c) comparar la secuencia obtenida en la etapa b) con secuencias de nucleótidos identificativas de organismos. Antes de poner en contacto ADN del organismo a ensayar con la mezcla de reacción para la amplificación enzimática de ADN, se procede a extraer la totalidad o parte del ADN de dicho organismo. La extracción de ADN del organismo en cuestión se puede realizar mediante métodos convencionales, incluyendo aquéllos que no precisan una purificación del ADN extraído. El organismo a ensayar puede proceder de cualquier fuente, por ejemplo de un cultivo puro, de una fuente clínica, de una fuente medioambiental (agua, alimentos, plantas, animales, etc.) .
La mezcla de reacción para la amplificación enzimática de ADN contiene los reactivos necesarios para la realización de dicha amplificación. En una realización particular, la amplificación enzimática de un fragmento de ADN se realiza mediante una reacción PCR, en cuyo caso, la mezcla de reacción para la amplificación enzimática de ADN comprende agua ultrapura, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) , un tampón adecuado para la reacción de amplificación enzimática, una ADN polimerasa termoestable, una sal magnésica, etc., junto con un par de iniciadores constituido por los iniciadores U1F (SEQ. D. NO: 1) y U1R (SEQ. ID. NO: 2) que amplifican una región de ADNr amplificable presente en procariotas y eucariotas (UARR) .
La amplificación enzimática de los fragmentos de ADN se puede realizar mediante el empleo de técnicas convencionales, por ejemplo, PCR, bajo condiciones en las que fragmentos de ADN amplificables presentes en el ADN del organismo a ensayar son amplificados.
Los productos de la amplificación enzimática se pueden separar y analizar por cualquier método convencional. En una realización particular, los productos de la amplificación enzimática se separan y secuencian utilizando técnicas convencionales, por ejemplo, en un secuenciador automático utilizando iniciadores o sondas de oligonucleótidos. En una realización particular, dichos productos de amplificación se secuencian utilizando los iniciadores U1F (SEQ. ID. NO: 1) y U1R (SEQ. ID. NO: 2) . El empleo de los mismos iniciadores tanto para la amplificación de ADN como para la secuenciación del fragmento de ADN amplificado simplifica el procedimiento de identificación de organismos.
A continuación, las secuencias obtenidas se comparan con secuencias de nucleótidos identificativas de distintos organismos, por ejemplo, con secuencias de organismos depositadas en bases de datos de nucleótidos y se identifica el organismo ensayado. En caso de que el organismo a identificar tuviera la secuencia amplificada contenida en dicha base de datos de nucleótidos, la identificación del organismo en cuestión seria inmediata. La comparación de las secuencias puede realizarse por cualquier método o soporte lógico convencional. En una realización particular, las secuencias obtenidas se pueden comparar con secuencias contenidas en la base de datos GenBank y/o EMBL utilizando el programa FASTA (véase el apartado relativo a los Materiales y Métodos) y/o BLAST. Si se desea, dichas secuencias pueden ser alineadas utilizando cualquier soporte lógico convencional, por ejemplo, el programa ClustalW.
Los productos de amplificación obtenidos mediante el procedimiento previamente descrito son específicos de cada organismo, por lo que resultan útiles para la identificación de los mismos. Por tanto, dichos productos de amplificación constituyen una herramienta que ofrece un gran potencial en estudios taxonómicos con un gran número de aislados, así como en la identificación rápida de organismos, tanto procariotas como eucariotas.
El procedimiento de la invención permite identificar aislados individuales a partir de fuentes clínicas y medioambientales (agua, alimentos, plantas, etc.) mediante la amplificación y secuenciación de la UARR. Esto es de considerable importancia en el campo de la diagnosis porque todos los microorganismos (eucarióticos y procarióticos) que son infecciosos para humanos, animales y plantas pueden ser identificados utilizando el mismo par de iniciadores y las mismas condiciones de PCR y secuenciación.
