1000 g durante 5 min. 4. Separar el sobrenadente para tubo limpio y volver a centrifugar como en 3. 5. El sedimento de células se resuspende en 150 μL de tampón TBS (Tris HCl 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.5) . 6. Se adiciona 150 μL de tampón de lisis (Tris HC1 400 mM, EDTA 100 mM, SDS 1% pH 8.0) y se agita uno o dos minutos. 7. Adicionar 25 μL de una disolución de proteinasa K (Boehringer Mannheim (10 mg/mL de agua) e incubar a 1 hora a 56ºC. 8. Transferir 300 μL de la digestión de la etapa 7 a un tubo de vacío de 5 mL con gel separador (tipo Vacutainer o Venojet) . 9. Incorporar 1 mL de una mezcla fenol:cloroformo (1:1) (Sigma) y agitar repetidas veces hasta conseguir una emulsión. Centrifugar a 1000 g 2 min. 10. Repetir el paso 9. 11. Incorporar 1 mL de cloroformo (Sigma) , emulsionar y centrifugar como en 9. 12. Transferir 300 μL de la fase superior acuosa a un tubo limpio de 1.5 mL de capacidad. 13. Adicionar 30 μL de acetato amónico 3 M y 750 μL de etanol absoluto frío (-20ºC) . mezclar varias veces para lograr la precipitación del DNA. 14. Recoger el DNA con espátula estéril o por centrifugación 2 min a 5000 g y lavarlo sin resuspender en etanol frío al 70%. Centrifugar y eliminar el etanol desecando 10 min en concentrador de vacío (tipo Speed vac) . 15. Resuspender el DNA en 50-100 μL de agua estéril. Cuantificar a 260 nm y ajustar la concentración a 100 ng/μL. B. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa
1. Preparar las mezclas de reacción en frío. En sendos tubos de 200 μL para termociclador, dispensar los componentes y volúmenes descritos a continuación para ensamblar una reacciones de 10 μL de volumen final: | | Mezcla-S | Mezcla-Z |
| a. Agua desionizada estéril | 3.2 μL | 2.2 μL |
| b. Tampón de amplificación 10 X | 1.0 μL | 1.0 μL |
| c. Cloruro magnésico 25 mM | 0.6 μL | 0.6 μL |
| d. Mezcla de dNTP 12 mM | 0.2 μL | 0.2 μL |
| e. Dimetilsulfóxido | - - - - | 1.0 μL |
| f. DNA genómico | 2.0 μL | 2.0 μL |
| g. Taq DNA polimerasa 0.5 UI/μL | 1.0 μL | 1.0 μL |
2. Colocar en el termociclador y calentar a 75ºC, 1 min. 3. Adicionar las mezclas de cebadores 2.0 μL* 2.0 μL** \text{*} En la Mezcla-S se incorpora 5 pmoles/2 μl de los cebadores SEQ. ID. NO: 2 y SEQ. ID. NO: 3. \text{**} En la Mezcla-Z, se incorporan 5 pmoles/2 μl del cebador SEQ. ID. NO: 5 y 2.5 pmoles/2μL del cebador SEQ. ID. NO: 6. 4. Programar los siguientes ciclos en un termociclador: | a. Ciclo 1 (94ºC, 1 min) una vez; |
| b. Ciclo 2 (94ºC, 10 s; 53ºC, 2 s; 72ºC 10 s) ; repetir 32 veces; |
| c. Ciclo 3 (72ºC 1 min) ; realizar una vez. |
C. Digestión con enzimas de restricción
1. Separar 5 μL de la amplificación de la mezcla-S y se le adicionan 5 μL de la disolución de 1 UI de la enzima Sex AI (SEQ. ID. NO: 7) en tampón de trabajo 2X (Tris HC1 20 mM, NaCl 200 mM, MgCl2 10 mM, 2-mercaptoetanol 2 mM, pH 8.0) . Incubar 1 hora a 37ºC. 2. Separar 5 μL de la amplificación de la mezcla-Z y se le adicionan 5 μL de la disolución de 1 UI de la enzima Ava I (SEQ. ID. NO: 8) en tampón de trabajo 2X (Tris HC1 20 mM, NaCl 200 mM, MgCl2 10 mM, 2-mercaptoetanol 2 mM, pH 8.0) . Incubar 1 hora a 37ºC. D. Visualización e identificación de los alelos presentes en la muestra
1. Preparar un gel de agarosa al 2% en tampón TBE: a. Pesar 1 g de agarosa (MS-8, Pronadisa) . b. Añadir 50 ml de tampón TBE 0.5X (Tris borato 45 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0) . c. Calentar a 90ºC hasta obtener una disolución transparente. Dejar enfriar lentamente hasta 60ºC. d. Verter en un molde horizontal de 5X8 cm hasta conseguir un espesor de 0.5 cm de gel. Colocar un peine adecuado de 3X1 mm cada diente y a una distancia de 1 mm del fondo del gel. Dejar enfriar 30 min. e. Sumergir el gel en posición horizontal en una cubeta de electroforesis con tampón TBE 0.5X. 2. Mezclar 10 μL, de cada reacción de digestión, con 2 μL de tampón de carga 6X (tampón TBE 6X, glicerol 60%, azul de bromofenol 0.1%) . Aplicar toda la mezcla a un pocillo del gel. 3. Cargar 5μL del marcador de tamaños EZload 100 bp molecular ruler (BioRad) . 