La identificación de organismos es preciso llevarla a cabo en numerosos sectores técnicos, por ejemplo, en Microbiología Clínica (humana y veterinaria) , Microbiología de Alimentos y Agua, Fitopatología, Ecología Microbiana, Taxonomía Microbiana, Microbiología Industrial, Microbiología Ambiental y, en general, en todas aquellas disciplinas que incluyan seguimiento y control de microorganismos, por lo que el procedimiento proporcionado por esta invención tiene aplicación, entre otros, en los sectores previamente mencionados.
Adicionalmente, un importante empleo potencial de la UARR podría ser la identificación y clasificación de fósiles microbianos. Debido a que las secuencias ribosómicas flanqueadas por secuencias altamente conservadas (UARR) se encuentran en todos los organismos estudiados (incluyendo arqueas, bacterias, algas, hongos, plantas, animales e incluso, seres humanos) es probable que dichas regiones también puedan ser amplificadas en organismos fósiles, permitiendo su clasificación en una primera etapa. Dicha UARR podría ser, consecuentemente, el punto de partida para obtener la secuencia completa del ADN ribosómico de dichos organismos.
También esta región puede ser utilizada en técnicas como el TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis) puesto que las diferencias en el contenido en G+C de la UARR de cada organismo es diferente. Esta técnica se basa en la identificación de los diferentes organismos de una población mediante la diferente movilidad de bandas del ADN ribosómico 16S en geles de poliacrilamida sometidos a un gradiente de temperatura siendo el principal condicionante de esta separación el diferente contenido en G+C de la región sometida a la técnica. La UARR tiene la ventaja de que al poder ser amplificada tanto en eucariotas como en procariotas, se pueden analizar poblaciones mezcladas de estos dos tipos de organismos que se hallan habitualmente juntos en los diferentes ecosistemas, mientras que la TGGE convencional sólo puede ser aplicada a los procariotas de una población, perdiéndose la información relativa a los eucariotas de la misma.
Asimismo, esta región permite la aplicación de la técnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) de un modo seguro y más fiable. Actualmente esta técnica se utiliza en la molécula entera del ADNr 16S y del ADNr 18S por separado y debido a que estos dos genes no están completamente secuenciados en todas las especies (faltan el extremo inicial, el final o los dos en muchas especies) es difícil establecer a qué nivel taxonómico establecen las diferencias. Como la UARR es una zona completamente secuenciada por encontrarse en el interior de los genes (tanto del 16S como del 18S) y bien definida se puede establecer claramente si un perfil es típico de una especie, de un género o incluso de una familia. Además se pueden comparar juntos procariotas y eucariotas, cosa que hasta ahora es imposible.
Por último, una de las aplicaciones más importantes es la detección de procariotas dentro de tejidos eucariotas debido a que en ambos se amplifica la UARR, pero en eucariotas esta región tiene unos 15 nucleótidos más que en eucariotas y se pueden separar perfectamente en geles de agarosa incluso al 1%, concentración que se utiliza para purificar las bandas de ADN desde geles antes de la secuenciación. Esta técnica tiene especial importancia en el diagnóstico de bacterias patógenas de vegetales y animales amplificando el ADN directamente a partir de las muestras de tejidos infectados.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la detección y/o clasificación de un organismo procariota o eucariota, que comprende poner en contacto ADN de dicho organismo con una mezcla de reacción para la amplificación enzimática de ADN, comprendiendo dicha mezcla de reacción un par de iniciadores constituido por los iniciadores U1F (SEQ. ID. NO: 1) y U1R (SEQ. ID. NO: 2) bajo condiciones en las que un fragmento de ADN amplificable presente en el ADN de dicho organismo es amplificado para formar un producto de amplificación y analizar el producto de amplificación en donde la presencia de una banda de 495 pb es indicativa de la presencia de un organismo procariota y la presencia de una banda de 508 pb es indicativa de la presencia de un organismo eucariota.
Antes de poner en contacto ADN del organismo a ensayar con la mezcla de reacción para la amplificación enzimática de ADN, se procede a extraer la totalidad o parte del ADN de dicho organismo. La extracción de ADN del organismo en cuestión se puede realizar mediante métodos convencionales, incluyendo aquéllos que no precisan una purificación del ADN extraído. El organismo a ensayar puede proceder de cualquier fuente, por ejemplo de un cultivo puro, de una fuente clínica, de una fuente medioambiental (agua, alimentos, plantas, animales, etc.) . La mezcla de reacción para la amplificación enzimática de ADN contiene los reactivos necesarios para la realización de dicha amplificación. En una realización particular, la amplificación enzimática de un fragmento de ADN se realiza mediante una reacción PCR, en cuyo caso, la mezcla de reacción para la amplificación enzimática de ADN comprende agua ultrapura, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) , un tampón adecuado para la reacción de amplificación enzimática, una ADN polimerasa termoestable, una sal magnésica, etc., junto con un par de iniciadores constituido por los iniciadores U1F (SEQ. ID. NO: 1) y U1R (SEQ. ID. NO: 2) que amplifican una región de ADNr amplificable presente en procariotas y eucariotas (UARR) . La amplificación enzimática de los fragmentos de ADN se puede realizar mediante el empleo de técnicas convencionales, por ejemplo, PCR, bajo condiciones en las que fragmentos de ADN amplificables presentes en el ADN del organismo a ensayar son amplificados.
Los productos de la amplificación enzimática se pueden separar y analizar por cualquier método convencional. En una realización particular, los productos de la amplificación enzimática se separan mediante electroforesis en agarosa, acrilamida o, en general, en cualquier matriz a la que pueda aplicarse una corriente eléctrica que permita la separación de moléculas, y se visualizan por métodos convencionales, por ejemplo, mediante luz ultravioleta (UV) tras tinción con bromuro de etidio.
Consecuentemente, la invención ofrece la posibilidad de detectar y clasificar organismos, eucariotas y procariotas, en un solo paso, utilizando una electroforesis directa de los productos de amplificación del ADN extraído por cualquier método. Por tanto, la invención proporciona un procedimiento preciso, seguro y fiable de detección y clasificación de organismos basado en la amplificación de una región de ADN ribosómico amplificable en procariotas y eucariotas (UARR) y en la electroforesis directa de los productos de dicha amplificación utilizando un par de iniciadores basados en secuencias de ADN ribosómico que amplifican dicha UARR.
La invención también proporciona un kit para la identificación de organismos, o para la detección y clasificación de organismos, mediante amplificación enzimática de ADN, que comprende un oligonucleótido iniciador seleccionado del grupo formado por los iniciadores U1F (SEC. ID. NO: 1) , U1R (SEC. ID. NO: 2) , y sus mezclas.
Los kits proporcionados por esta invención pueden presentarse en forma de estuche conteniendo, además de unos recipientes con uno o más de los iniciadores mencionados, unos recipientes con la totalidad o parte del resto de reactivos necesarios para la realización de la amplificación enzimática, por ejemplo, agua ultrapura, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) , un tampón adecuado para la reacción d e amplificación enzimática, una ADN polimerasa termoestable (por ejemplo, ADN polimerasa Taq) , una sal magnésica (por ejemplo, cloruro magnésico) , etc. Adicional y opcionalmente, los kits proporcionados por esta invención pueden incluir unos recipientes con ADN de distintas especies conocidas y bien caracterizadas para su empleo como controles positivos.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.
Ejemplos
Materiales y métodos Los Materiales y Métodos utilizados en los Ejemplos que se describen a continuación fueron los siguientes.
Cepas y números de acceso
Las cepas utilizadas en este estudio para su análisis filogenético se relacionan en la Tabla 1. En dicha Tabla, se han ordenado las especies de acuerdo con la clasificación actual de organismos y, además, se indica el número de acceso de cada cepa.