4. Conectar los electrodos a una fuente y aplicar 6v/cm durante 20 min. 5. Sumergir el gel 10 min., en 100 mL de una disolución de bromuro de etidium 0.5 μg/mL. 6. Visualizar por transiluminación con luz ultravioleta y digitalizar la imagen. a. Verificar los tamaños de los productos digeridos o no. b. Realizar la asignación genotípica atendiendo a la distribución de bandas que se recoge en la figura 3. Ejemplo II
A. Obtención del DNA genómico a partir de células del epitelio bucal
1. Obtener células del epitelio bucal con un hisopo de algodón y resuspender las células en 800 μL de suero fisiológico (Cloruro sódico 0.9%) estéril. 2. Centrifugar a 1000 g durante 1 min. Eliminar todo el sobrenadante. 3. Resuspender el sedimento de células en 125 μL de tampón NaOH (10 mM) . 4. Calentar la muestra a 95ºC durante 5 min con agitación ocasional. 5. Dejar enfriar y centrifugar a 10 000 g durante 5 min. 6. Separar el sobrenadante a un tubo limpio. Utilizar 2μL de la disolución de DNA para realizar la amplificación. B. Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa
1. Preparar las mezclas de reacción de 10 μL finales en sendos capilares para termociclador con detección en tiempo real: | | Mezcla-S | Mezcla-Z |
| | Capilar-1 | Capilar-2 |
| a. Agua desionizada estéril | 5.0 μL | 4.0 μL |
| b. FastStart Sybr Green* (Roche) | 1.0 μL | 1.0 μL |
\text{*} Esta mezcla comercial integra todos los componentes necesarios para realizar una reacción de PCR estándar: dNTP, Taq DNA polimerasa, cloruro magnésico, tampón y reactivo de tinción Sybr Green. | c. Dimetilsulfóxido | - - - - | 1.0 μL |
| d. DNA genómico | 2.0 μL | 2.0 μL |
| e. Adicionar las mezclas de cebadores | 2.0 μL\text{*} | 2.0μL\text{**} |
\text{*} En la Mezcla-S se incorporan 5 pmoles/2 μl de los cebadores SEQ. ID. NO: 2 y SEQ. ID. NO: 3. \text{**} En la Mezcla-Z, se incorporan 5 pmoles/2 μl del cebador SEQ. ID. NO: 5 y 2.5 pmoles/24 del cebador SEQ. ID. NO: 6. 2. Colocar en el termociclador y correr el programa siguiente: | a. Ciclo 1 (95ºC, 10 min) una vez; |
| b. Ciclo 2 (95ºC, 2 s; 53ºC, 2 s; 72ºC 15 s) ; repetir 35-40 veces. |
3. Realizar un curva de fusión entre 60ºC y 90ºC para caracterizar el producto formado en la amplificación, registrando la fluorescencia a 595 nm. C. Digestión con enzimas de restricción
1. Adicionar al capilar de la Mezcla-S 10 μL de la disolución de enzima Sex AI (SEQ. ID. NO: 6) conteniendo 1 UI enzima y el tampón de trabajo 2X (Tris HC1 20 mM, NaCl 200 mM, MgCl2 10 mM, 2-mercaptoetanol 2 mM, pH 8.0) . 2. Adicionar al capilar de la Mezcla-Z, 10 μL de la disolución de la enzima Ava I (SEQ. ID. NO: 8) 1 UI enzima y el tampón de trabajo 2X (Tris HCl 20 mM, NaCl 200 mM, MgC12 10 mM, 2-mercaptoetanol 2 mM, pH 8.0) . 3. Incubar 1 hora a 37ºC. 4. Realizar una nueva curva de fusión entre 40ºC y 90ºC para caracterizar los productos de la digestión. D. Interpretación
1. La digestión completa del producto en la Mezcla-S por la enzima Sex AI identifica la presencia del alelo S en la reacción, mientras que la no digestión se interpreta con la presencia de alelo M o Z en la muestra del paciente. Si la digestión es parcial se interpreta como heterocigoto con uno de sus alelos S y se completa la asignación con la interpretación de la Mezcla-Z. 2. La digestión completa del producto en la Mezcla-Z por la enzima Ava I identifica la presencia del alelo M (o S) en la reacción, mientras que la no digestión supone la presencia de alelo Z. Si la digestión es parcial se interpreta como heterocigoto Z y se completa el genotipo con la interpretación de lo que sucede en la digestión de la Mezcla-S.