Las cepas utilizadas para la amplificación y secuenciación se indican en la leyenda de la Figura 1 [Escherichia coli ATCC11775T; Lactobacillus casei ATCC393T; Brevundimonas diminuta ATCC11568T; Clavibacter michiganensis DSM46364T; Streptomyces griseus ATCC23345T; Haloarcula hispanica ATCC33960T; Halobacterium salinarium ATCC33171T; Saccharomyces cerevisiae CBS1171T; y Trichoderma sp. IFO9061].
Extracción, amplificación, secuenciación y análisis de ADN
Las cepas fueron crecidas en medio YED (0, 5% de extracto de levadura y 0, 7% de glucosa) durante 24 horas a 28°C y 1.800 rpm. Las células se recogieron por centrifugación a temperatura ambiente en una centrifuga microspin a 5.000xg y se lavaron con 200 μl de una solución de 0, 1% de sarcosilo en agua [Rivas, R., Velázquez, E., Valverde, A., Mateos, P.F., Martínez-Molina, E. A two primers RAPD procedure (TP-RAPD) to obtain PCR fingerprints of bacterial species. Electrophoresis 22, 1086-1089. (2001) ]. El ADN fue extraído en 100 μl de NaOH 0, 05 M (libre de ADN) calentándolo durante 4 minutos a 100°C. A continuación, las muestras se pusieron en un baño de hielo, se añadieron 900 μl de agua a cada microtubo y se mezclaron perfectamente. Después de una nueva centrifugación a 4.000xg durante 3 minutos, se recogieron 700 μl de los sobrenadantes y se congelaron a -20°C.
El ADN bruto fue utilizado como molde para la amplificación mediante PCR de ADNr 16S. La PCR fue realizada utilizando un kit del reactivo AmpliTaq (Perkin-Elmer Biosystem, California, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante (MgCl2 1, 5 mM, 200 μM de cada dNTP y 2 Unidades de polimerasa Taq para un volumen final de 25 μl) . Los iniciadores utilizados para la amplificación fueron el iniciador directo U1F (SEQ, ID. NO: 1) [Escherichia coli, posiciones 909-932] y el inverso U1R (SEQ. ID. NO: 2) [Escherichia coli, posiciones 1.383-1.404] y se añadieron hasta una concentración final de 0, 2 μM.
Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: precalentamiento a 95°C durante 9 minutos; 35 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 1 minuto; anillamiento a 55°C durante 2 minutos; y elongación a 72°C durante 1 minutos; y una elongación final a 72°C durante 7 minutos. Los productos de la PCR se guardaron a 4°C.
Finalizada la PCR, el producto de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa 1, 5%, en tampón TBE (100 mM Tris, ácido bórico 83 mM, EDTA 1 mM, pH 8, 5) , a 6 V/cm y se tiñó con una solución que contenía 0, 5 μl/ml de bromuro de etidio. Como marcador de tamaño se utilizó el patrón VI (Boehringer-Roche, EEUU) . A cada muestra se le añadió una alícuota de 3 μl de solución de carga 6x (30% de glicerol, 0, 25% de xileno cianol y 0, 25% de azul de bromofenol) .
La banda se purificó a partir del gel por centrifugación en tubos Eppendorf (Millipore Co., Illinois, EEUU) durante 10 minutos a 5.000xg a temperatura ambiente.
La secuenciación se realizó en un secuenciador ABI377 (Applied Biosystems Inc.) utilizando un kit de secuenciación de ciclo BigDye terminator v3.0 siguiendo las instrucciones del fabricante. Los iniciadores utilizados fueron los mismos que los utilizados en la reacción de amplificación por PCR. Las secuencias obtenidas se compararon con secuencias contenidas en la base de datos GenBank utilizando el programa FASTA [Pearson, W.R. & Lipman, D.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448. (1988) ]. Las secuencias fueron alineadas utilizando el programa ClustalW [Thompson et al., citado supra]. Los árboles filognéticos se construyeron utilizando análisis de parsimonia. El análisis por cuenta propia se basó en 1.000 muestras. El programa PHYLIP [Felsenstein, J. PHYLIP (Phylogenetic inference package) version 3.5c. Seattle: University of Washington. (1985) ] fue utilizado para todos los análisis.
Ejemplo 1
Identificación de la región ribosómica universal amplificada (UARR)
Se realizó este estudio con el fin de intentar localizar la posible existencia de una secuencia de nucleótidos presente en ácidos nucleicos de organismos procariotas y eucariotas. Esta secuencia podría ser utilizada para identificar y clasificar cualquier organismo, tanto procariota como eucariota, por secuenciación de dicha región.
Para ello, se compararon las secuencias de ADNr 16S de varias especies procarióticas con las secuencias de ADNr 18S de varias especies eucarióticas utilizando el programa ClustalW [Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D.G. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acid Res. 24, 4876-4882. (1997) ] con el fin de obtener las zonas conservadas en ambos organismos. La comparación entre las secuencias completas reveló que las secuencias de ADNr 16S y ADNr 18S poseían dos regiones comunes localizadas entre las posiciones 909 y 1.404 en E. coli y entre las posiciones 1.134 y 1.642 en S. cerevisiae (véase la Figura 1) . Estas dos regiones permitieron el diseño de 2 iniciadores universales, identificados como U1F (SEQ. ID. NO: 1) y U1R (SEQ. ID. No: 2) que permiten amplificar por PCR una banda de 495 pares de bases (pb) en procariotas y una banda de 508 pb en eucariotas que podían ser secuenciadas utilizando los mismos iniciadores. La región amplificada de esa manera ha sido denominada Región Ribosómica Universal Amplificada
(UARR) en esta descripción.
Ejemplo 2
Generación de árboles filogenéticos basados en la UARR
Se realizó este estudio para evaluar la posibilidad de construir árboles filogenéticos utilizando la información contenida en dicha UARR. Las cepas utilizadas en este estudio para su análisis filogenético se relacionan en la Tabla 1, en donde se han ordenado las especies de acuerdo con la clasificación actual de organismos, indicándose, además, el número de acceso de cada cepa.
Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que la UARR es una región hipervariable que varia ampliamente entre los distintos phylum, tanto en eucariotas como en procariotas (véase la Figura 2) .
El análisis de parsimonia de secuencias de distintas especies procarióticas y eucarióticas procedentes de varios phyla permite la generación de árboles filogenéticos que son consistentes con los obtenidos utilizando las secuencias de ARNr 16S y ARNr 18S por separado [Prescott, R., Harley, J.P., Klein, D.A. in Microbiology (eds Prescott, R., Harley, J.P. & Klein, D.A.) 522- 564 (WCB MacGraw-Hill, Boston, 1999) ].
En el árbol filogenético mostrado en la Figura 2, las especies procedentes de distintos phyla de los dominios eucariota, arquea y bacteria están claramente separadas. Dentro de las ramas eucarióticas, las especies representativas de los phyla de plantas, hongos, animales y cromistas están localizadas en diferentes ramas. Los dos phyla de arqueas (crenarchaeota y eur y archaeota) están en dos ramas diferentes localizadas entre las ramas eucariótica y procariótica. Todos los phyla bacterianos también están localizados en diferentes ramas y su distribución está de acuerdo con la clasificación actual de este grupo de microorganismos. Por tanto, el análisis de la secuencia de la UARR reproduce el mismo tipo de árboles que cuando se utilizan separadamente las secuencias completas de los ARNr 16S y ARNr 18S.
No obstante, habitualmente, las especies de diferentes phyla presentan grandes diferencias, las cuales, en el caso de organismos pluricelulares, son evidentes incluso a nivel morfológico. Por ejemplo, las plantas son claramente divergentes de los animales y, por tanto, se pueden encontrar marcadas diferencias en sus secuencias de ARNr 18S, incluso, razonablemente, más diferencias que las esperadas entre los ARNr 16S de procariotas y los ARNr 18S de eucariotas. Por tanto, también puede esperarse que la UARR varíe entre individuos de diferentes dominos o phyla. Sin embargo, sorprendentemente, la UARR permite distinguir entre diferentes especies pertenecientes a diferentes phyla. Para comprobar ésto, se analizaron especies representativas de diferentes órdenes microbianos pertenecientes a phyla de diferentes dominios.
La Figura 2 muestra un árbol de parsimonia que contiene especies representativas de diferentes órdenes de microorganismos pertenecientes a phyla de archaea, bacteria y eukar y a. Debido a que este árbol es bastante complejo, se muestra un esquema con números en la Figura 3 que incluye todas las especies utilizadas en el estudio realizado y en donde se han marcado las zonas correspondientes a los órdenes eukar y a, archaea y bacteria. Los números correspondientes a cada especie han sido incluidos en la Tabla 1. Como puede apreciarse, el análisis de la UARR permite una clara separación de estos tres grupos de organismos. Las especies representativas de los diferentes órdenes están situadas en ramas diferentes del árbol, lo que indica que las especies que pertenecen a diferentes órdenes tienen grandes diferencias en sus secuencias de UARR.
Dentro de las arqueas, los géneros representativos de los órdenes incluidos en el phylum crenarchaeota están claramente separados de aquéllos incluidos en el phylum eur y archaeota.
Dentro de las bacterias, géneros representativos de los principales grupos (proteobacteria, cyanobacteria, actinobacteria, mycoplasma, etc.) están localizados en diferentes ramas y la disposición de los órdenes dentro del phylum bacteria es básicamente la misma que la indicada en Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.
Dentro de los organismos eucarióticos, los grupos obtenidos utilizando la UARR están sustancialmente de acuerdo con los mencionados en la literatura [Prescot et al., citado supra]. Por ejemplo, Naegleria, Tr y panosoma y Euglena tienen un origen monofilético. Dentro de los hongos, los basidiomicetos están en ramas distintas a las de los ascomicetos. Phytophtora, que pertenece a hongos acuáticos forma un grupo con las algas (incluyendo las algas pluricelulares tales como Sargassum o Corallina) , formando el grupo de Stramenopiles [Prescot et al., citado supra].
Todos los resultados obtenidos en procariotas y eucariotas son consistentes con los obtenidos utilizando las secuencias completas de las moléculas de ARNr 16S [Woese, C.R., citado supra] y ARNr 18S [James, S.A., Cai, J., Roberts, I.N., Collins, M.D. A phylogenetic analysis of the genus Saccharomyces based on 18S rRNA sequences: description of Saccharomyces kunashirensis sp. nov. and Saccharomyces martiniae sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 453-460. (1997) ] y con los perfiles de ARN de bajo peso molecular (ARN LMW) [Velázquez, E., Cruz-Sánchez, J.M., Mateos, P.F., Martínez-Molina, E. Analysis of stable low molecular weight RNA profiles of members of the family Rhizobiaceae. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1555-1559. (1998) ; Velázquez, E., Calvo, O., Cervantes, E., Mateos, P.F., Tamame, M., And Martínez-Molina, E. Staircase electrophoresis profiles of stable Low Molecular Weight RNA as yeast fingerprinting. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 917-923. (2000) ; Velázquez, E., Trujillo, M.E., Peix, A., Palomo, J.L., García-Benavides, P., Mateos, P.F., Ventosa, A., Martínez-Molina, E. Stable low molecular weight RNA analyzed by staircase electrophoresis, a molecular signature for both prokar y otic and eukar y otic microorganisms. Syst. Appl. Microbiol. 24, 486-499. (2001) ].
Los resultados obtenidos muestran que todas las especies de todos los diferentes órdenes de organismos, tanto procarióticos como eucarióticos, pueden ser diferenciadas en base a sus secuencias de UARR. Por tanto, estos resultados indican que las secuencias de las distintas UARR pueden ser muy útiles en identificación microbiana. Sin embargo, ya que la especie es la unidad taxonómica básica, una UARR sólo será útil en la identificación microbiana cuando dicha UARR sea diferente entre especies del mismo género.
Debido a la práctica imposibilidad de analizar todas las especies microbianas, se han elegido unos grupos bien estudiados cuyas secuencias ribosómicas ya han sido obtenidas. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 2, en donde se han incluido varios ejemplos de porcentajes de similaridad entre organismos de diferentes grupos filogenéticos (dominios, phyla, órdenes, familias, géneros y especies) .
TABLA 2 Porcentajes de similaridad entre especies pertenecientes a diferentes categorías filogenéticas Organismos | Similaridad |
Homo sapiens/Salmo trutta | 95, 5% |
Homo sapiens/Arabidopsis thaliana | 81, 0% |
Homo sapiens/Halobacterium salinarum | 59, 9% |
Homo sapiens/Escherichia coli | 58, 4% |
Halobacterium salinarum/Escherichia coli | 64, 4% |
Halobacterium salinarum/Thermoproteus tenax | 78, 7% |
Escherichia coli/Bacillus subtilis | 83, 0% |
Escherichia coli/Rhizobium leguminosarum | 84, 4% |
Methanobacterium formicium/Methanothermus fervidus | 91, 5% |
Methanobacterium formicium/Methanobrevibacter arboriphilus | 96, 2% |
Methanobacterium formicium/Methanobacterium palustre | 99, 0% |
TABLA 2 (continuación) Organismos | Similaridad |
Rhizobium leguminosarum/Bradyrhizobium japonicum | 89, 8% |
Rhizobium leguminosarum/Agrobacterium tumefaciens | 91, 3% |
Rhizobium leguminosarum/Rhizobium etli | 99, 0% |
Saccharomyces cerevisiae/Endomyces scopularum | 95, 5% |
Saccharomyces cerevisiae/Kluyveromyces wickerhami | 97, 9% |
Saccharomyces cerevisiae/Saccharomyces transvaalensis | 99, 4% |
Como puede apreciarse en dicha Tabla 2, el porcentaje de similaridad es más bajo en especies que pertenecen al mismo género que en especies que pertenecen a diferentes géneros, familias, órdenes, phyla y dominios. No obstante, las secuencias UARR permiten la diferenciación incluso entre especies del mismo género. A partir de dichos resultados, puede concluirse que la UARR es muy útil en identificación microbiana a nivel de especie.
Ejemplo 3
Identificación de organismos a nivel de especie utilizando UARR
Se realizó este ejemplo con el fin de comprobar si la UARR puede ser útil en la identificación microbiana a nivel de especie. Para ello, se utilizaron los iniciadores U1F (SEQ. ID. NO: 1) y U1R (SEQ. ID. NO: 2) para amplificar ADNr 16S (procariotas) y ADNr 18S (eucariotas) y secuenciar dichas moléculas en varias especies bacterianas representativas de Proteobacteria: Escherichia coli y Brevundimonas diminuta; Firmicutes: Lactobacillus casei y Actinobacteria: Clavibacter michiganensis y Streptomyces griseus. También se incluyeron dos especies de arqueas: Haloarcula hispánica y Halobacterium salinarium, y dos especies fúngicas: Saccharomyces cerevisiae y Trichoderma sp.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 1. Las bandas de UARR se visualizaron a un nivel superior que las de los procariotas. Por tanto, se puede conocer si un individuo es procariota o eucariota observando simplemente el tamaño de la UARR obtenida tras la amplificación enzimática (PCR) . Las secuencias de cada banda se compararon con otras secuencias incluidas en bases de datos públicas, permitiendo una correcta identificación de todas las cepas ensayadas. Por tanto, es posible identificar aislados individuales a partir de fuentes clínicas y medioambientales mediante la amplificación y secuenciación de la UARR.